نشكر الدعم السخي من العديد من المؤسسات والجهات المانحة الخيرية (انظر SakmarLab.org).

1. التأسيس الوراثية موقع معين من الأحماض الأمينية غير طبيعي في GPCRs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا HEK293T في DMEM (4.5 غرام / لتر من الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل الخلايا نمت لالتقاء 60-80٪ في لوحة 10 سم باستخدام Lipofectamine زائد كاشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى 750 ميكرولتر DMEM، إضافة 10 ميكرولتر كاشف زائد، 3.5 ميكروغرام من [كدنا] النوع من الاختزال (pMT4. رو أو pcDNA 3.1. CCR5) التي تحتوي على العنبر وقف رامزة في الموضع المطلوب، 3.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النووي النقال القامع كدنا] (pSVB.Yam) و 0.35 ميكروغرام من متحولة الأمينية أسيل الحمض الريبي النووي النقال مخلقة [كدنا] لف azido-L-ألانين (pcDNA.RS). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أداء أيضا ترنسفكأيشن مماثلة باستخدام وزن النوع من الاختزال كدنا] (لا تحتوي على وقف كودون العنبر) لتكون بمثابة السيطرة. إضافة هذا الخليط إلى 750 ميكرولتر من DMEM مع 17 ميكرولتر Lipofectamine. بعد توازنه 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجلبالحجم الإجمالي إلى 4 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق وسائل الاعلام نضح في 10 سم لوحة، وخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا، والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. بعد 4-6 ساعة، تكملة الخلايا مع 4 مل DMEM تحتوي على 20٪ FBS و 1 ملي ايه زد اف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واستبدال وسائط النمو مع DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لتحليل التعبير أو الشروع في إجراءات photocrosslinking أو وضع العلامات الموضحة في المقاطع التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد التعبير عن العنبر متحولة النوع من الاختزال في وجود UAA في وسائل الإعلام النمو. ونحن نفعل ذلك من خلال الكشف طخة مناعية الغربية. ليز بيليه خلية في 1٪ (ث / ت) دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 XG وطاف حل في إطار الحد من الظروف التي كتبها SDS-PAGE. نقل إلى غشاء PVDF وإجراء تحليل لطخة مناعية للكشف عن كامل طول مستقبلات التعبير باستخدام ال31 ه 1D4 خريطة موقع (مركز زراعة الخلايا الوطني)، الذي يعترف حاتمة هندسيا في C-محطة من مستقبلات. </li></ol></li></ol> 2. تعيين موقع ملزم يجند طريق المستهدفة Photocrosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ووسائل الإعلام نضح من الخلايا واستبدالها مع 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). العودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى أنبوب فالكون. أجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة لخلايا بيليه ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في التخزين المؤقت محلول الملح 1X هانك تحتوي على 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 0.2٪ BSA ويجند معالج بالتريتيوم في تشبع تركيز ملزمة لطول المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لضمان تشكيل مستقبلات يجند المعقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى 24 أو 96 جيدا جيدا لوحة لتنشيط ضوئي من 365 نانومتر في ايه زد اف (مثل استخدام الأشعة فوق البنفسجية مصباح) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. Maintaiن لوحة على الجليد لتجنب التدفئة العينة وتحلل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف، أجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه، وإزالة طاف، والشروع في التحليل. ويمكن تخزين الكريات في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والكريات خلية في تحلل العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DDM، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 ومثبطات الأنزيم البروتيني. بعد حضانة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي المحللة خلية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج، ونقل طاف لأنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خريطة موقع 1D4-2B sepharose و الراتنج لطاف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لimmunopurify النوع من الاختزال باستخدام المهندسة C-محطة 1D4 خريطة موقع حاتمة. اليوم التالي تغسل حبات عدة مرات مع العازلة تحلل. عينات أزل مع 1٪ SDS عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء من شاطف إلى 15 مل قارورة تحتوي على السائل التلألؤ والاعتماد على عداد التلألؤ بيتا لقياس كمية ملزمة محددة من يجند معالج بالتريتيوم إلى عشرةه مستقبلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المتبقية 1D4 ماب شاطف تنقيته بواسطة معيار الكهربائي للهلام. نستخدم 4-12٪ هلام SDS-PAGE ثم نقل شبه جافة لغشاء PVDF لimmunoblotting. نحن تشمل أيضا حارة مع معيار البروتين سلم لتوجيه التقريب البصري من الوزن الجزيئي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع غشاء PVDF مع الحليب 5٪ في المخزن TBS تحتوي على 0.05٪ توين 20. بحث الغشاء لتأكيد كامل طول مستقبلات التعبير مع 1D4 ماب تليها HRP، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج مع تعزيز لمعان كيميائي (ECL) كاشف وفضح غشاء لتصوير الإشعاع الذاتي لتصور فيلم العصابات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الغشاء بشفرة حلاقة لفصل كل حارة العينة، تليها قطع عند علامات محددة الوزن الجزيئي. نقل شرائح الغشاء إلى قارورة