وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من BBSRC (BB/1006478/1). PRR هو المستفيد من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية.

1. الاعتبارات الاستراتيجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واختيار بلورات البذور المستخدمة في التجارب microseeding تختلف اعتمادا على الهدف من التجربة. في بداية المشروع فإنه من المفيد أن تجد العديد من الفعالية تبلور التي يمكن أن توفر نقطة انطلاق بديلة لالكريستال الأمثل. rMMS يقلل كثيرا من الحاجة إلى وضوح الشمس الأمثل لبلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من المخطط المرحلة، أي في المنطقة حيث التالية اضطراب أو التنوي يعود النظام إلى التوازن. لذا نقترح استخدام rMMS بشكل روتيني في أقرب وقت يتم الحصول على بلورات الأولى (أو، بدقة أكبر، في أقرب وقت البلورات الأولى تتوقف عن النمو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للجولة الأولي من rMMS، ينبغي بذل مخزون البذور مع قدر المواد البلورية ممكن. إذا بئر واحدة فقط هي المتاحة التي تحتوي على بلورات، أو إذا كانت بلورات صغيرة، قد يكون من المفيد لاقامة التكرار متعددة منضرب الأصلي (بدون بذر) لزيادة المعروض من بلورات. إذا، ومع ذلك، يتم الحصول على العديد من مشاهدات مختلفة، بلورات البذور يمكن أن تحصد من عدة شروط ومختلطة معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب مرحلة الانفصال، بلورات نمت في ظروف عالية من الملح وينبغي أن تحصد بشكل منفصل من بلورات نمت في ظروف عالية PEG. إذا يتم خلط بلورات من عدة آبار، وينبغي اختيار الحل الخزان الذي هو أقل احتمالا لإعطاء بلورات الملح للتعليق البذور. على سبيل المثال، ينبغي تجنب التركيزات العالية من الفوسفات والكبريتات والكالسيوم والمغنيسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق في مشروع قد يكون من المهم أن نبحث عن بلورات مع الخلايا وحدة مختلفة من أجل تحسين الحيود، وتجنب بلورات توأمة، والحصول على البلورات التي هي مناسبة للبروابط ملزمة. في هذه المرحلة فقط بلورات أكثر ملائمة (مثل تلك التي حيد الضوء أفضل) ينبغي أن تستخدم لجعل مخزون البذور. ويلزم الجولات المتكررة في بعض الأحيان من microseeding، حيث لا يوجد سوى &quot;أفضل&quot;وتستخدم بلورات لجعل مخزون البذور لجولة لاحقة. إذا كان ذلك ممكنا، و&quot; &quot;مرسب محايدة مثل PEG 3000 ينبغي أن تستخدم لتعليق بلورات البذور في تشجيع الاتصالات الكريستال الرواية وبلورة المجمعات التي قد تكون غير مستقرة في ارتفاع الملح حلول 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجارب microseeding الكلاسيكية، حيث يتم استخدام حالة تبلور واحد، وغالبا ما تكون مفيدة عقب تحديد حالة واعدة وخلال التحسين اللاحقة. فمن الضروري في كثير من الأحيان لتخفيف مخزون البذور من أجل الحصول على العدد المطلوب من بلورات من كل قطرة ماء. A &quot;اندماجي&quot; التجربة microseeding (حيث يتم إضافة سلسلة من مخزونات البذور لزيادة التخفيف إلى حالة تبلور) هو وسيلة سريعة للعثور على التخفيف الأمثل للمخزون البذور. يوصف هذا النهج أدناه. </li></ol> 2. إعداد مخزون البذور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التحقيق الزجاج مقربة من ماصة باستير الزجاج باستخدام لهب بنسن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين ماصة بالقرب من منتصف حتى تصبح لينة، ثم إزالته بسرعة من اللهب واستدراجه للخروج عن طريق سحب وبصرف النظر عن الغايات. تهدف إلى سحب الزجاج لتصل إلى 0.25 ملم قطر أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر الزجاج عند نقطة حيث حوالي 0.25 ملم لفترة وجيزة يغرق نهاية اقتحام اللهب. كرر هذا حتى نصف الكرة من الزجاج يبلغ قطرها ~ 0.75 مم يتكون في النهاية. هذا التحقيق هو مفيد لسحق المواد البلورية كما هو بحجم مناسب لضرب الأجسام الصلبة على نطاق و،01-1،0 مم وأنها لا تضر سطح البلاستيك من بلورة علبة الفرعية جيدا أو ساترة. تحقيقات الأكبر (~ 1.0 ملم) قد سحق