ونحن نشكر لوكاس Jonatan له المساعدة التقنية مع تغذية الخلية والثقافة، سيرفي استابولاري de la اتحاد المصارف العربية لرعاية الحيوان ومارتن دومينيك لتسجيل الفيديو. حظي بدعم هذا العمل من الوزارة دي ايكونوميا y AGL2014 كومبيتيتيفيداد-52408-R ودي محافظة كاتالونيا SGR 2014-524. بعثة التحقق المشتركة مستفيدة زمالة PIF-اتحاد المصارف العربية.

استخدام الحيوانات في المقاطع أدناه قد تم وافقت عليها "لجنة الأخلاقيات" في الحيوان والإنسان البحث جامعة برشلونة المستقلة ود خلية &#39; الصيد الزراعة، راماديريا، وأنا Alimentació من محافظة كاتالونيا (بروتوكول #8741).
 1-تغذية الخلية المنظمة والتخزين ملاحظة: القلفة البشرية الليفية (الأكايمية-1) كانت مجمدة في السابق في 1 مل من محلول التجميد التي تتكون من 90% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( [دمس]) وتخزينها في النتروجين السائل حتى استخدام.
<ol><li>ذوبان الجليد قنينة مبردة من الأكايمية-1 (1 مل) من غمر القنينة في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة محتويات القنينة المبردة المذابة إلى دولبيكو المعالجون مسبقاً &#39; s النسر التعديل &#39; s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS لجعل 01:10 إضعاف.</li>
	<li>بذور الخلايا المخفف (10 مل) في قارورة T75 والثقافة لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	تغيير <li>في اليوم التالي، على المديين المتوسط والقضاء على البقايا [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
	الثقافة في هفس <li>وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة حتى يصل إلى الثقافة مرحلة المتلاقية. قد يستغرق هذا الأمر حوالي 7 إلى 10 أيام.</li>
	<li>لإعداد حل المنظمة، وتمييع mitomycin C في دميم وتستكمل مع 10% FBS بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا مع حل المنظمة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>إزالة حل المنظمة وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) للقضاء على فلول ميتوميسين ج.</li>
	<li>لفصل الخلايا المعطل، إضافة 1 مل من قبل حرارة يدتا التربسين الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب التأكد من أنها منفصلة (الهدف العاشر 10 مع 0.3 الفتحة العددية أو NA). إذا لم تكن كذلك، احتضان منهم لبضع دقائق إضافية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2. فحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر المقلوب.</li>
	<li>"الماصة؛" الحل مع ماصة باستور كي ننأى بكتل الخلية.</li>
	<li>تحييد الحل الانزيمية بإضافة 4 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS وريسوسبيند-</li>
	تأخذ قاسمة لتعليق خلية <li>وجعل إضعاف 1: 100 في حبس. لتحديد عدد الخلايا، تحميل 10 ميليلتر لتمييع في نويباور &#39; s الدائرة. عد الخلايا الموجودة في إحدى الساحات الكبيرة الدائرة بموجب مجهر مقلوب (الهدف x 20 مع نا 0.45).
	<ol><li>تكرار العد في مجموعة من أربعة مربعات كبيرة. حساب إجمالي عدد الخلايا (ن) كنون = متوسط عدد الخلايا معدود x الحجم الإجمالي x تمييع x 10 4-</li>
	</ol></li> <li>الطرد المركزي بقية العينة لمدة 5 دقائق في 200 x غ. تجاهل المادة طافية وبيليه مع تجميد الحل بتركيز 10 6 خلايا كل مل ريسوسبيند.</li>
	<li>قاسمة التعليق في قنينات المبردة مع 10 6 خلايا (1 مل) كل. ضع قارورة المبردة في حاوية تجميد وتجميد في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي، تخزين القنينات المبردة في النتروجين السائل-</li>
</ol> 2. وحدة تغذية "الخلية والثقافة" <ol><li>واحد إلى أربعة أيام قبل البدء في عملية الاشتقاق، إبطال ذوبان قنينة مبردة التي تتضمن 1 × 10 6 خلايا الأكايمية-1 في حمام مائي في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>جعل إضعاف 1:6 1-الأكايمية المذابة في تسخينها قبل دميم وتستكمل مع 10% FBS والحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ملء كل بئر من صفيحة 4-جيدا مع 500 ميليلتر من قبل حرارة 0.2 ٪ الجيلاتين من جلد الخنزير والاحتفاظ باللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10</li>
	إزالة 500 ميليلتر من الجيلاتين من الآبار <li>وإضافة 500 ميليلتر لتمييع هفس. روك بلطف لوحة لضمان توزيع هفس في الجزء السفلي من الآبار بصورة موحدة. تجنب حركات دائرية، خلاف ذلك سوف تركز الخلايا في مركز البئر.</li>
	<li>احتضان لوحة مالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحصول على المونولاير هفس المعطل في كل بئر-</li>
	مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب (الهدف العاشر 10 مع نا 0.3) <li>في اليوم التالي، والتحقق من أنها تعلق والبلوتينيوم الموزعة. تغيير وسيلة للقضاء على فلول [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 500 ميليلتر من دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
</ol> 3. جمع الجنين والثقافة <ol><li>أربعة أيام قبل جمع الأجنة، وإدارة 5 وحدات دولية من الفرس الحامل &#39; s المصل تروج عن طريق الحقن داخل للفئران الإناث 6-12 أسبوع القديمة. 
