وأيد هذا العمل من قبل شعبة بحوث جماعية من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID)، المعهد الوطني للصحة (NIH)، الولايات المتحدة الأمريكية. تم الحفاظ على جميع الفئران في رابطة الأمريكية لاعتماد المختبرات العناية المعتمدة مرفق الحيوان الحيوان في المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) ويضم وفقا للإجراءات المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية تحت رعاية بروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من المعدية.

1. العزلة من الفأر نخاع العظم والخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسة اللجنة وافقت عليها وترش على سطح الحيوان مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجلد في منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي السفلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العضلات من السفلية باستخدام مقص وخلخل بعناية لحق من مفصل الورك، مع تجنب كسر عظم الفخذ رئيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العضلات المتبقية من عظم الفخذ والساق باستخدام مشرط ومقص وفصل عظم الفخذ من الساق عند الركبة الرعاية ممارسة مشتركة لعدم كسر نهايات العظام. وضع العظام في طبق بتري تحتوي RPMI الجليد الباردة 1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الخطوات التالية في إطار نسيج الثقافة هود. اتخاذ الاحتياطات اضافية للحفاظ على تقنيات معقمة صارمة لتجنب neutrophiL التنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف كل العظام مع الايثانول 70٪ (داخل طبق بتري)، يليه ثلاثة يغسل اللاحقة في الجليد الباردة PBS العقيمة (داخل أطباق بتري) لشطف قبالة الإيثانول من سطح العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الداخل نظيفة طبق بتري معقمة، وقطع المشاش في العظام والاحتفاظ بها جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة عيار 25 وحقنة سم مكعب 12 مليئة RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA، وتدفق خلايا نخاع العظام من كلا طرفي مهاوي العظام على 50 مل المسمار أعلى أنبوب فالكون مزودة 100 ميكرون تحديد. من أجل إزالة جميع الخلايا بكفاءة، كشط السطح الداخلي للعظام باستخدام إبرة عيار 25. </li></ol> ملاحظة: ابيضاض من العظام يشير إلى أن خلايا تم كشط بما فيه الكفاية. ملاحظة: استخدم حوالي 10 مل من وسائل الاعلام لطرد عظم فخذ / الزوج الساق. مضيفا EDTA إلى وسيلة ضرورية لمنع تراكمها من الخلايا. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المشاش العظامفي الصغيرة 0.5-1 ملم 3 قطع مع مشرط وسحق لهم من خلال مرشح ميكرون 100 باستخدام نهاية الخلفي من 2.5 مل إيبندورف Combitip زائد بيوبور غيض ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق الخلية بيليه في 20 مل من 0.2٪ كلوريد الصوديوم لحوالي 20 ثانية تليها إضافة 20 مل من 1.6٪ كلوريد الصوديوم. (الحرجة: لا يتجاوز 20-30 ثانية من تحلل منخفض التوتر لتجنب موت الخلايا نخاع العظام ينصح استخدام ناقص التوتر كلوريد الصوديوم لتحلل أكثر من العازلة lysing ACK لأن الأخير لديه القدرة على تفعيل العدلات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 1،400 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لجمع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 2 ملي EDTA وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العائد من خلايا نخاع العظام باستخدام هذا الأسلوب هو ما يقرب من 60 حتي 80000000 في المعافين C57BL 8-12 أسبوع من العمر / 6 الماوس. </li></ol> 2. فصل من العدلاتبواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا نخاع العظم و resuspend في 1 مل من الجليد الباردة PBS العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من Histopaque 1119 (الكثافة، 1.119 جم / مل) في أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب 3 مل من Histopaque 1077 (الكثافة، 1.077 جم / مل) على مل 3 من Histopaque 1119. </li></ol> ملاحظة: Histopaque 1119 وHistopaque 1077 ينبغي أن تكون درجة حرارة إلى 18-26 درجة مئوية قبل الاستخدام. خطوة حاسمة: إعداد التدرجات فورا قبل الاستخدام وإعداد والتدرج في وقت مبكر يؤدي إلى انتشار بين طبقتين ونقاء العدلة دون المستوى الأمثل والانتعاش. خطوة حاسمة: تتراكب Histopaque 1077 أكثر من 1119 يحتاج إلى أن يتم ببطء لتجنب خلط اثنين من الكثافة، والتي سوف يحول دون فصل الخلايا خلال الطرد المركزي. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب خلية نخاع العظم التعليق على الجزء العلوي من Histopaque 1077. </li></ol> خطوة حاسمة: Overlفي Aying الخلية نخاع العظم التعليق أكثر من 1077 احتياجات Histopaque إلى أن يتم ببطء لتجنب تعكير صفو العلاقة بين الخلايا وHistopaque 1077. ملاحظة: إعادة التعليق خلايا نخاع العظام من الماوس المعافين في 1 مل من برنامج تلفزيوني تعطي نقاء العدلة من&gt; 90٪. ومع ذلك، وتجميع العديد من عينات نخاع العظام التنازلات نقاء العدلة، على سبيل المثال، إعادة التعليق 300 × 10 6 خلايا في 3 مل PBS يقلل من نقاء العدلات&gt; 90٪ إلى 80٪ ~. ولذلك، ينبغي للمحققين إجراء تجارب رائدة لتحديد العد / حجم الخلية ظروف مثالية لتجاربهم الخاصة <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 2،000 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية دون فرامل. </li></ol> ملاحظة: الطرد المركزي من التدرج في درجة حرارة الغرفة أمر بالغ الأهمية وضرورية لفصل فعلي من العدلات. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العدلات في واجهة من Histopaque 1119 وHistopaque 1077 طبقات. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العدلات جمعها مرتين مع المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين والطرد المركزي في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد العدلات وتحديد قدرتها على الاستمرار. </li></ol> ملاحظة: العدلات هي عادة&gt; 95٪ قابلة للحياة و&gt; 90٪ نقية على النحو الذي يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. العائد نموذجي من العدلات من نخاع العظام (أي 2 عظم الفخذ والظنبوب العظام 2) من غير مصاب 8-12 C57BL من العمر الأسبوع / 6 الماوس ~ 6-12٬000٬000 الخلايا. هذا العدد هو أكبر بكثير عندما يتم حصاد العدلات من نخاع العظام من الحيوانات المصابة. وبالتالي، تم انتشال ~ 30-40000000 العدلات / الماوس عندما استخدمت الفئران المصابة المبيضات للحصاد الخلية 6. 3. وضع العلامات من العدلات باستخدام الأصباغ CellTracker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والعدلات في 5 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني prewarmed عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة صبغة CellTracker في تناسق النهائيالتموينية من 5 ميكرومتر. </li></ol> ملاحظة: CellTracker الأخضر (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein ثنائي الأسيتات) وCellTracker أورانج (CMTMR (5 - (و-6)-4-كلوروميثيل Tetramethylrhodamine الأمينية بيروكسايد) والمستخدمة في هذا البروتوكول لتسمية تفاضلي العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص الفئران. ملاحظة: إعداد محلول المخزون من 10 ملم من الأخضر CellTracker وCellTracker أورانج، قسامة، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يوم من التجربة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العدلات مع 5 ميكرومتر من الصبغة CellTracker المقابلة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تهتز في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع الثلج الباردة المتوسط ​​1640 1X تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. </li></ol> ملاحظة: غسل كفاءة من الخلايا بعد خطوة وصفها مع صبغ CellTracker أمر ضروري لتجنب صبغ انتقال التلوث قبل خلط السكان العدلة تفاضلي المسمى لهبوطاtream دراسات إعادة تعمير تنافسية. 4. نقل بالتبني من العدلات في الفئران والتحليل من العدلات المحول باستخدام التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العدلات resuspend في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة عند تركيز 25 × 10 6 خلية / مل وحقن 200 ميكرولتر من تعليق في الوريد الذيل الأفقي بحيث يتم نقل 5 × 10 6 العدلات في الماوس. للدراسات العدلة إعادة تعمير تنافسية، مزيج العدلات من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص في نسبة 1:1 وحقن ما مجموعه 5 × 10 6 العدلات في الماوس على النحو الوارد أعلاه. </li></ol> ملاحظة: على الأقل ما يصل إلى 10 × 10 6 العدلات يجوز نقل adoptively في الماوس دون سمية فوري واضح لهذه الحيوانات. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أوقات مختلفة بعد نقل بالتبني (على سبيل المثال 1، 2، 3 أو 4 ساعات بعد نقل)، الموت ببطء الفئران والدم الحصاد، و / أو نخاع العظم و / أو غيرها من الجهاز المستهدف (ق) من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيتعليق خلية ngle من هذه الأنسجة للتحليل الكمي والنوعي للنقل adoptively العدلات المسمى باستخدام بروتوكولات نشرت 6،15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد لايف / الميت تلطيخ الجدوى والحصار اف سي، خلايا التسمية مع CD45 (استنساخ 30-F11)، Ly6G (استنساخ 1A8) وCD11b (استنساخ M1/70) وبوابة لايف CD45 + Ly6G + + CD11b العدلات. العدلات في هذه البوابة تشمل العدلات مواطن من الماوس المتلقي فضلا عن العدلات المسمى نقل adoptively، والتي هي + FITC (إذا كان المسمى مع CellTracker الأخضر) أو PE + (إذا كان المسمى مع خلية المقتفي أورانج). </li></ol> ملاحظة: قد يتم تعقب العدلات في الدم ونخاع العظام والكلى من الفئران المصابة المبيضات لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل. ملاحظة: التثبيت مع بارافورمالدهيد 2٪ في برنامج تلفزيوني لا يؤثر سلبا على كثافة مضان يعني من العدلات المسمى مع غرام CellTrackerالتابعين أو CellTracker البرتقال لمدة 48 ساعة على الأقل.