تحتوي على السائل التلألؤ. تحديد كمية التريتيوم في كل جزء الغشاء عن طريق عد على عداد بيتا التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إيجابيةphotocrosslink مع الكشف عن التريتيوم في الكتلة الجزيئية واضح يساوي مجموع تلك من النوع من الاختزال ويجند. </li></ol> 3. استهدفت توصيف حاتمة وخلية السطح انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع 1 مل برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين مع 1 مل 0.25٪ التربسين لمدة 3 دقائق. تكملة مع 9 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 0.5 ملي ايه زد اف. الخلايا resuspend وحساب كثافة الخلية. نستخدم عدادة الكريات القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل علاج، واضحة من أسفل لوحة 96 جيدا عالية ملزم مع 100 مل من 0.01 ملغ / مل بولي-D-يسين لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرارا مع برنامج تلفزيوني 1X والهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 200 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في مناطق ذات كثافة من 6 × 04 حتي 08 أكتوبر × 10 4 خلية / جيدا لوحة 96 جيدا والعودة إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي إعداد الخلايا لوصفها. بلطف يغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / جيد برنامج تلفزيوني 1X رس إزالة أي ايه زد اف تحتوي على وسائط النمو. ضمان بقاء الخلايا الالتزام، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم 2 + 2 + والمغنيسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50-200 ميكرومتر FLAG-triarylphosphine وضع العلامات الكاشف في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني من مخزون الحفاظ على 5-20 ملم في برنامج تلفزيوني. تطبيق 60 مل إلى كل بئر (في ثلاث نسخ لكل متحولة العنبر) والعودة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات. الحفاظ على مجموعة من الآبار دون علاج التسمية في 1X HBSS / برنامج تلفزيوني. وتشمل أيضا التحكم بالوزن النوع من الاختزال للمقارنة مع المتغيرات AZF-النوع من الاختزال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة، BB (1X PBS، 0.5٪ BSA)، لإزالة التسمية غير المتفاعل تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 100 ميكرولتر / جيد من 4٪ بارافورمالدهيد (أعدت من الأسهم 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات مع BB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ معيار بروتوكول ELISA سطح الخلية للكشف عن مستقبلات مستقبلات صفت والتعبير. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ل1.5 ساعة على الجليد تليها الثانويةالحضانة tibody في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة FLAG M2 الأجسام المضادة (مثل 1:2،000 التخفيف من الأجسام المضادة المحرز في BB) للكشف عن FLAG الببتيد حاتمة من FLAG-triarylphosphine وضع العلامات كاشف. كما بحث غير تسمية الآبار تعامل على أنها سيطرة سلبية. إضافة لمكافحة CCR5 2D7 (نستخدم 1:500 تمييع) الأجسام المضادة لمجموعة منفصلة من الآبار لتحديد وزن أو AZF-النوع من الاختزال التعبير سطح الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات مع BB، واحتضان مع 100 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية، مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد الثانوية (1:2،000 التخفيف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا بعناية خمس مرات مع BB. إضافة 50 ميكرولتر العازلة الكشف: Amplex الأحمر، 20 ملي H 2 O 2، برنامج تلفزيوني 1X (نسبة 1:10:90)، واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع البيانات الطيفية على مضان متعددة كذلك قارئ لوحة في السابق λ = 530 م وλ = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal الفلورسنت وصفها من GPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز10 7 خلايا تحصد معربا عن بالوزن أو AZF-رودوبسين المتغيرات في 1 مل الانحلالية العازلة التي تحتوي على 1٪ (ث / ت) DM، 50 ملي HEPES أو تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 مم CaCl 2 ومثبطات الأنزيم البروتيني ل1 ساعة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة، وجمع الكسر طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر 1D4-MAB الراتنج sepharose و 2B لالتقاط مستقبلات باستخدام المهندسة C محطة 1D4 حاتمة. احتضان لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الراتنج ثلاث مرات مع 0.1٪ (ث / ت) في DDM 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1 ملي فلوريسئين-الفوسفين في إجمالي حجم 0،3-0،5 مل لتسمية مستقبلات يجمد على مصفوفة immunoaffinity (1D4-MAB sepharose و 2B). احتضان لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي وإزالة طاف. غسل الراتنج لإزالة التسمية غير المتفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مستقبلات المسمى مع العازلة 100 مل شطف تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) DDM و 0.33 ملغ / مل ببتيد تساعي (C9 الببتيد ضد حاتمة 1D4)في 2 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.0 قبل الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحل عينات صفت من قبل SDS-PAGE تحت ظروف الحد. غسل المواد الهلامية لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ومن ثم تصور وسم ايه زد اف-النوع من الاختزال بواسطة مضان في هلام. على سبيل المثال، استخدام الماسح الضوئي مضان مبائر مع 488 نانومتر طول الموجة الليزر للكشف عن مستقبلات تعديل مع فلوريسئين. </li></ol>

