نشكر H. فليمينغ لقراءة نقدية وتحرير للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل Misrock ما بعد الدكتوراه زمالة (TD) وNDSEG زمالة دراسات عليا (AP). البنك المركزي السويسري هو محقق HHMI.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوط الخلايا مرور باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. في هذه التجربة، كنا OVCAR-8 خلايا (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD). تنمو الخلايا إلى confluency الهدف من 80-100٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 5 مل التربسين لمدة 5 دقائق، ثم يضاف 5 مل RPMI المتوسطة + FBS لإبطال نشاط التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد والاعتماد على عدادة الكريات. resuspend في الفينول DMEM الحمراء الخالية في تركيز الهدف من 5 × 10 7 خلية / مل، أو حوالي 200 ميكرولتر في القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15٪ انخفاض النمو عامل Matrigel دينار بحريني (العلوم البيولوجية) والحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الزرع. </li></ol> 2. زرع الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 4 أسبوع أنثى NCR / نو الفئران القديمة باستخدام 3٪ isoflurane ووانتظر ما يقرب من 5 دقائق لضمان التخدير العميق. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا (100 ميكرولتر لكل ورم) في 1 مل حقنة وإرفاق 27 1/ 2 إبرة قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل من موقعين حقن الجناح الخلفيتين الثنائية، ورفع الجلد بلطف مع ملقط لجعل خيمة وحقن الخلايا في القاعدة. والحرص على عدم التوغل عميقا جدا، وإنتاج الدم. استخدام ملاقط لإزالة بلطف حقنة دون ترشيش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد نمو الورم يوميا لمدة 10 - 20 يوما حتى يبلغ قطرها ورم من 2 - 4 مم وصلت. </li></ol> 3. البكتيريا التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا في 3 مل LB سائل الإعلام + الأمبيسلين من -80 الأسهم الفريزر C أو لوحة مبردة. في هذه التجربة، كنا S. تيفوميوريم سلالة ELH430 (SL1344 PhoPQ-أروى-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصباح، تمييع 1:100 الثقافة في LB تصفيتها وتنمو لOD600 0،4-0،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار وغسل 3 مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و resuspend في OD600 النهائي من 0.1 (حوالي 1 × 10 7 خلية / مل). </li></ol> 4. البكتيريا حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان علىموقف د على جانبها مع الذيل لافتا نحو يدك المهيمنة. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمدد الوريد الذيل باستخدام الماء الدافئ أو مصباح الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل بكتيريا (100 ميكرولتر في الماوس) في 1 مل حقنة وثني غيض فقط أقل من 90 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة طرف الحقنة في الوريد مع الذيل، وتخترق على عمق ضحل (ينبغي أن يشعر أي مقاومة)، وحقن البكتيريا. مراقبة النزوح تدفق الدم لحقن ناجحة. </li></ol> 5. الماوس التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات في غرفة تحريض ثم وضع كل الماوس على منصة التصوير. استخدام مرهم طبيب بيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. الحفاظ على تحديد المواقع بدقة لضمان النتائج الكمية بين نقاط الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات الصورة باستخدام الطيف نظام التصوير IVIS (الفرجار علوم الحياة). إذا التصوير أكثر من 1 الحيوان، مكان الحواجز ضوء بينهما لمنع انتقال illumination. ينبغي تصويرها الحيوانات أولا على الجانب البطني للتأكد توطين البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات صورة ظهريا باستخدام IVIS كل 2 ساعة لمدة التجربة (36 ساعة). توليد دورة الوقت لROI معين. </li></ol> 6. قياس Biodistribution البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوانات باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 ومكان على ظهر على حفاضات ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الحيوان لفضح اثنين هند الجناح الأورام تحت الجلد. قطع أنسجة الجلد المحيطة لفصل وإزالة الأورام. عقد ورم مع ملاقط، وإزالة الجلد باستخدام حركة مقص عكس. عندما تم فصل الغالبية العظمى من الجلد، وإزالة الورم بالكامل باستخدام الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجهزة في أنابيب microcentrifuge سبق وزنه. منذ كتلة هذه الأنابيب يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ من المهم مسبقا وزن لهم من أجل تحقيق النتائج الكمية. </li></ol> 7. قياس Biodistribution البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل مرة نقطة والمكوس وتزن الأورام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر PBS + 15٪ الجلسرين والتجانس باستخدام مناديل-Tearor (BioSpec). شطف الخالط 3 مرات مع الإيثانول بين العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد التخفيفات التسلسلي ولوحة للبكتيريا العد مستعمرة. لوحة التخفيفات متعددة على استخدام لوحة واحدة لوحات ما قبل مقطوع. </li></ol>

