Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA unterstützt. Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care-akkreditierten Tierhaus am National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) gepflegt und untergebracht in Übereinstimmung mit den Verfahren in den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren skizzierten unter der Schirmherrschaft eines Protokolls von der Animal Care und Use Committee des NIAID genehmigt.

1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus <ol><li> Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten. </li><li> Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleichzeitiger Vermeidung Brechen des Femurkopfes. </li><li> Entfernen Sie die restlichen Muskeln aus dem Oberschenkel und Schienbein mit einem Skalpell und Schere und trennen Sie die Oberschenkelknochen von der Tibia im Kniegelenk Ausübung Sorgfalt nicht brechen die Knochen endet. Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Fahren Sie mit den folgenden Schritten unter einer Gewebekultur Kapuze. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme strengen sterilen Techniken zu halten, um zu vermeiden neutrophil Aktivierung. </li><li> Spülen Sie jede Knochen mit 70% Ethanol (in einer Petrischale) durch drei nachfolgenden Wäschen in eiskaltem sterilem PBS (in Petrischalen) abzuspülen das Ethanol von der Oberfläche der Knochen gefolgt. </li><li> Innerhalb einer sauberen sterilen Petrischale, schneiden Sie die Epiphysen der Knochen und halten Sie sie beiseite. </li><li> Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel und eine 12-ml-Spritze mit RPMI mit 10% FBS und 2 mM EDTA ergänzt gefüllt und bündig die Knochenmarkzellen von beiden Enden der Knochen Wellen auf einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 100 um ausgestattet filtern. Um effizient zu entfernen alle Zellen, kratzen die innere Oberfläche des Knochens unter Verwendung des 25-Gauge-Nadel. </li></ol> HINWEIS: Blanchieren der Knochen zeigt, dass die Zellen wurden ausreichend abgeschabt. HINWEIS: Verwenden Sie ca. 10 ml Medium, um einen Oberschenkelknochen / Paar Schienbein zu spülen. Hinzufügen von EDTA zu dem Medium ist wichtig, um zu verhindern Verklumpung der Zellen. <ol start="9"><li> Schneiden Sie die Knochen Epiphysenin kleinen 0,5-1 mm 3 Stück mit einem Skalpell und zerschlagen sie durch die 100 um-Filter mit dem Back-End einer 2,5 ml Eppendorf Combitip plus Biopur Pipettenspitze. </li><li> Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C. </li><li> Lyse der roten Blutkörperchen durch das Zellpellet in 20 ml 0,2% NaCl für etwa 20 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 20 ml 1,6% NaCl. (Critical: Überschreiten Sie nicht 20-30 sec von hypotonen Lyse Knochenmark Zelltod zu vermeiden Der Einsatz von hypotonen NaCl zur Lyse über ACK Lysepuffer wird empfohlen, da die letzteren hat das Potenzial, um die Neutrophilen zu aktivieren.). </li><li> Zentrifuge für 7 min bei 1.400 rpm bei 4 ° C zu sammeln die Zellen. </li><li> Waschen der Zellen mit RPMI 1640 1x mit 10% FBS und 2 mM EDTA supplementiert und Zentrifuge in Schritt 1.12. </li><li> Die Ausbeute von Knochenmarkzellen mit dieser Methode ist etwa 60 bis 80.000.000 pro infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus. </li></ol> 2. Trennung von Neutrophilendurch Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Zählen Sie die Knochenmarkszellen und resuspendieren in 1 ml eiskaltem sterilem PBS. </li><li> 3 ml Histopaque 1119 (Dichte, 1.119 g / ml) in einem 15-ml konischen Röhrchen. </li><li> Overlay 3 ml Histopaque 1077 (Dichte 1,077 g / ml) auf die 3 ml Histopaque 1119. </li></ol> HINWEIS: Histopaque 1119 und 1077 Histopaque sollte auf 18-26 ° C erwärmt werden vor der Verwendung. Critical Schritt: Bereiten Gradienten unmittelbar vor der Verwendung als Vorbereitung der Gradient im Voraus in Diffusion zwischen den beiden Schichten und suboptimale Neutrophilen Reinheit und Erholung führen. Critical Schritt: Überlagerung Histopaque 1077 über 1119 muss langsam erfolgen, um zu vermeiden, das Mischen der beiden Dichten, die Trennung von Zellen während der Zentrifugation wird ausgeschlossen. <ol start="4"><li> Overlay das Knochenmark Zellsuspension auf der Oberseite des Histopaque 1077. </li></ol> Critical Schritt: OverlAying das Knochenmark Zellsuspension über Histopaque 1077 muss langsam erfolgen, um zu verhindern, daß die Schnittstelle