	ملاحظة: لقد استخدمنا الإناث من 129S2 أو من سلالات B6CFAF1، على الرغم من أن يمكن استخدام الإناث من سلالات الماوس الأخرى. ومع ذلك، عند العمل مع الإناث من سلالات غير المتساهلة (مثلاً CBA)، المتوسطة ينبغي أن تستكمل مع 2 طاء كما هو مذكور في الخطوة 4، 2-</li>
	<li>بعد 48 ساعة، إدارة 5 وحدات دولية من الإنسان المشيمية تروج عن طريق الحقن داخل، وتتزاوج الإناث مع الذكور، على الأقل 8 أسابيع من العمر، بنسبة 1:1. فصل الإناث عن الذكور في اليوم التالي-</li>
	إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع عدة قطرات ميليلتر 40 كسوماج المتوسطة وتستكمل مع 4 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) <li>اليوم قبل جمع الأجنة، وملء اللوحة مع الزيوت المعدنية تغطية كامل القطرات. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حجته المتوسطة-</li>
	<li>لإعداد الماصات التلاعب بالأجنة، حرارة الجزء أرق من الزجاج طويلة ذات الرؤوس ماصة باستور استخدام موقد بنسن. بمجرد لينة، وسحبها من اللهب وسحب طرفي عن بعضها البعض. كسرها إلى الطول المطلوب. يجب أن يكون القطر الداخلي في تلميح 100-150 ميكرومتر.</li>
	<li>Euthanize الفئران الإناث بخلع عنق الرحم ح 45-48 وظيفة-كويتوم (p.c.).</li>
	<li>تشريح الفئران لفضح تجويف البطن بقطع الجلد مع منحنى سلس مقص حاد والصفاق مع مقص حاد مستقيم. انتزاع الرحم واحد مع الملقط وقطع قناة استخدام مقص حاد مستقيم، ووضعه في كزب مخزنة حبيس المتوسطة (هكزب) 13 في 37 درجة جيم تكرار العملية لإزالة في قناة أخرى.</li>
	<li>دافق أوفيدوكتس مع حقنه 1 مل محملة هكزب الذي عقد في مكان بالملقط الساعاتي لجمع الأجنة 2-خلية- 
	ملاحظة: إعداد تأخذ إبرة التنظيف إبرة حقن 30 غ، قطع النهاية، والبرية إلى تلميح صراحة على حجر جلخ.</li>
	<li>باستخدام أجهزة ماصة الفم، التقاط الأجنة وغسلها في هكزب والثقافة لهم في الطبق الثقافة الجنين المجهز سابقا على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حتى مرحلة الكيسة. ما يصل إلى 50 الأجنة يمكن أن يكون مثقف في كل قطره 40 ميليلتر. رصد التنمية الجنين كل 24 ساعة تحت ستيريوميكروسكوبي. 
	ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأجنة يمكن جمعها في مرحلة الكيسة لتقصير الثقافة الجنين في المختبر. وفي هذه الحالة، euthanize الإناث في يوم p.c. 3.5-4.5، تشريح الرحم. وتدفق عليه مع هكزب-</li>
</ol> 4. اشتقاق الخلايا الجذعية <ol><li><ol><li>من إعداد لوحات الاشتقاق في اليوم من زرع الجنين، إعداد المتوسطة الاشتقاق بتكميل المتوسطة دميم مع 100 ميكرومتر 2-β ميركابتوثانول، 1 x "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم ، 20% لاستبدال المصل، و 10 3 U/mL ليف.</li>
		<li>إذا رغبت في ذلك، أيضا إضافة 1 ميكرومتر من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 و 3 ميكرومتر مثبطات GSK3 CHIR99021 للحصول على متوسط 2 طاء-</li>
		<li>تأخذ لوحة 4-جيدا مع أحادي الطبقة هفس المعطل (الخطوة 2، 6) من حاضنة. إزالة المتوسطة وإضافة 800 ميليلتر من الاشتقاق قبل حرارة متوسطة لكل بئر. العودة اللوحة للحاضنة.</li>
	</ol></li> <li>إزالة Zona pellucida والجنين البذر <ol><li>إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع قطرات ثلاث 30 ميليلتر من تيرودي الحمضية &#39; s الحل 14 وقطرات ثلاث 30 ميليلتر من المتوسطة الاشتقاق. تغطية القطرات مع الزيوت المعدنية وإبقاء الطبق على 37 درجة مئوية.</li>
		<li>أخذ الطبق الثقافة الجنين من الحاضنة. واحداً تلو الآخر، نقل بلاستوسيستس من قطرات الثقافة إلى تيرودي حمضية &#39; s حل انخفاض استخدام ماصة تلاعب الأجنة. إذا كان ذلك ممكناً، حدد فقط blastocysts الموسعة لبدء عملية الاشتقاق.</li>
		<li>مراقبة الهضم zona pellucida تحت ستيريوميكروسكوبي. حالما يختفي بيلوسيدا زونا، نقل الكيسة إلى انخفاض متوسط اشتقاق من أجل تغسل تيرودي الحمضية &#39; حل s-</li>
		<li>تأخذ لوحة الاشتقاق 4-جيدا من حاضنة والبذور واحدة خالية من زونا الكيسة على وحدة التغذية خلايا في كل بئر-</li>
		<li>عودة لوحة الاشتقاق 4-جيدا للحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	</ol></li> <li>تغير نمو الخلايا الجذعية الرصد والمتوسطة <ol><li>رصد ثقافات كل 24 ساعة تحت مجهر مقلوب (الهدف X 20 مع نا 0.45). من المهم ملاحظة ما إذا كانت هناك علامات على تمايز الخلايا الجذعية، مثل تورم الخلايا الانكسار المحيطة بثمرة أو حتى دفع التغذية الخلايا جانبا.</li>
		<li>كل يوم، تغيير وسيلة للثقافة. تأخذ اللوحة 4-جيدا من الحاضنة وإزالة المتوسطة من كل بئر وإضافة 800 ميليلتر من المتوسطة اشتقاق المعالجون قبل استكمالها مع ليف و 2 طاء، إذا ما استخدمت. الحفاظ على الثقافة حتى هي لاحظت أووتجرووثس (6-8 أيام)-</li>
	</ol></li></ol> 5. زراعة الخلايا الجذعية وصيانة <ol><li>تحضير يشار تشبه مقابض والماصات التلاعب بالخلايا الجذعية. اتبع الخطوة 3.4 بإعداد الماصات التلاعب بالخلايا الجذعية مع قطر داخلي في غيض من 250-300 ميكرون. استخدم الجزء الآخر من ماصة باستور سحبت لإعداد المؤشر مثل يشار. الحرارة والشكل حتى الحصول على هوك-</li>
	<li>لوحة الثقافة 4-جيدا خارج الحاضنة وتحديد موقع ثمرة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدم المقبض لدفع بعيداً الخلايا المتمايزة ومغذيات التي تحيط ثمرة. 
	ملاحظة: لتجنب التفريق في نهاية المطاف من ثمرة، من المهم لإزالة جميع الخلايا المتمايزة من الحافة من ثمرة.</li>
	<li>نضح ثمرة مع ماصة تلاعب خلايا الجذعية، ووضعه في طبق جديد في قطره 50 ميليلتر التربسين-يدتا.</li>
	<li>استخدام مشرط لقطع ثمرة في عدة أجزاء من أجل تفصيل ذلك ميكانيكيا وانزيماتيكالي على السواء-</li>
	<li>على الفور، نقل أجزاء ثمرة إلى قطره جديدة من الاشتقاق المتوسطة لتحييد عمل التربسين.</li>
	<li>نقل أجزاء ثمرة لصفيحة 4 آبار جديدة مع أحادي الطبقة مغذيات. نقل الأجزاء يصل إلى 10 في كل بئر والثقافة لهم مع اشتقاق المتوسطة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>الحفاظ على الثقافات الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل النظر في السطر مسك المنشأة. تغيير المتوسط كل يوم وثقافة فرعية أخرى منها مرة واحدة في أسبوع-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li><li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer.">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+and+techniques+for+mouse+embryonic+stem+cell+derivation+and+culture.">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells.">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li><li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+(ES)+cell+lines.">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li><li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على الرغم من أن مسك خط الاشتقاق إجراء معروفة تستخدم بشكل روتيني في العديد من المختبرات، كفاءتها ليس دائماً مرتفعا كما هو متوقع بسبب العوامل المتعددة التي يمكن أن تخل بصيانة بلوريبوتينسي. في هذه المادة ونحن إظهار، خطوة بخطوة، كيفية إنشاء خطوط مسك بكفاءة عالية باستخدام بروتوكول بسيط ويمكن ...