بلورات صغيرة أكثر فعالية لأن محاصرون بلورات بين الزجاج والبلاستيك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص علبة بلورة مقررة سلفا باستخدام مجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال وتحديد أب واحد أو أكثرتكبده الآبار من علبة من خلالها حصاد المواد البلورية لتوليد مخزون البذور. أي مواد يمكن استخدامها بما في ذلك إبر رفيعة، spherulites، microcrystals وغير النظامية، وبلورات سيئة. ينبغي بذل مخزون البذور في أقرب وقت ممكن بعد وقف البلورات المتنامية، كما من المرجح أن تكون مرتبطة جزئيا عبر المواد القديمة، وبالتالي تقليل مدى ملاءمتها للاستخدام في التجارب البذر. إذا أي شك موجود حول ما إذا كانت المواد البلورية إلى أن تحصد هو الملح أو البروتين البئر يمكن تصور باستخدام المجهر مضان الأشعة فوق البنفسجية أو نظام التصوير قبل الافتتاح، أو ما قد يتعرضون للمواد البلورية لفي الموقع تحليل حيود الأشعة السينية في الدرج. عند استخدام بلورات السابق البروتين النهج سوف يتألق تحت أشعة فوق البنفسجية، وسوف تظهر بلورات الملح عديم اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح علبة بلورة اختيارها بشكل جيد. لمدة 96 جيدا يجلس الصواني انخفاض قطع طريق ورقة ختم البلاستيك العلوي حول اختيارها بشكل جيد باليودنانوغرام شفرة المشرط. لمدة 24 جيدا صواني معلقة قطرة إزالة ساترة باستخدام زوج من ملاقط. عكس ساترة ووضعه على سطح نظيف مستقرة. إزالة 50 ميكرولتر من الحل الخزان ونقل هذا السائل إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة ضمان أن يبقى أنبوب على الجليد طوال الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدقة سحق البلورات في subwell (96 علبة جيدا) أو ساترة (24 علبة جيدا) يسقط، وذلك باستخدام مسبار الزجاج أعدت في القسم 2.1، وعرض النتائج تحت المجهر. بلورات صغيرة قد يستغرق عدة دقائق لسحق تماما. هذه الخطوة يسمح للمجرب للتأكد من أن البلورات هي سهلة لسحق وبالتالي فهي ليست مرتبطة عبر، وأيضا أنها ليست بلورات الملح. بلورات الملح إنتاج بنقرة والمميزة التي يمكن يسمع ويرى عندما يتم سحقها. إذا كانت البلورات هي صعبة وصعبة لسحق محاولة للحصول على مواد أعذب واستخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 5 ميكرولتر من الحل الخزان من بذور حبة أنبوب وراملحول ليعادل البئر الفرعية (يجلس التجربة قطرة)، أو ساترة (معلقة تجربة قطرة) التي تحتوي على المواد البلورية للحصاد. ماصة هذا الأمر السائل وهبوطا 5-6 مرات ل resuspend أكبر قدر من البئر الفرعية أو ساترة محتويات ممكن. العودة للتعليق على البذور أنبوب حبة وكرر هذه الخطوة مرتين أكثر من ذلك، ضمان قدر المواد البلورية يتم حصاد وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة حبة البذور لمدة دقيقتين، ووقف كل 30 ثانية لتبريد أنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل سلسلة التخفيف، وتمييع مخزون البذور في محلول الخزان من قبل عامل من 4-10 في كل مرحلة. عادة، وسيتم الحصول على عدد كبير جدا من بلورات عند استخدام مخزون البذور غير مخفف، وذلك باستخدام مخزونات البذور مخففة للسيطرة على عدد من بلورات لكل بئر. في الجولة الأولى من rMMS، فمن المهم عدم تمييع الحل مخزون البذور، لأن كلما زاد تركيز البذور سيتم الحصول على المزيد من الزيارات التبلور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن ليتم استخدامها immediately، ونقل البذور التعليق الأسهم والأوراق المالية البذور المخفف إلى -20 ° C، أو الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين. لمنع تكرار تجميد أذاب دورات، والذي قد يقلل من فعالية مخزون البذور، وتخزين هذه المواد في مأخوذة الحجم الصغير، أي 10-20 ميكرولتر. مرة واحدة المجمدة، ويجوز إبقاء مخزون البذور إلى أجل غير مسمى لحين الحاجة إليها. </li></ol> 3. إنشاء البلورة الصواني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على مدى توافر المرافق وتبلور أفضليات المجرب، rMMS بلورة الفرز يمكن