zwischen den Zellen und Histopaque 1077. Hinweis: Das Resuspendieren Knochenmarkzellen von einem nicht infizierten Maus in 1 ml PBS ergibt Neutrophilen Reinheit von&gt; 90%. Allerdings Bündelung viele Knochenmarkproben beeinträchtigt Neutrophilen Reinheit, beispielsweise Resuspendieren 300 x 10 6 Zellen in 3 ml PBS verringert die neutrophile Reinheit von&gt; 90% auf ca. 80%. Daher sollten Ermittler führen Pilotversuche, um die idealen Zellzahl / Volumen Bedingungen für ihre spezifische Experimente identifizieren <ol start="5"><li> Zentrifuge für 30 min bei 2.000 rpm bei 25 ° C ohne Bremse. </li></ol> Hinweis: Zentrifugation der Gradienten bei Raumtemperatur ist kritisch und notwendig für eine effektive Trennung der Neutrophilen. <ol start="6"><li> Sammeln der Neutrophilen an der Grenzfläche des Histopaque 1119 und 1077 HISTOPAQUE Schichten. </li&gt; <li> Waschen Sie die gesammelten Neutrophilen zweimal mit RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin und Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C ergänzt </li><li> Zählen Sie die Neutrophilen und bestimmen ihre Lebensfähigkeit. </li></ol> HINWEIS: Neutrophile sind typischerweise&gt; 95% lebensfähig und&gt; 90% rein, wie durch FACS-Analyse bestimmt. Die typische Ausbeute von Neutrophilen aus dem Knochenmark (dh 2 Femur und Tibia 2 Knochen) von einem nicht infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus ~ 6-12.000.000 Zellen. Diese Zahl ist wesentlich größer als Neutrophilen aus dem Knochenmark von infizierten Tieren geerntet. Daher wurden ~ 30-40000000 Neutrophilen / Maus erholt, als Candida-infizierten Mäusen für Zellernte 6 verwendet wurden. 3. Markierung von Neutrophilen Mit CellTracker Dyes <ol><li> Resuspendieren der Neutrophilen bei 5 x 10 6 Zellen / ml in PBS vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Fügen Sie einen CellTracker Farbstoff bei einer abschließenden concentration von 5 um. </li></ol> HINWEIS: CellTracker Green (CMFDA (5-Chlormethylfluorescein Diacetate) und CellTracker Orange (CMTMR (5 - (und-6)-4-Amino Chloromethyl Benzoyl Tetramethylrhodamine) wurde in diesem Protokoll verwendet werden, um unterschiedlich beschriften Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen. HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM CellTracker Grüne und CellTracker Orange Aliquot, und bei -80 ° C bis zu dem Tag des Experiments. <ol start="3"><li> Inkubieren Neutrophilen mit 5 uM des entsprechenden CellTracker Farbstoff für 10 min bei 37 ° C in einem Schüttelwasserbad bei Dunkelheit. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. </li></ol> HINWEIS: Efficient Waschen der Zellen nach der Markierung mit dem Schritt CellTracker Farbstoff ist wichtig, Farbstoff Kreuzkontamination vor dem Mischen unterschiedlich markierten Neutrophilen für Tiefen vermeidentream wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien. 4. Adoptiven Transfer von Neutrophilen in Mice and Analysis der übertragenen Neutrophile mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Resuspendieren Neutrophilen in eiskaltem PBS in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml und injizieren 200 ul der Suspension in die laterale Schwanzvene so, dass 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus übertragen werden. Aus Wettbewerbsgründen Wiederbesiedlung Neutrophilen Studien, mischen Wildtyp-und Gen-defizienten Neutrophilen im Verhältnis 1:1 und injizieren insgesamt 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus wie oben. </li></ol> HINWEIS: Mindestens bis zu 10 x 10 6 Neutrophilen kann adoptiv pro Maus ohne offensichtliche Toxizität sofort zu den Tieren übertragen. <ol start="2"><li> Zu verschiedenen Zeiten nach adoptiven Transfer (z. B. 1, 2, 3 oder 4 Stunden nach der Übertragung), einschläfern Mäusen und Ernte Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Zielorgan (e) von Interesse. </li><li> Bereiten single Zellsuspensionen aus diesen Geweben für die quantitative und qualitative Analyse der adoptiv übertragen markierten Neutrophilen mit veröffentlichten Protokollen 6,15. </li><li> Nach Live / Dead-Färbung und Lebensfähigkeit Fc Blockade, Label-Zellen mit CD45 (Klon 30-F11), Ly6G (Klon 1A8) und CD11b (Klon M1/70) und Tor auf Live-CD45 + CD11b + + Ly6G Neutrophilen. Neutrophile in diesem Tor umfassen nativen neutrophilen Granulozyten des Empfängers Maus sowie die adoptiv übertragen markierten Neutrophilen, die FITC + (wenn mit CellTracker Grün markiert) oder PE + (wenn mit den Cell Tracker orange markiert) sind. </li></ol> HINWEIS: Neutrophile können in Blut, Knochenmark und Nieren von Candida-infizierten Mäusen für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung verfolgt werden. Hinweis: Befestigung mit 2% Paraformaldehyd in PBS nicht nachteilig auf die mittlere Fluoreszenzintensität der Neutrophilen mit CellTracker Gr markierteneen oder CellTracker orange für mindestens 48 Stunden.