<ol>
	<li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors:+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery.">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li><li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states.">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists.">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+eukaryotic+genetic+code.">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis.">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li><li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes.">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes.">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li><li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin.">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li><li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal.">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li><li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes.">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li><li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal.">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li><li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5.">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li><li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li><li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli.">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li><li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid.">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li><li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+(GPCR)+using+genetically+encoded+photocrosslinkers.">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li><li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor.">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li><li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy.">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li><li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies:+application+to+GPCR+oligomerization.">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li><li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escaping+the+flatlands:+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes.">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li><li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation.">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strain-promoted+[3+++2]+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems.">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li><li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery.">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li><li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin:+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure.">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+&#197;+crystal+structure.">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 &#197; crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li><li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups.">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , (2013).</li><li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid.">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin:+characterization,+cross-reactivity,+and+application+as+structural+probes.">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li><li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor.">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li><li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+structure,+dynamics,+and+activation:+A+perspective+from+crystallography,+site-directed+spin+labeling,+sulfhydryl+reactivity,+and+disulfide+cross-linking.">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li><li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking:+use+of+a+photoactivatable+reagent.">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzophenone+photophores+in+biochemistry.">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation.">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li><li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)+lysine+for+site-specific+protein+modification.">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry &amp; biology. 15, 1187-1197 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا 32، 33 أو رب...

تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. 1، 2 وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. 3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تكييفها طريقة لموقع تحديدا إدخال غير الحكومية أو الحد الأدنى تحقيقات إقلاق إلى المستقبلات التي أعرب عنها على أساس الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAA) الطفرات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع رائدة من قبل شولتز وجoworkers. 6 ونحن الأمثل منهجية الطفرات UAA لتحقيق التعبير ذات الإنتاجية العالية ونظام الطفرات للبروتينات مثل GPCRs، التي يصعب التعبير عنها في أكثر الأنظمة الأخرى مغاير من خلايا الثدييات. باستخدام القامع المهندسة متعامد الحمض الريبي النووي النقال وتطورت أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال الزوج مخلقة لUAA محددة، قدمنا ​​موقع UAAs تحديدا في GPCRs الهدف التعبير عنها. إدماج الناجح لUAAs، ف الاسيتيل-L-ألانين (ACF)، فقد ثبت ف بيروكسايد-L-ألانين (BzF)، وف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في GPCRs نموذجنا - رودوبسين والبشرية CC مستقبلات chemokine، CCR5. 7، 8 من حيث المبدأ، وهي UAA يمكن ترميز وراثيا في أي موقف داخل تسلسل البروتين وهذه الخاصية هي أداة لا تقدر بثمن البيوكيميائية، لأنها تتيح احد كودون مسح وGPCR الهدف. ونحن نركز هنا على وجه التحديد على براعة من UAA، ايه زد اف، التي لديها رد الفعل عزيالقيام شاردة. بالإضافة إلى بمثابة الأشعة تحت الحمراء (IR) التحقيق فريدة من نوعها، 8، 9 ايه زد اف يمكن أيضا أن تكون بمثابة photoactivatable عبر رابط نتيجة للتفاعل مع الأمينات الأولية المجاورة أو الهيدروجين الأليفاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة azido خاملة بيولوجيا المشاركة بصفة انتقائية مقبض الكيميائية في التفاعلات وضع العلامات bioorthogonal. نحن هنا تقديم أمثلة توضح التطبيقات المفيدة التأسيس في مواقع محددة من AZF في GPCRs، مثل photocrosslinking تستهدف فخ مجمع مستقبلات يجند، وتعديل GPCRs بواسطة bioorthogonal علامات حاتمة واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية. وقد استخدمت الكواشف Photoactivatable لدراسة النظم البيولوجية منذ 1960s. (10) وفي هذه الفترة، تم الإبلاغ عن وفرة من التجارب يشابك مستقبلات يجند لدراسة المجمعات النوع من الاختزال، ومعظمها ينطوي على استخدام بروابط photoaffinity 11، 12 ومع ذلك، فإن هذه تطبيقات تقتصر من الناحية الفنية، لأنها تحتاج اليهاالتوليف (ه) من بروابط تحمل مجموعة يشابك. 13-15 وعلاوة على ذلك، مع شاردة crosslinker في يجند، فإنه يمثل تحديا لتحديد موقع تشعبي على النوع من الاختزال. إدخال موقع تحديدا الجماعات photocrosslinking كما UAAs إلى بروتينات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع هو النهوض قيمة 16، 17 طورنا تقنية photocrosslinking التعرف على واجهة ملزمة للمستقبلات التي تشارك في تشكيل مجمع مستقبلات يجند في الخلايا الحية من خلال إدخال مجموعات عطوب بالضوء في GPCRs 18، 19 نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي وطريقة تحليل البيانات لتطبيق هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد موقع ملزمة ليجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، على CCR5. تستفيد هذه الطريقة على تقدير دقيق للمقبض المشعة على يجند، بالإضافة إلى الإبقاء على التركيبة الكيميائية الأم ليجند. التقنيات المعتمدة مضان دعم فهم دقيق لأساس الهيكلية للتنشيط مستقبلات عن طريق التحقيق مباشرة بتكوين الدولة من مستقبلات 20، 21 ومع ذلك، وتقنيات امتلاك المرونة اللازمة لإدخال العلامات الفلورية في GPCRs هي موقع على وجه التحديد محدودة. ونحن مهتمون في توظيف استراتيجيات التعديل الكيميائي لتيسير كشف bioorthogonal واحدة جزيء (SMD) من النوع من الاختزال المجمعات الإشارة. يمكن 22 المجموعة azido المشاركة في كيمياء bioorthogonal مثل شتاودينغر-Bertozzi ربط، 23، 24 خالية من النحاس وروجت سلالة أزيد- إضافة حلقية آلكاين (SpAAC) 25 والمحفزة النحاس وأزيد آلكاين إضافة حلقية (CuAAC) 26 ونحن نركز هنا على ربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi التي تنطوي على ردة فعل معينة بين أزيد والفوسفين. ونحن لشرح استخدام اثنين من المشتقات الفوسفين مختلفة، مترافق إلى حاتمة الببتيد (FLAG الببتيد) أو تسمية الفلورسنت(فلوريسئين) لتحقيق تعديل في مواقع محددة من GPCRs. نحن الأمثل سابقا الظروف لوضع العلامات الخاصة بكل موقع من رودوبسين ايه زد اف المتغيرات باستخدام التركيب البلوري للأشعة السينية والمحاكاة الديناميكية لاختيار المواقع المستهدفة التي هي المذيبات يتعرض 27، 28 ونحن أيضا يتضح جدوى لتحقيق وضع العلامات خالية من الخلفية بواسطة شتاودينغر- Bertozzi ربط 29 نظهر هنا للإجراءات العامة المستخدمة لتحقيق وضع العلامات الفلورية من مستقبلات المنظفات solubilized الذي يجمد على مصفوفة immunoaffinity وبعد ذلك تصور من قبل مضان في هلام. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على تمديد مفيدة عن هذه الاستراتيجية ووضع العلامات لتحديد مواقف قابلة للوضع العلامات على مستقبلات الهيكل غير معروف، CCR5. ويتم ذلك من يستخدم إستراتيجية علامات الببتيد حاتمة المستهدفة التي تعتمد على تعديل bioorthogonal من AZF-النوع من الاختزال المتغيرات في شكل شبه عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا. هذا 30طريقة يستغل متعددة الخطوات خصائص الكشف عن ELISA سطح الخلية لرصد الأحداث ووضع العلامات. المنهجيات نناقش هنا هي عامة ومن حيث المبدأ يمكن تطبيقه على أي النوع من الاختزال تدمج مع ايه زد اف باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. في البروتوكولات المعروضة هنا نحن بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير خلايا الثدييات مستقبلات تدمج مع UAAs مثل ايه زد اف باستخدام طريقة غير طبيعية من الأحماض الأمينية الطفرات وتطبيقاتها اللاحقة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للGPCRs.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pSVB. Yam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2009)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Plus</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine: 18324-012 
			Plus: 11514-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>azF is activated by 365-nm light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3117405001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium-labeled ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From collaborator (Grunbeck et al., 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD apparatus</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Apparatus for semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powered milk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9934262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint A</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-273</td>
			<td>Scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>333726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Beta-Scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td>
			<td>National Cell Culture Center</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyblot CL AR film</td>
			<td>Denville</td>
			<td>E3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Targeted photocrosslinking materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-triarylphosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GPHOS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CCR5 2D7 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3601</td>
			<td>Clear bottom, high binding EIA/RIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>DE Healthcare Products</td>
			<td>97-93399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Perseptive Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-phosphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Huber et al., submitted 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonapeptide (C9 peptide)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>62190</td>
			<td>Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Scanner with 488-nm wavelength laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Fluorescent labeling materials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors

لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.

استخدمنا منهجية الطفرات الأحماض الأمينية غير طبيعي للموقع تحديدا تقديم تحقيقات الجزيئية إلى النوع من الاختزال باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. المخطط في الشكل 1 يحدد الخطوات البارزة لمنهجية وتطبيقات مختلفة من دمج UAA تنوعا، ف azido-L-ألانين (ايه زد ا...

Watch this Scientific Journal Video about Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  The Rockefeller University.  نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواق...

Video: Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

الزراعة المائية: نظام تنوعا لدراسة الغذائية تخصيص ومصنع الردود على توافر المواد الغذائية والتعرض للعناصر السامة

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...