هذا البروتوكول مفيد لتحديد التغييرات في NF-كابا-B التنشيط في الخلايا التي تعبر عن مراسل NF-kappa-B لوسيفراسي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لشاشة عالية الإنتاجية من العوامل أو الظروف التي تؤدي إلى تغييرات في NF-kappa-B التنشيط. NF-kappa-B هو عامل النسخ لمجموعة واسعة من العمليات الخلوية.
وظيفة معروفة من NF-كابا-B هو في تحريض الاستجابات الالتهابية عن طريق تحفيز التعبير عن السيتوكينات المختلفة و chemokines. مختبرنا مهتم بشكل خاص في تحريض NF-كابا-B الناجمة عن مسببات الأمراض السالمونيلا typhimurium. هنا، نستخدم خط الخلية هيلا التي هي مُصابة بشكل ثابت مع مراسل NF-kappa-B luciferase plasmid.
يمكن استخدام بكتيريا أخرى ، أو حتى الفيروسات أو المركبات الكيميائية ، في هذا الخط الخلية لدراسة تفعيل NF -kappa-B. خطوط الخلية الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا إذا كنت تستطيع أن أعرض مثل هذا NF- كابا-B luciferase مراسل plasmid في هذا الخط الخلية. شخص ما القيام بذلك للمرة الأولى قد يكون لديك قضايا استخدام تقنية معقمة بشكل صحيح التي هي مطلوبة لثقافة الخلية والعمل البكتيري.
قبل يوم واحد من تحفيز الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام نمو خلايا هيلا 57A التي نمت إلى حوالي 75٪التقاء. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 0.05٪ تبسين EDTA. استبدال مع ملليلتر آخر من التربسين EDTA ونقل القارورة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد أن تم فصل الخلايا من القارورة، وتعليقها في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام النمو. الجمع بين 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من الأزرق Trypan، ماصة صعودا وهبوطا لخلط، ونقل 10 ميكرولترات إلى شريحة عداد الخلية. عد الخلايا في التعليق باستخدام عداد الخلايا، واستخدام وسائل الإعلام نمو لتمييع الخلايا إلى تركيز النهائي من 2.5 مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل ملليلتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
نقل 250 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 48-جيدا. غطاء دوري وتسليم أنبوب مخروطي لضمان تعليق الخلية متجانسة. اضغط على اللوحة بلطف على الجانب لضمان أن الخلايا توزع بشكل موحد في الآبار.
نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ والسماح للخلايا لإرفاق والنمو بين عشية وضحاها. الأسهم المجمدة المتتالية من السالمونيلا على لوحات LB agar لإنتاج مستعمرات واحدة. نقل لوحات إلى حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية والسماح للنمو بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، إضافة ثلاثة ملليلتر من LB إلى أنابيب الثقافة البكتيرية العقيمة، وإضافة المضادات الحيوية المناسبة لوسائل الإعلام. باستخدام حلقة تطعيم عقيمة، اختر مستعمرة واحدة من الثقافات البكتيرية المتتالية والمس الحلقة إلى وسائط LB. اِقم الأنابيب بعد تلقيحها وتخلص من الحلقة.
ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة تبلغ 37 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة ، ثم اسمح للبكتيريا بالنمو بين عشية وضحاها. في الصباح، استرداد الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها من الحاضنة. إعداد أنابيب لزراعة فرعية عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من LB الطازجة والمضادات الحيوية.
نقل 30 ميكرولترات من ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها إلى وسائل الإعلام الطازجة. ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة لمدة ثلاث ساعات ، قم بنقل ملليلتر واحد من مرق LB العقيم إلى cuvette بلاستيكي ليكون فارغًا.
نقل 900 ميكرولترات من LB إلى cuvettes أخرى لاستخدامها في تحليل العينة. نقل 100 ميكرولترات من الثقافة الفرعية البكتيرية في cuvette تحتوي على 900 ميكرولتر من LB، وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط. كرر هذا لكل تعليق بكتيري.
قم بتشغيل مقياس الطيف لقياس الكثافة البصرية للثقافات البكتيرية عند طول موجة 600 نانومتر. ضع الفراغ في مقياس الطيف. يحيط علما التوجه.
أغلق الغطاء واضغط على الزر الفارغ على مقياس الطيف للحصول على امتصاص الخلفية. استبدال cuvette فارغة مع cuvette عينة في نفس الاتجاه والصحافة قراءة. تسجيل قيم OD600 من هذه العينات.
اضرب القيمة بـ 10 لمراعاة عامل التخفيف. تمييع التعليق واحد إلى 10 في cuvette وامتصاص التدبير، والتي ينبغي أن تعطي قيمة حوالي 0.1 الذي يتوافق تقريبا إلى واحد مرات 10 إلى CFU تسعة لكل ملليلتر. في أنبوب جديد، إضافة حجم مناسب من الثقافة الفرعية المخففة لLB الطازجة لتحقيق تعليق من مرة واحدة 10 إلى CFU ثمانية لكل ملليلتر لاستخدامها في inoculum.