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	<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+host+defense.">Neutrophils and host defense.</a> Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).</li><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4++T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li><li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis.">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li><li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis.">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li><li>Casc&#227;o, R., Ros&#225;rio, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis:+More+than+simple+final+effectors.">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li><li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation.">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li><li>Hasenberg, M., K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).</li><li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor.">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li><li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice.">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li><li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow.">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li><li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis.">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li><li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pouri&#233;, C., Steinckwich, N., Dournon, C., N&#252;sse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils.">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+negative+enrichment+of+CD4++and+CD8++T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail.">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li><li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils.">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).</li><li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis.">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li><li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roff&#234;, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice.">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li><li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow.">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li><li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow.">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 6 Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 6 Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion 6 isoliert werde...

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr 1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe, die eine chemotaktische Gradienten in der Lage Recruiting Neutrophilen aus der Blutbahn in das entzündete Gewebe 2 Leads zu generieren . Nach Neutrophilen Ort der Infektion geben, sie aktiviert werden, führt das zu Zytokin-und Chemokin-Produktion, pathogen-Aufnahme, und die Tötung durch oxidative und nicht-oxidative michchanismen 3. Neben ihrer allgemein anerkannten Rolle in der angeborenen Immunität, haben Neutrophilen auch vor kurzem gezeigt, dass eine wichtige Rolle als Initiatoren der effektiven adaptive Immunantworten 4 spielen. Auf der anderen Seite, abgesehen von ihrer protektiven Immunität in Rollen kann auch Neutrophile vermitteln Gewebeverletzung und Immunpathologie durch übermäßige Akkumulation und / oder Aktivierung an entzündeten Stellen, wie sie in einer Vielzahl von Infektions-und Autoimmunerkrankungen 5-7 gezeigt. Trotz der unverzichtbaren Rolle der Neutrophilen bei der Montage wirksam angeborenen Immunantwort und ihre pleiotropen Effektor-Funktionen in mehreren Infektionskrankheiten und Entzündungen, technische Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle hat die Forschung mit neutrophilen Granulozyten in den letzten Jahrzehnten behindert. Daher sollte die Verwendung von reproduzierbaren