<ol>
	<li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+phoP/phoQ-deleted,+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers.">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li><li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha.">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals.">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li><li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli.">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li><li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector.">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li><li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens.">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li><li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li><li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma.">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li><li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li><li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+perfect+(bacterial)+cancer+therapy.">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi.">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs.">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li><li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer.">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice.">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks.">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria.">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li><li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+gene+circuits.">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+'biopixels'.">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li><li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+delivery+of+siRNAs:+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy.">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li><li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+amplified+protein+expression+therapy:+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector.">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS.">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511 (2013).</li><li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium.">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria.">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals.">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

باستخدام هذا الإجراء، ونحن قادرون على توليد الدورات الوقت لنمو وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا استعمار الأورام. في حين أن هذه القياسات تتم بصورة روتينية في المختبر في الثقافة دفعي أو الأجهزة على microfluidics، فهي لأداء في الجسم الحي أكثر صعوبة بكثير. <p c...

وقد أحرز تقدم في البيولوجيا التركيبية بسرعة على مدى العقد الماضي، ويتم وضع الآن أن تؤثر المشاكل الهامة في مجال الطاقة والصحة. ومع ذلك، فقد تباطأ التوسع في الساحة السريرية من قبل مخاوف تتعلق بالسلامة وغياب وضع معايير لتصميم الدوائر الجينية في الجسم الحي. سوف تسريع التطبيقات الطبية عالية تأثير تتطلب استخدام أساليب تلك الواجهة مباشرة مع البنية التحتية الطبية، والدوائر الجينية التي تعمل خارج من إعداد مختبر للرقابة، والمضيفين الميكروبية آمنة وسريريا المقبولة. وقد تم التحقيق في عدد من سلالات لعلاج السرطان نظرا لقدرتها على النمو بشكل تفضيلي في الأورام. وقد شملت هذه C. النوفية، كولاي، V. cholorae، B. الطويل ل، و س. تيفوميوريم 3-8. S. وقد ولدت تيفوميوريم أهمية خاصة لأنها أظهرت سلامة والتسامح في عدد من التجارب السريرية البشرية 9-12. هذه البكتريا<html> عرضت في البداية لخلق تأثيرات مضادة للورم من خلال تحفيز الجهاز المناعي المضيف ونضوب المغذيات اللازمة لعملية التمثيل الغذائي الخلايا السرطانية. تم ادراج إنتاج البضائع العلاجية في وقت لاحق من خلال التعديلات الجينية. في حين أن هذه الدراسات تمثل تقدما هاما في استخدام البكتيريا لعلاجات الأورام، وقد اعتمدت غالبية الجهود القائمة على التعبير عن المستوى الذي ينتج عادة في إيصال جرعات عالية، والآثار بعيدا عن الهدف، وتطوير المقاومة المضيفة 13-16 . الآن، قد البيولوجيا التركيبية إضافة إنتاج البضائع القابلة للبرمجة من خلال الاستفادة من الدوائر الجينية حسابيا التصميم التي يمكن أن تؤدي الاستشعار المتقدمة والتسليم 17-20. ويمكن تصميم هذه الدوائر لتكون بمثابة أنظمة التسليم التي تستشعر المحفزات ورم محددة والتنظيم الذاتي إنتاج البضائع حسب الضرورة. ومع ذلك، ودراسة وظيفة من هذه الدوائر في الجسم الحي وهكذا تم حتى الآن تحديا. ve_content &quot;&gt; منذ البلازميدات هي إطار مشترك للدوائر الاصطناعية، ونحن تصف طريقة لوصف ديناميات التعبير الجيني القائم على البلازميد في الجسم الحي باستخدام نموذج الفأر. هذه الأساليب الاستفادة من الوقت الفاصل بين التصوير التلألؤ والقياس الكمي للbiodistribution. معا، توفر هذه النهج إطارا لدراسة الشبكات القائمة على البلازميد في الجسم الحي بالنسبة إلى التطبيقات السريرية.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3/10 cc Insulin Syringe</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PrecisionGlide Needle </td>
 <td>BD Biosciences </td>
 <td>301629</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI Medium 1640 (1X), 
 liquid, with L-glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11875-119 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A0166-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB Agar Broth</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L2897</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luria-Bertani broth</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>244610</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted s. typhimurium bacteria

