هذه التقنية تمكن من تحديد دقيق ودقيق للكائنات الدقيقة من مجموعة مختلطة من سلالات متشابهة للغاية باستخدام تقنيات سريعة وعالية الإنتاجية الجزيئية. في نهاية المطاف، في تمكين مقارنات اللياقة البدنية التي يتعين إجراؤها بين السلالات. إن القدرة على تقييم العديد من السلالات في بركة واحدة في وقت واحد تقلل بشكل كبير من التغير من حسن إلى جيد أو من كائن إلى كائن حي لأن جميع السلالات تتعرض لنفس الظروف بالضبط.
القدرة على التكيف من هذه التقنية يسمح لاستخدامها في ما يقرب من أي كائن مرن وراثيا وتقريا أي تصميم تجريبي يتطلب تحديد دقيق للميكروبات. ابدأ هذا الإجراء بهندسة العلامات الوراثية على الكروموسومات البكتيرية، كما هو موضح في بروتوكول النص. إنشاء مجموعة من الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على كل الباركود باستثناء واحد.
استخدم هذا التجمع كمسيل لإجراء سلسلة تخفيف مع الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على الباركود الوحيد المتبقي. إعداد ردود الفعل ل PCR الرقمية في مكررة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لاستخدام سوبرميكX PCR الرقمية المصممة للكيمياء المستندة إلى التحقيق. استخدام الحمض النووي الجينومي المجمع كقالب الحمض النووي.
أيضا، إضافة 20 X التمهيدي مجس ماجستير ماجستير كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد ردود الفعل التحكم النسخ المتماثل لPCR الرقمية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يجب أن تتكون تفاعلات التحكم لكل خليط مسبار من عناصر تحكم قالب بدون و عناصر تحكم سالبة و عناصر تحكم إيجابية.
كرر هذه الخطوات لإنشاء تفاعلات PCR الرقمية لكل عينة الحمض النووي الجينومية الباركود. توليد قطرات لكل حالة رد فعل باستخدام مولد قطرات، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. نقل قطرات إنشاؤها حديثا في لوحة 96 جيدا المناسبة.
استخدام 200 نصائح ماصة ميكرولتر على ماصة 5 من خلال 50 ميكرولتر متعددة القنوات. بعد أن تم إنشاء جميع القطرات ونقلها، ختم لوحة مع sealer لوحة احباط. استخدام الشركة المصنعة موصى بها دورة الحرارية لأداء ظروف ركوب الدراجات.
أثناء إجراء الدراجات الحرارية، قم ببرمجة برنامج تحليل البيانات مع معلومات إعداد اللوحة، مثل اسم العينة ونوع التجربة و Supermix المستخدم. كما تشمل اسم الهدف 1 ونوع الهدف 1، وكذلك اسم الهدف 2 ونوع الهدف 2. بعد اكتمال الدراجات الحرارية، نقل ردود الفعل المكتملة إلى القارئ قطرات وبدء عملية القراءة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
عندما يتم قراءة جميع الآبار واكتمال التشغيل، افتح ملف بيانات QLP باستخدام برنامج تحليل البيانات. حدد جميع الآبار التي تستخدم نفس التمهيدي التحقيق Mastermix. في علامة التبويب قطرات، فحص عدد من قطرات تحليلها في كل بئر، بما في ذلك كل من قطرات إيجابية وسلبية.
استبعاد أي بئر من التحليل أقل من 10000 قطرة إجمالية. الانتقال إلى علامة التبويب السعة 1D ودراسة السعات من قطرات إيجابية وسلبية. ضمان أنها تتألف من 2 من السكان متميزة.
داخل البرنامج، استخدم ميزة العتبة لجعل قطع بين قطرات إيجابية وسلبية لكل مسبار التي تم استخدامها. وبمجرد تطبيق العتبات المناسبة على جميع الآبار، سيحسب البرنامج عدد نسخ الحمض النووي في كل رد فعل. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لتسهيل المزيد من التحليل.
باستخدام هذه القيم، حساب عدد النسخة الأولية من كل الباركود الجينومية الفريدة في العينة. تحديد متوسط معدل موجب كاذب من ردود الفعل التحكم السلبية وطرح هذه القيمة من القيم التي تم الحصول عليها في التفاعلات التجريبية. قم بضرب القيم حسب الضرورة، استنادًا إلى عمليات التخفيف التي تم تنفيذها عند إعداد كل تجربة.
الآن ، تحديد اللياقة النسبية للكائن الحي عن طريق حساب مؤشر تنافسية أو إلغاء مؤشر تنافسي من القياس الكمي الرقمي القائم على PCR من سلالة الباركود. تنفيذ هذه الخطوة لكل سلالة الباركود في جميع النقاط الزمنية. تم تخفيف الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على الباركود AA في خلفية جميع الحمض النووي الجينومي الباركود الآخر.
تمثل القناة 1 مسبار FAM للباركود AA، بينما تمثل القناة 2 مسبار HEX للباركود AO. وتقدم نتائج كل مسبار على شكل السعة الفلورية الفلورية الفردية وكذلك الرسم البياني الذي يمثل تواتر كثافة الفلورسنت لجميع القطرات في الآبار المختارة. لكل حالة، يجب أن تشكل القطرات الإيجابية والسلبية 2 سكان متميزين.
وينبغي فصل السكان باستخدام ميزة العتبات لتحديد القطرات الإيجابية والسلبية. وستختلف قيم العتبة تبعاً للمسبارات التي استخدمت، ولكن ينبغي أن يكون لجميع الآبار التي تستخدم نفس مزيج المسبار عتبات متطابقة. في حالة AA التي تم تخفيفها، يبدو أن الرسم البياني يصور فقط السكان الفردية لأن قطرات إيجابية يفوقها عدد كبير من قطرات سلبية.
ومع ذلك، لا تزال 2 مجموعات متميزة مرئية من خلال فحص السعة الفلورية القطيرة في الألواح اليسرى. كما تم تخفيف الحمض النووي الجينومية AA الباركود، كان هناك انخفاض في قطرات إيجابية، في حين أن عدد قطرات AO إيجابية لا تزال ثابتة. وبمجرد تطبيق العتبات المناسبة على جميع الآبار، سيحسب البرنامج عدد نسخ الحمض النووي في كل رد فعل.
إذا كنت تقوم بشكل روتيني PCR كجزء من البحث الخاص بك، يمكنك تنفيذ هذه التقنية لتقييم اللياقة البدنية للكائن الحي النموذجي الخاص بك. وعادة ما يستخدم هذا الإجراء لتحديد النتائج النهائية للتجارب التمهيدية. فائدته الحقيقية هي تعزيز سهولة وبراعة لأي تجارب التي تعتمد على الكم البكتيري.
نحن نستخدم هذه التقنية لتقييم اللياقة البدنية السالمونيلا في نموذج مورين من العدوى. بالإضافة إلى ذلك، يتم تكييف هذه التقنية للاستخدام مع الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض الأخرى في مختبرنا.