القيام بها باستخدام إما الصواني 24 أيضا توظيف شنقا طريقة الانتشار قطرة بخار، أو الصواني 96 جيدا باستخدام طريقة الجلوس قطرة بخار نشرها. يمكن تأسيس الصواني تبلور لrMMS إما باليد، وذلك باستخدام التعامل مع موزع الروبوتية السائل، أو مزيج من الاثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك تجربة نموذجية rMMS إعداد باليد تشمل، 1.0 ميكرولتر حل البروتين، 1.0 ميكرولتر حالة التبلور، و0.5 ميكرولتر مخزون البذور. وهناك تجربة نموذجية إعداد باستخدام الروبوت التبلور تشمل حل البروتين 0.3 ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر حالة التبلور، و 0.1 ميكرولتر مخزون البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء الفحص في 24 rMMS جيدا شنقا الصواني قطرة، أولا، وذلك باستخدام ماصة دليل، ونقل 300 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في 10 مل شكل أنبوب واحد في كل بئر من 4 × 24 جيدا تبلور pregreased الصواني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 ميكرولتر من كل شرط تبلور من كل 300 ميكرولتر الخزان على سطح ساترة البلاستيك المقابلة التي تم إزالتها على حد سواء الأمامية والخلفية شرائط دعم وقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى ميكرولتر 1 من كل شرط تبلور إضافة 1 ميكرولتر من محلول البروتين تليها 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور وضوح الشمس. عكس كل ساترة بحيث قطرة من السائل لأسفل والموقف أعلاه المناسبة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة أسفل على ساترة، ضغط sealiنانوغرام الشحوم وتشكيل ختم آمنة. مرة واحدة يتم وضع كل قطرات 96، ينبغي نقل علبة الى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة، عادة في حدود 4-18 درجة مئوية لمدة التخزين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص rMMS في الجلوس 96 جيدا صواني قطرة أولا نقل 20-50 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في شكل عميق كتلة جيدا في كل المقابلة بشكل جيد من الدرج التبلور. هذه الخطوة نقل يمكن أداؤها باستخدام الروبوت التبلور، أو عن طريق التحويل اليدوي باستخدام ماصة 8 قنوات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخزان والبروتين والبذور الحلول الأسهم إلى قطرات من جهة أو مع الروبوت باستخدام وحدات التخزين بالتفصيل في 3.1. بعض الروبوتات التبلور المتاحة تجاريا عدم الاتصال الاستغناء، وأداء البذور نقل المخزون باستخدام مثل هذا النظام قد يؤدي إلى انسداد الأنابيب الاستغناء نصائح او المرتبطة بها. ترتيب صرفها هو متغير: بعض الروبوتات الاستغناء عن الحلول في وقت واحد. إذاهذا غير ممكن، الاستغناء البروتين أولا، ثم الخزان، ثم البذور الأسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الاتصال الاستغناء الروبوت ليس نقل متوفرة بذور باستخدام حقنة الزجاج انخفاض حجم مزودة إبرة حادة. شطف إبرة بتمريرها من خلال حل الخزان ثم الاستغناء عن مخزون البذور في كل قطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم صينية باستخدام ورقة ختم شفافة ونقل إلى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة للتخزين. </li></ol></li></ol> 4. التفتيش على بلورة الصواني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور كل التجارب تبلور باستخدام المجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال. السابق يتيح عموما تحكم المستخدم أكبر على عمق الرؤية ودرجة التكبير من هذا الأخير، ولكن هو أكثر استهلاكا للوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفتيش كل sub-well/coverslip في تسلسل وتسجيل أية أدلة على تشكيل الكريستال. يجب فحص التجارب مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة 5 أيام عقب إنشائها ون بعد ذلك مرة واحدة كل 7 أيام لمدة تصل إلى 4 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غالبا ما يطلب من دورات متعددة من قبل rMMS يتم إنتاج بلورات الأمثل جودة الحيود. </li></ol>