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هي pluripotent الخلايا المشتقة من الأجنة بريمبلانتيشن، التي تحتفظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت ظروف محددة1. وبناء على هذه الخصائص، أصبحت ESC أداة مفيدة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والأنسجة الدراسات الهندسية2.
استمدت ESC للمرة الأولى من الأجنة الماوس preimplantation، تنشأ خطوط ESC (مسك) الماوس مع النجاح منخفضة3،4. لسنوات، ظلت كفاءة اشتقاق منخفضة نظراً لصعوبة الحفاظ على بلوريبوتينسي في المختبر. وإلى جانب ذلك وجود تغذية الخلايا5، مما يحسن كفاءة الاشتقاق، وتعزيز مرفق مستعمرة والاستقرار كاريوتيبيك6، عدة تعديلات للبروتوكول يؤدي إلى حدوث تحسن في الصيانة بلوريبوتينسي. كانت أهم الإضافة من اللوكيميا المثبطة عامل (LIF) إلى مسك الثقافة المتوسطة7،8، استخدام الأجنة من الخلفية الدلالية 129S29 وثقافة مسك مع المتوسطة وتستكمل مع تعريف المصل، خالية من عوامل التمايز المحتمل10. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الأدلة الدامغة أن إضافة خليط من اثنين المغيرون جزيء صغير من مسارات الإشارات إلى مسك الثقافة المتوسطة (المعروفة باسم 2i) أفضل وسيلة للحفاظ على بلوريبوتينسي. 2 طاء كوكتيل يتكون من مجموعة المانع مجاهدي خلق PD0325901، مما يقلل من إشارات التمايز عن طريق تثبيط بروتين mitogen تنشيط المسار كيناز (MAPK)، ومثبطات GSK3β CHIR99021، مما يعزز بقاء الخلية في منخفض الكثافة بتنشيط مسار Wnt11.
في هذه المادة، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لكفاءة استخلاص خطوط ©جميع من blastocysts الماوس. ونحن اتباع الإجراءات القياسية، استزراع الأجنة من سلالات متساهلة في تغذية الخلايا في اشتقاق المتوسطة وتستكمل مع ليف و استبدال مصل12. يمكن اشتقاق عقب هذا البروتوكول، ومسك خطوط مع الكفاءات المماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في المتوسط 2 طاء. وعلى الرغم من ذلك، يمكن إضافة 2 طاء لتجنب المشاكل المحتملة مع الحفاظ على بلوريبوتينسي أو عند العمل مع سلالات غير متساهلة.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode&#039;s solution&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&amp;ordm;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&amp;ordm;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &amp;alpha;SMA and AFP mouse antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&amp;ordm;C. Aliquot and store at -20&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>304000</td><td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;10828-028</td><td>Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&amp;ordm;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&amp;ordm;C and 5% CO2 a day prior to use.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo tested. Photosensitive.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&amp;ordm;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &amp;beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&#039;s serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td></tr></tbody></table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الماوس هو العملية التي pluripotent هي أنشأت خطوط الخلايا من الأجنة preimplantation. هذه الخطوط الاحتفاظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت شروط معينة. بسبب هذه الخصائص، يتم مسك أداة مفيدة في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، ودراسات هندسة الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول بسيط للحصول على خطوط مسك مع اشتقاق عالية الكفاءة (60-80 في المائة) باستزراع blastocysts من سلالات الماوس متساهلة في تغذية الخلايا في المعرفة المتوسطة وتستكمل مع العوامل المثبطة اللوكيميا. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول كفاءة استخلاص خطوط ©جميع من سلالات الماوس غير متساهلة، بإضافة بسيطة من خليط من اثنين مثبطات جزيء صغير إلى متوسط الاشتقاق (متوسط 2 طاء). وترد الإجراءات المفصلة في إعداد والثقافة لتغذية الخلايا، جمع وثقافة الأجنة الماوس، واشتقاق والثقافة من خطوط ©جميع. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تنفذ في أي مختبر خبرة الثقافة الأساسية خلايا الثدييات.

في أعقاب هذا البروتوكول، ما يزيد على 95% تكوين ثمرة يجب أن يتحقق بعد الأسبوع الأول من الثقافة (الشكل 1A). إنشاء خطوط ©جميع بعد ستة ممرات متغيراً بين replicates التجريبي، مع نجاح متوسط من 60-80%. إضافة 2 طاء لا يحسن إلى حد كبير النتائج عند العمل مع سلالات الماوس المتساه...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biology

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...