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن S. المستعمرات البكتيرية تيفوميوريم المتزايد داخل الأورام. نحن ولدت الأورام طعم أجنبي نموذج في الفئران عن طريق الحقن تحت الجلد من المبيض خط الخلايا السرطانية البشرية، OVCAR-8 (NCI DCTD مستودع ورم، فريدريك، MD). نحن تحولت سلالات موهنة من S. البكتيريا التيفية الفأرية (ELH430: SL1344 phoPQ-1) مع وسيفيراز أعرب جوهري (luxCDABE) البلازميد عن التصور 2. هذه السلالات استعمار تحديدا أورام في حين تبقى أساسا غير خبيثة إلى الماوس 1. مرة واحدة تم تأسيسها الأورام قابلة للقياس، تم حقن البكتيريا عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل مع اختلاف الجرعة. الورم المترجمة، تم رصد بكتيريا التعبير الجيني في الوقت الحقيقي على مدار 60 ساعة باستخدامفي الجسم الحي نظام التصوير (IVIS). في كل نقطة زمنية، ويستأصل الأورام، المتجانس، ومطلي ل quantitate المستعمرات البكتيرية للارتباط مع بيانات التعبير الجيني. معا، هذه البيانات تعطي مقياس كمي للنمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني من البكتيريا المتزايد داخل الأورام.

باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون على توليد بيانات عن النمو في الجسم الحي، وديناميات التعبير الجيني للورم البكتيريا المستهدفة. ويلخص سير العمل الكلي في الشكل 1. في المرحلة الأولى، ونحن حقن البكتيريا (الخضراء) وص...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria at JoVE.com

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن<em&gt; S. تيفوميوريم</em&gt; المستعمرات البكتيرية المتزايد داخل الأورام. يغطي هذا الفيديو إعداد ورم الخلايا وزرع، وإعداد البكتيريا وحقن، والتصوير كله والحيوان التلألؤ، والاستئصال الورم، والبكتيرية العد مستعمرة.

قياس النمو وحيوية التعبير الجيني للورم استهداف<em&gt; S. تيفوميوريم</em&gt; البكتيريا

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

12.0K Views.  Massachusetts Institute of Technology. الهدف من هذه التجارب هو لتوليد البيانات وقتا بالطبع الكمية على نمو وديناميات التعبير الجيني من الموهن S. تيفوميوريم المستعمرات البكتيرية المتزايد داخل الأورام. يغطي هذا الفيديو إعداد ورم الخلايا وزرع، وإعداد البكتيريا وحقن، والتصوير كله والحيوان التل?...

Video: Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

NF-&amp;#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Infected Tissue Culture Cells

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

NF-κB-الاعتماد علي التنشيط والتقدير الكمي للتعبير الجيني في خلايا الانسجه المصابة السالمونيلا الثقافة

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...