إعداد التخفيفات التسلسلية من inoculum عن طريق نقل 50 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى أنبوب يحتوي على 450 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقم حتى يتم تخفيف النهائي من حوالي 100 CFU لكل ملليلتر. نقل 100 ميكرولترات من اثنين من أدنى dilutions، 100 و 1000 CFU لكل ملليلتر، إلى اثنين من لوحات أجار LB، ونشر التعليق مع موزع الخلية للحصول على مستعمرات واحدة. نقل هذه اللوحات إلى حاضنة 37 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، عد المستعمرات وحساب التركيز البكتيري من inoculum الأولي لتحديد تركيز inoculum الفعلية. في نفس اليوم، تسمية غطاء من لوحة وفقا لظروف العدوى التي سيتم استخدامها لكل بئر، مع كل حالة يجري في ثلاثية. إضافة 10 ميكرولترات من inoculum إلى الآبار المناسبة، وإضافة 10 ميكرولترات من LB العقيمة لآبار السيطرة غير المصابة.
لمزامنة وقت العدوى، ضع اللوحة في جهاز طرد مركزي و دوران بمعدل 500 مرة من G لمدة خمس دقائق، مع ضمان موازنة اللوحة. ثم، نقل الخلايا المصابة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على aliquot من وسائل الإعلام ثقافة الخلية في حمام الماء 37 درجة مئوية لاستخدامها في الخطوة التالية.
بعد ساعة واحدة من وقت العدوى، وإزالة أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الخلية من حمام الماء ومسح الخارج مع 70٪ الإيثانول. نقل لوحات ثقافة الأنسجة من الحاضنة إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. استخدام نصائح عقيمة لpirate وسائل الإعلام من الآبار واستبدالها مع 250 microliters من الطازجة، وسائل الإعلام ثقافة الخلية الدافئة.
إعادة لوحات إلى 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات إضافية. بعد ذلك، قم بإزالة الأطباق من حاضنة ثاني أكسيد الكربون وابتد من الآبار. لتحليل لوسيفيراز، إضافة 100 ميكرولترات من 1X خلية تحلل العازلة إلى الآبار.
نقل لوحة إلى ثلاجة سلبية 80 درجة مئوية واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان كفاءة الخلية. ثم، ضع لوحة تحتوي على خلية مجمدة lysate على مقاعد البدلاء لذوبان الجليد، وإعداد الكواشف الركيزة لوسيفيراز وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. السماح للكاسيفراسي الكواشف الركيزة لتكسير إلى درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، قم بتشغيل قارئ اللوحة وافتح برنامج القارئ المطابق. قم بتعيين الجهاز لقياس الإنارة. نقل 10 ميكرولترات من كل خلية lysate إلى بئر من لوحة 96-well مبهمة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولترات من مكاشف luciferase إلى كل بئر من لوحة مبهمة. اضغط بلطف على اللوحة على الجانب لخلط الآبار، وضمان تغطية السطح السفلي بالسائل. ضع اللوحة في قارئ لوحة وابدأ القراءة.
انسخ قيم الإنارة في برنامج جدول بيانات و قم برسم النتائج. ويركز هذا البروتوكول على تفعيل عامل النسخ NF-kappa-B باستخدام مراسل luciferase التابع لـ NF-kappa-B الذي يتم نقل العدوى بشكل ثابت إلى خط من خلايا HeLa. هذا الرقم يظهر تجربة تمثيلية من NF-كابا-B التفعيل luciferase تعتمد والتعبير الجيني IL6 في خلايا HeLA 57A المصابة بسلالات السالمونيلا typhimurium.
تسبب العدوى مع سلالة SL1344 من النوع البرية إشارة لوسيفيراز قوية في كل من التعبير RLU و IL6 ، والتي انخفضت في الخلايا المصابة مع sipA sopB sopE2 متحولة ثلاثية وخفضت إلى مستويات التحكم مع SIPA sopB sopE2 sopE طافرة رباعية. إيلاء اهتمام وثيق عند القيام الخاص بك تخفيف المسلسل والطلاء. وهذا يضمن أن لديك inoculum متسقة عبر سلالات الخاص بك.
بعد تحديد العوامل التي تساهم في تنشيط NF-kappa-B وتغييرات المصب في التعبير مرنا، يمكن استخدام تقنية البقعة الغربية لتحديد التغيرات في التعبير البروتيني. وقد سمح هذا البروتوكول مختبرنا ليس فقط لتقييم NF-كابا-B تفعيل الناجمة عن السالمونيلا ولكن غيرها من المركبات والبروتينات المتورطة في NF-كابا-B التنشيط. السالمونيلا التيثيموريوم هو الممرض البشري.
استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع هذه البكتيريا.