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

في هذه الورقة التي وصفناها طريقة عامة لrMMS بلورة البروتين الفرز. لقد أثبتنا باستخدام اثنين من البروتينات اختبار بزيادة كبيرة في معدل نجاح تبلور باستخدام هذا الأسلوب. تحليل حيود باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS وأساليب غير r...

من التطبيق الأولي من خلال Perutz، Kendrew وزملاء العمل في تحديد هياكل الهيموجلوبين والميوجلوبين، إلى إنتاجية عالية خطوط الأنابيب الحديثة الآلي للاتحادات الجينوميات الهيكلي، والجزيئات البلورات بالأشعة السينية قد أتاحت لنا لمحة هيكلية غير مسبوقة في عالم البروتين . لا تزال هذه التقنية المنهج التجريبي الأكثر انطباقا على نطاق واسع أن يسمح للرؤية مباشرة من بنية البروتين في الذرية، أو بالقرب القرار الذري (أي في حدود 1-3). ومن الشروط الأساسية لحيود الأشعة السينية ليتم تطبيقها على البروتين هو أنه يجب أولا أن تبلور، وهذا هو مرحلة من مراحل العملية التي لا تزال أعظم خطوة الحد من معدل واحد في تحديد هيكل بالطرق الحيود 1 و 2. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا لعملية بلورة البروتين، وتحسينات كبيرة في نوعية وتوافر شاشات التبلور،الصواني، والتكنولوجيات ذات الصلة، فإنه لا يزال من المستحيل التنبؤ بشكل موثوق من احتمال نجاح تبلور 3. ويمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية لتقييم ما إذا كان البروتين من الفائدة يعرض خصائص مواتية لالتنوي الكريستال والنمو، أي هو مطوية جيدا، متجانسة، monodisperse، وما إلى ذلك، ولكن هذه الأفكار في أي وسيلة توفر مؤشرا نهائيا التبلور الميل. منذ فترة طويلة البذر يزعم أن يكون وسيلة ناجعة لتحسين عدد وحجم ونوعية بلورات القائمة أو المواد البلورية 4-7. ويستند هذا النهج على أساس أن شرط أن يدعم الكريستال التنوي قد لا تكون الأمثل لنمو البلورات اللاحقة والعكس بالعكس. عن طريق نقل المواد الأنوية من حالة إلى أخرى، يمكن للمرء أن محاولة فصل هذه العمليات بشكل فعال، وبالتالي إعطاء الوصول إلى الجديد، كما تبلور الفضاء غير مستكشفة بعد،ونتيجة لزيادة معدل النجاح العام من تجربة الفرز. وقد تم توثيق طرق أنشئت ل(ط) macroseeding، ونقل من بلورة واحدة في مجملها من شرط واحد إلى 8 آخر، (ب) بذر متتالية، ونقل المواد الأنوية، التي تم الحصول عليها بشكل عام من تطبيق الضغط باستخدام الاتجاه على سبيل المثال الخط الطولي القط على سطح بلورة القائمة، تليها مرور لاحقة من الخط الطولي من خلال انخفاض تبلور الجديدة 9، و (ج) &quot;الكلاسيكية&quot; microseeding، ونقل الكريستال &quot;بذور&quot;، التي تم إنشاؤها بواسطة الحصاد سحق بلورات (أو البلورية المواد)، في ظروف مماثلة لتلك التي أسفرت عن بذور 10. وخاصة كل ثلاثة من هذه الأساليب هي مضيعة للوقت وسوء تحجيم، وبالتأكيد بالمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع الحديث مناولة السائل الروبوتات التبلور. وقد ساهمت هذه العوامل، على مستوى بعض على الأقل، إلى الاعتقاد بأن البذورجي هو طريقة في أن يزوره فقط عندما فشلت المقاربات الأخرى لتؤتي ثمارها. مصفوفة عشوائية microseeding (rMMS) هو الابتكار المنهجي الأخيرة الذي يجمع بين فوائد microseeding التقليدية مع تلك الفحص إنتاجية عالية وقابلية 11-13. يعتمد هذا النهج على توليد مخزون البذور، والمنتجة من المواد البلورية الأنوية، والتي يمكن aliquoted في / على كل sub-well/coverslip ضمن معيار 96-screen حالة التبلور. هذا الأسلوب ينطبق على كل من يجلس أو شنقا التجارب نشر انخفاض بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 24 جيدا أو شكل علبة 96 جيدا. وقد ثبت بالتجربة rMMS إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح التبلور، وإنتاج بلورات من قدر أكبر من الجودة والكمية حيود 11، 13، 14، ويمثل أداة مبتكرة في ترسانة البلورات &#39;النهج في سngoing الجهد نحو النجاح التبلور. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS وتوفير بيانات عينة توضح فعالية هذه التقنية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

فحص عشوائي microseed مصفوفة (rMMS) هو أسلوب بلورة البروتين في البلورات التي تضاف إلى البذور شاشات عشوائي. عن طريق زيادة احتمال أن بلورات سوف تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من مرحلة رسم تخطيطي بروتين، وغالبا ما يتم الحصول عليها يؤدي تبلور اضافية، ويمكن زيادة جودة البلورات المنتجة، ويتم توفير امدادات جيدة من بلورات لتجارب جمع البيانات وتمرغ. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS التي يمكن تطبيقها إما الجلوس أو قطرة قطرة شنقا التجارب نشر بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 96 جيدا أو شكل علبة 24 أيضا.

(A) مثال لتجربة rMMS للتدليل على فعالية rMMS فحص طبقنا هذا الأسلوب لبلورة الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض (HEWL) والكبد البقري الكاتلاز (BLC). كل من هذه الأنزيمات هي crystallizable بارز وهيكليا تتميز كذلك الأهداف 15 و 16. على هذا النحو على حد سواء ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  University of Bristol.  نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ. 

Video: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...