يتم دعم الأشخاص ذوي الإعاقة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة الزمالة (CIHR) ومنحة CIHR لجيرالد M. كيدر في جامعة وسترن. ويود الكاتب أيضا أن نعترف Julang لى فى جامعة جويلف للمساعدة في تطوير بروتوكول المعروضة هنا.

1. وسائل الإعلام إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام 2-3 ساعة في وقت مبكر من استخدام ومكان مع قبعة خففت في ثقافة الخلية الحاضنة حيث التجربة ستجرى. وسائل الإعلام المستخدمة في هذا البروتوكول: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تنبع المتوسطة الخلية تتكون من DMEM/F12 تستكمل مع 1 × B27، 40 نانوغرام / مل bFGF و 20 نانوغرام / مل EGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجرثومية خلية متوسطة التمايز تتكون من M199 تستكمل مع 0.05 IU FSH، LH 0.03 IU، 3 ملغ / مل BSA، 5 ميكرولتر / مل ITS، 0.23 ملي البيروفات الصوديوم، 1 ملغ / مل فتوين، و1 نانوغرام / مل EGF. وسيط قاعدة تتألف من جميع الإضافات لكن إهمال FSH، LH وصندوق تعديل العولمة الأوروبي يمكن إعداد وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li></ol></li></ol> 2. تنبع تحضير خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا الجذعية من الجراء الوليد الماوس كما هو موضح سابقا 12. استخدام الخلايا الجذعية في مرور 2-4 في المختبر الجرثومية تمايز الخلايا. كفاءةويرتبط تشكيل مكتب المستشار القانوني مباشرة لنوعية الخلايا الجذعية البداية. فمن الأفضل لبدء التمايز في أقرب وقت يبدو السكان نظيفة وصحية والتي هي عموما في جميع أنحاء مرور 2. مزيد من زراعة الخلايا الجذعية الماضي 2 مرور يؤثر سلبا على كفاءة تشكيل مكتب المستشار القانوني (نتائج غير منشورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة قبل بدء التمايز ثقافة فرعية الخلايا الجذعية. إزالة كافة المجاميع علقت كروية الخليوي وسائل الإعلام أمضى من الطبق الثقافة، وذلك باستخدام ماصة المصلية، ومكان في أنبوب مل 15. من المهم أن جمع فقط المجاميع كروية مع وقف التنفيذ من الخلايا وليس الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الطبق التي يتم التفريق بشكل عفوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق.، تجاهل طاف، و resuspend في 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية الطازجة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. ماصة بلطف المجاميع أن تنأى جزئيا الخلايا. لا ماصة بقوة الخليةوسوف ق لأن هذا يقلل بقاء الخلية. غسل الخلايا فصلها جزئيا إلى 9.5 مل من الطازجة قبل حرارة متوسطة الخلايا الجذعية على التعلق 10 سم طبق خلية ثقافة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الخلايا إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 خلية ثقافة حاضنة لمدة 48 ساعة قبل بدء التمايز. </li></ol> 3. التمايز مكتب المستشار القانوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة المصلية إزالة الخلايا الجذعية من الطبق الثقافة ومكان في أنبوب مل 15، تترك وراءها أي خلايا المرفقة. بيليه الخلايا في 500 x ج و resuspend في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني العقيمة. ماصة قوية الخلايا باستخدام مجموعة واسعة تحمل 1،000 غيض ميكرولتر في كتل يست أكبر من 10-20 الخلايا. دوري إزالة كمية صغيرة من الخلايا، خلال التفكك، وتحقق تحت المجهر الضوء الأبيض لتأكيد الخلايا مجمعة في كتل من 10-20 الخلايا الفردية. أكثر من التفكك سيؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9.5 مل PBS لفصل الخلايا وإضافة 15 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية إلى عدادة الكريات لفرز الخلايا. بيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في تركيز 1.32X10 6 خلية / مل في متوسطة التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر لكل بئر في أسفل شقة 24 طبق التعليق أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق جيدا 24 إلى ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. إزالة 250 ميكرولتر المتوسطة من كل بئر ومكان في المقابل وصفت أنبوب 1.5 مل. إضافة 250 ميكرولتر المتوسطة تمايز جديدة إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي في المتوسط ​​قضى في 500 x ج لمدة 5 دقائق. وتجاهل طاف. Resuspend أي الخلايا مكعبات في 50 ميكرولتر المتوسطة تمايز الطازجة والعودة إلى ثقافة المناظرة جيدا على لوحة التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل 48 ساعة تغيير نصف المتوسط ​​ما يصل إلى يوم 12 من التمايز. </li></ol>

<ol>
	<li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth,+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles.">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li><li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration.">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li><li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse.">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li><li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation.">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li><li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li><li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro.">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li><li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells.">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27 (2012).</li><li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin.">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li><li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line.">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li><li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells.">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li><li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+porcine+multipotent+stem/stromal+cells+derived+from+skin,+adipose,+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells.">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li><li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin.">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339 (2011).</li><li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells.">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263 (2009).</li><li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice.">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

حتى الآن OLCs وظيفية لم يتم تطويرها باستخدام تماما في المختبر فحص. مؤخرا دراسة من قبل هاياشي وآخرون. كان قادرا على إنتاج نسل من PGC تشبه الخلايا شكلت في المختبر ونقل في الجسم الحي لمزيد من التطوير 14. بدءا من خلايا ES أو الخلايا المحفزة التي يسببها ?...

خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، وتحدث عملية تكوين الأمشاج من خلال سلسلة من المراحل بما في ذلك الخلايا الجرثومية البدائية (المؤتمر الشعبي) تشكيل، والهجرة، وأخيرا الاستعمار من التلال الغدد التناسلية. خلال هذا الوقت الخضوع بغتش الانتشار والتمايز في الأمشاج بصورة متزايدة أكثر نضجا 1. حقيقة أن بغتش ترحيل من قاعدة السقاء في المعى المؤخر الجنين وأخيرا على طول الجدار الظهري استعمار في نهاية المطاف التلال الغدد التناسلية يجعل من الصعب للغاية لدراسة 2. على الرغم من التقدم في هذا المجال، وقد أعاق دراسات تحاول فهم تشكيل المؤتمر الشعبي والتمايز بواسطة عددهم محدود، والموقع، وطبيعة المهاجرة 3،4. في السنوات الأخيرة وقد ثبت الخلايا الجذعية الجنينية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية في المختبر 5،6. وبالمثل، كما تم عرض العديد من الخلايا الجذعية الجسدية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية الفلبسبب زراعة في المختبر 7-11. تنبع مؤخرا الخلايا المعزولة من الجلد الماوس الجدد كانت متباينة في المختبر إلى خلايا تشبه الجرثومية والبويضات مرحلة مبكرة 12. أثناء تمايز مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية معربا عن Oct4 زيادة وشكلت هياكل تشبه المجمعات قزع-البويضة. البويضة تشبه الخلايا (OLCs) يمكن التقاطها من الثقافات ومقارنة البويضات الطبيعية. باستخدام هذه الثقافة OLCs طريقة قياس 40-45 ميكرون ويتم الحصول على التي تعبر عن علامات مشابهة لالبويضات مثل Gdf9b، فاسا، وDAZL. حتى الآن على OLCs الناتجة تظل غير قادر حتى تنضج أو يتم إخصابها 12. على الرغم من أن OLCs تزال عاجزة عن العمل البروتوكول المستخدم لتشكيل هذه OLCs قد لا تزال لديها فائدة باعتبارها مقايسة لدراسة تشكيل وتطوير في وقت سابق من الخلايا الجرثومية مرحلة ضمن مغلقة في نظام المختبر. المنشور الأصلي مناقشة تشكيل OLCs من ذلكالخلايا الجذعية ماتيك استخدام الجلد الخنزيري الجنين كمصدر الخلايا الجذعية 8. التوسع في هذه الدراسة عرضت الخلايا PGC مثل شكلت في وقت مبكر خلال التمايز الناجم عن أن تكون السلائف إلى OLCs وصريحة مثل علامات PGC كما OCT4، فاسا، ستيلا، C-KIT، وDAZL 13. تدعم هذه البيانات إمكانية الاستفادة من هذا النظام لدراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز في المختبر. سيظهر بروتوكول يستخدم لتشكيل OLCs من الجلد الماوس حديثي الولادة في هذه المقالة الفيديو. هذا البروتوكول يوفر في نموذج المختبر لدراسة تطور الخلايا الجرثومية التي يمكن أن توفر وسيلة لتوضيح العوامل الهامة لانتشارها وتمايز.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetuin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3385</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>925</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>144530</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

differentiation of newborn mouse skin derived stem cells into germ-like cells in vitro

دراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز تقليديا صعبة للغاية نظرا لانخفاض أعداد الخلايا ومواقعها عميقة داخل الأجنة النامية. توفر &quot;مغلقة&quot; في النظام القائم على المختبر يمكن أن لا تقدر بثمن لفهمنا لعملية تكوين الأمشاج. وقد تجلى تشكيل البويضة تشبه الخلايا (OLCs) من الخلايا الجذعية الجسدية، معزولة عن الجلد الماوس حديثي الولادة، ويمكن تصور في هذا البروتوكول الفيديو. وOLCs الناتجة عن مختلف علامات متسقة مع البويضات مثل Oct4، فاسا، Bmp15، وScp3. ومع ذلك، فإنها لا تزال غير قادر على الخضوع لنضوج أو الإخصاب بسبب الفشل في إتمام الانقسام الاختزالي. سوف يشكل هذا البروتوكول توفير نظام يمكن أن يكون مفيدا لدراسة تشكيل مرحلة مبكرة وتمايز الخلايا الجرثومية إلى أكثر الأمشاج نضجا. أثناء تمايز في وقت مبكر من عدد من الخلايا معربا عن Oct4 (الخلايا الجرثومية مثل المحتملة) تصل ~ 5٪، ولكن في الوقت الراهن جمعةormation الوقود النووي من OLCs لا يزال غير فعال نسبيا. البروتوكول هو نسبيا على التوالي إلى الأمام على الرغم من رعاية خاصة ينبغي اتخاذها لضمان السكان خلية البداية هو صحي وعلى ممر في وقت مبكر.

في البداية الخلايا نعلق على طبق أسفل الثقافة وانتشرت. في 42-72 ساعة في التمايز تشكيل علقت OCT4 الخلايا إيجابية الصغيرة وتتكاثر (الشكل 1A). بعد فترة وجيزة من التصور من هذه الخلايا الأغلبية سوف تختفي والخلايا المرفقة ستشكل المجاميع مستعمرة كثيفة على الجزء السفلي ال...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro at JoVE.com

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة البويضة.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

9.2K Views.  The University of Western Ontario. في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة ...

Video: Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...