<ol>
	<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+host+defense.">Neutrophils and host defense.</a> Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).</li><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4++T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li><li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis.">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li><li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis.">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li><li>Casc&#227;o, R., Ros&#225;rio, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis:+More+than+simple+final+effectors.">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li><li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation.">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li><li>Hasenberg, M., K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).</li><li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor.">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li><li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice.">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li><li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow.">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li><li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis.">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li><li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pouri&#233;, C., Steinckwich, N., Dournon, C., N&#252;sse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils.">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+negative+enrichment+of+CD4++and+CD8++T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail.">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li><li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils.">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).</li><li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis.">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li><li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roff&#234;, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice.">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li><li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow.">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li><li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow.">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

هنا نقدم بروتوكول موثوق بها، بسيطة، سريعة واقتصادية لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وجدوى استخدام نهج الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يمكن استردادها ~ 6-12 × 10 6 العدلات من الماوس المعاف...

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. هم المكون الرئيسي الخلوية في الجهاز المناعي الفطري ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة ونقص المناعة الأولية التي تؤثر على أعداد العدلات و / أو وظيفة تطوير التهابات الغازية التي تهدد الحياة البكتيرية والفطرية، وتسليط الضوء على أهمية هذه الخلايا في الدفاع المضيف 1. الاعتراف المناعي للغزو مسببات الأمراض في موقع الإصابة بهم وما شابه ذلك نمط الاعتراف مستقبلات النتائج في الاستقراء لمدبرة الاستجابة المناعية الفطرية، الأمر الذي يؤدي إلى إفراز chemoattractants التي تولد التدرج الكيميائي قادرة على تجنيد العدلات من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة 2 . بعد العدلات دخول موقع الإصابة، فإنها تصبح تفعيلها، الأمر الذي يؤدي إلى خلوى وchemokine الإنتاج، وامتصاص الممرض، وقتل عن طريق الأكسدة وغير المؤكسدة ليchanisms 3. وإلى جانب دورها المعترف بها بشكل جيد في المناعة الفطرية، كما تم مؤخرا أظهرت العدلات للعب أدوار هامة مثل المبادرين من الاستجابات المناعية التكيفية فعالة 4. من ناحية أخرى، وبصرف النظر عن الأدوار وقائي بهم في الحصانة، العدلات قد توسط أيضا