Tests zur Isolierung von Neutrophilen weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelte Immunologie erleichterngischen Funktionen ex vivo und in vivo. Bisher wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen wie Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut und Maus Blut oder Knochenmark 8,9, positive oder negative immunomagnetische Anreicherung von Neutrophilen Maus Blut oder Knochenmark 10,11 beschrieben wurde, und das Ernten von Neutrophilen aus der Peritonealhöhle von Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Thioglycolat oder andere entzündungshemmende Mittel 12. Obwohl Neutrophilen kann leicht in großen Stückzahlen aus menschlichem Blut isoliert werden, ist diese Methode nicht optimal in den Mäusen infolge des geringen Volumens Mäuseblut die Isolierung von Neutrophilen ausreichend für funktionelle Studien oder adoptiven Transfer Experimente 13 ausschließt. Darüber hinaus, obwohl die Ausbeute an Thioglycolat-induzierte Zellen aus der Bauchhöhle größer ist verglichen mit der Maus Blut variiert die Reinheit von Neutrophilen in den entzündlichen Peritoneallavage zwischen60-90%, und die isolierten Neutrophilen zeigen einen aktivierten Phänotyp. Somit erfasst die Zellen unter Verwendung dieses Verfahren nur zur Durchführung funktionelle Untersuchungen aktivierten verwendet werden, nicht aber von nicht stimulierten Neutrophilen, die Maus Bauchhöhle wenigen Neutrophilen im stationären Zustand 12. Stattdessen wird das Knochenmark ein bequemer Reservoir für die Ernte eine große Zahl von entweder stimulierten oder aktivierten Neutrophilen 11,14, die dann stromabwärts funktionellen Studien wie Phagozytose Tötung und Degranulation oder für die adoptive Transfer in Empfänger-Mäuse verwendet werden. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (~ 2 Stunden)-Protokoll, das eine hohe Ausbeute liefert (~ 6-12 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus oder bis zu 30-40 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus) reines (80 -95%) Neutrophilen mit&gt; 95% Rentabilität aus dem Knochenmark. Diese Methode verwendet handelsübliche Histopaque, die Dichtegradienten Zelle getrennt sindRation Medien aus Ficoll und Natriumdiatrizoat, an Neutrophile aus dem Knochenmark von Mäusen zu trennen. Dieses Verfahren ergibt wesentlich größere Anzahl von Neutrophilen pro Maus im Vergleich zu Blut oder Bauchhöhle, kann es verwendet werden, um Neutrophile von Mäusen sowohl im stationären Zustand oder nach der Infektion gesammelt werden, und es ist einfacher zu Schicht im Vergleich zu der Dichtegradientenzentrifugation Verfahren die diskontinuierliche verwendet Percoll Gradienten, bestehend aus 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Darüber hinaus werden die Zeit und die Ressourcen, die zur reinen Neutrophilen sammeln signifikant im Vergleich zu Neutrophilen Trennung mittels Fluorescence-Activated Cell Sorting verringert. Da auch dieses Verfahren nicht auf einer immunomagnetischen Anreicherungsschritt ist es kostengünstiger und vermeidet die Exposition von Zellen gegenüber der magnetischen Spalte und Antikörper, dh verringert die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung von Neutrophilen. Zusätzlich zur Durchführung funktionelle Studien an isolierten neutrophils ex vivo und adoptiven Transfer von Zellen in Empfängermäuse, dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Kennzeichnung von isolierten Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe. Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe können im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien für die Verfolgung der übertragenen Neutrophilen im Gewebe des Empfängers Mäusen mittels Durchflusszytometrie, die mechanistischen Einblick in die direkte Rolle bestimmter Gene kann in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut angepasst werden Ziel in entzündeten Organen 6.

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 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen &#39;Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .

Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden. Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzelle...

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Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K Aufrufe.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Serie: Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.