إصابة الأنسجة والباثولوجيا المناعية بسبب التراكم المفرط و / أو التنشيط في مواقع الالتهاب، كما هو مبين في مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية والمناعة الذاتية 5-7. على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في تصاعد الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة ووظائفها المستجيب عديد المظاهر في العديد من الأمراض المعدية والالتهابات، والصعوبات التقنية مع التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق أعاق البحوث مع العدلات على مدى العقود الماضية. ولذلك، واستخدام المقايسات استنساخه لعزل العدلات ينبغي أن تسهل إجراء المزيد من البحوث على immunolo العدلات بوساطةوظائف gical خارج الحي والحية. حتى الآن، وقد وصفت عدة طرق لعزل العدلات مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم البشري والدم الماوس أو نخاع العظم 8،9، إيجابية أو سلبية تخصيب immunomagnetic من العدلات من الدم أو نخاع العظم الماوس 10،11، والحصاد من العدلات من التجويف البريتوني من الفئران بعد الحقن داخل الصفاق من thioglycollate أو وكلاء الالتهابية الأخرى 12. على الرغم من العدلات يمكن عزلها بسهولة في أعداد كبيرة من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو الأمثل في الفئران نظرا لمحدودية حجم الدم الماوس يحول دون العزلة من العدلات كافية للدراسات وظيفية أو تجارب نقل بالتبني 13. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العائد من thioglycollate-أثارت الخلايا من التجويف البريتوني هو أكبر مقارنة بما كان عليه من الدم الماوس، ونقاء من العدلات في غسيل البريتوني التهابات يختلف بين60-90٪، والعدلات معزولة يحمل النمط الظاهري تفعيلها. وهكذا، جمع الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يمكن فقط أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية للتنشيط ولكن ليس من العدلات unstimulated، كما التجويف البريتوني الماوس لديها عدد قليل العدلات في حالة مستقرة 12. بدلا من ذلك، نخاع العظم هو خزان مريحة للحصاد أعداد كبيرة من العدلات إما unstimulated أو تنشيط 11،14، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لدراسات وظيفية المصب مثل البلعمة والقتل وتحبب، أو لنقل بالتبني في الفئران المتلقية. هنا نحن تصف بسيطة وسريعة (~ 2 ساعة) البروتوكول، الذي يوفر العائد المرتفع (~ 6-12 × 10 6 العدلات / الماوس غير مصاب، أو ما يصل إلى 30-40 × 10 6 العدلات / فأر مصاب) من الذهب الخالص (80 -95٪) العدلات مع&gt; 95٪ الجدوى من نخاع العظام. يستخدم هذا الأسلوب Histopaque المتاحة تجاريا، والتي هي كثافة التدرج سيبا الخليةوسائل الاعلام التموينية تتألف من Ficoll ودياتريزوات الصوديوم، لفصل العدلات من نخاع العظام من الفئران. هذه الطريقة تعطي أرقام أكبر بكثير من العدلات في الماوس مقارنة مع الدم أو البريتوني تجويف، فإنه يمكن استخدامها لجمع العدلات من الفئران سواء في حالة مستقرة أو بعد الإصابة، وأنه من الأسهل أن طبقة بالمقارنة مع أسلوب الطرد المركزي المتدرج الكثافة التي تستخدم متقطع التدرجات Percoll تتألف من 55٪ / 65٪ / 75٪ Percoll في برنامج تلفزيوني 9. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تناقص الوقت والموارد اللازمة لجمع العدلات نقية بشكل ملحوظ مقارنة مع العزلة العدلة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا. أيضا، لأن هذا الأسلوب لا ينطوي على خطوة تخصيب immunomagnetic، هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، وأنه يتجنب التعرض الخلايا إلى العمود المغناطيسي والأجسام المضادة، مما يخفض من احتمال تفعيل العدلات. بالإضافة إلى إجراء الدراسات الفنية للneutroph معزولةILS خارج الحي ونقل بالتبني من الخلايا في الفئران المتلقية، ويصف هذا البروتوكول أيضا طريقة لوصفها من العدلات المعزولة باستخدام الأصباغ CellTracker مختلفة. وضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من مختلف الخلفيات الوراثية يمكن تكييفها في دراسات إعادة تعمير تنافسية لتتبع العدلات نقل في أنسجة الفئران المتلقي باستخدام التدفق الخلوي، والتي يمكن أن توفر البصيرة الآلي على الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الهدف أجهزة ملتهبة 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

العدلات هي خلايا المستجيب الحرجة من نظام المناعة الفطرية. يتم تجنيدهم بسرعة في مواقع الالتهاب الحاد وبذل آثار وقائية أو المسببة للأمراض اعتمادا على الوسط التهابات. ومع ذلك، على الرغم من الدور الذي لا غنى عنه من العدلات في الحصانة، فهم مفصل من العوامل الجزيئية التي تتوسط الآثار العدلات &#39;المستجيب وimmunopathogenic في الأمراض المعدية المختلفة والحالات الالتهابية لا يزال غير موجود، وذلك جزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة، وصعوبات في التعامل مع هذه الخلايا وعدم وجود البروتوكولات التجريبية موثوق بها للحصول على أعداد كافية من العدلات للدراسات وظيفية المصب وتجارب نقل بالتبني. ولذلك، طرق بسيطة وسريعة واقتصادية وموثوق بها، مطلوبة بكثرة لحصاد أعداد كافية من العدلات الماوس لتقييم وظائف مثل البلعمة والقتل، خلوى الإنتاج، وتحبب والاتجار بها. وتحقيقا لهذه الغاية،نقدم كثافة بروتوكول التدرج استنساخه القائم على الطرد المركزي، والتي يمكن تكييفها في أي مختبر لعزل أعداد كبيرة من العدلات من نخاع العظام من الفئران مع نقاء عالية وقدرتها على البقاء. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم بروتوكول بسيط يستخدم الأصباغ CellTracker لتسمية العدلات المعزولة، والتي يمكن بعد ذلك يتم نقل adoptively في الفئران المتلقية وتعقبها في العديد من الأنسجة لمدة 4 ساعة على الأقل بعد النقل باستخدام التدفق الخلوي. باستخدام هذا النهج، ووضع العلامات الفرق من العدلات من الفئران من النوع البري والجينات التي تعاني من نقص مع الأصباغ CellTracker مختلفة يمكن استخدامها بنجاح لإجراء دراسات إعادة تعمير تنافسية لتقييم الدور المباشر للجينات معينة في الاتجار العدلات من الدم إلى الأنسجة المستهدفة في الجسم الحي .

هو الأمثل هذا البروتوكول بالنسبة للمحصول من خلايا نخاع العظام من الفئران وفصل لاحق من العدلات من هذه الخلايا بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة باستخدام المتاحة تجاريا وسائل الاعلام فصل الخلية Histopaque. عزل العدلات باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوع?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments at JoVE.com

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو نقل وتتبع التجارب بالتبني.

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.4K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. نحن تصف بروتوكول لعزل وتنقية العدلات من نخاع العظم الماوس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة والعدلة لوضع العلامات باستخدام الأصباغ CellTracker. وهذا يمثل طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه واقتصادية من أجل الحصول على أعداد كبيرة من العدلات للدراسات وظيفية المصب أو ن?...

Video: Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات<em&gt; في فيفو</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

الفئران هند الاطراف طويل العظام تشريح ونخاع العظم عزل

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.