אנו מודים לתמיכתם הנדיבה של כמה קרנות ותורמים פילנתרופיים (ראה SakmarLab.org).

1. התאגדות גנטית אתר ספציפי של חומצות אמינו לא טבעיים לGPCRs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HEK293T בDMEM (4.5 גר &#39;/ L של גלוקוז, 2 גלוטמין מ&quot;מ) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים מבוגרים כדי מפגש 60-80% בצלחת 10 ס&quot;מ באמצעות מגיב Lipofectamine פלוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל750 DMEM μl, להוסיף 10 μl פלוס מגיב, 3.5 מיקרוגרם של GPCR cDNA (pMT4. Rho או pcDNA 3.1. CCR5) המכיל את קודון עצירת הענבר במיקום רצוי, 3.5 מיקרוגרם של מדכאי tRNA cDNA (pSVB.Yam) ו0.35 מיקרוגרם של cDNA מוטנטי אמין acyl tRNA synthetase עבור p-azido-L-פנילאלנין (pcDNA.RS). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. גם לבצע transfection דומה באמצעות WT GPCR cDNA (שאינם מכיל קודון עצירת ענבר) לשמש כביקורת. להוסיף את התערובת ל750 μl של DMEM עם 17 Lipofectamine μl. לאחר equilibrating 15 דקות בטמפרטורת חדר, להביא אתנפח הכולל עד 4 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב על צלחת 10-סנטימטר, להחיל תערובת transfection לתאים, ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה. אחרי 4-6 שעות, להשלים את התאים עם 4 מיליליטר DMEM המכיל FBS 20% לבין 1 מ&quot;מ azF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את תקשורת הצמיחה עם DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ&quot;מ azF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים 48 שעות שלאחר transfection, לנתח ביטוי או להמשיך לנהלי photocrosslinking או תיוג המתואר בסעיפים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר ביטוי של המוטציה ענבר GPCR בנוכחות UAA בתקשורת הצמיחה. אנו עושים זאת על ידי זיהוי immunoblot המערבי. Lyse התא גלולה ב 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ב20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ&quot;מ NaCl עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate XG 16,000 ולפתור את supernatant תחת הפחתת תנאים ידי-SDS. העברה לקרום PVDF ולבצע את ניתוח immunoblot לזהות ביטוי הקולטן באורך מלא באמצעות הדואר 1D4 מב (Cell הלאומי מרכז תרבות), אשר מזהה אפיטופ מהונדס בC-הסופית של הקולטן. ביום 31 </li></ol></li></ol> 2. מיפוי אתר קישור ליגנד שימוש Photocrosslinking ממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר transfection 48 שעות, מדיה לשאוב מהתאים ולהחליף עם 4 מיליליטר 1x בופר פוספט (PBS). חזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 1x PBS ולהעביר לצינור פלקון. צנטריפוגה ב 1,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות עד גלולה התאים ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה שבנאגרו תמיסת מלח של 1x האנק מכיל 20 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5, BSA 0.2% ויגנד tritiated בלהרוות ריכוז מחייב לאורך הנדרש של זמן וטמפרטורה על מנת להבטיח היווצרות מורכבת קולטן ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא לצלחת 24 גם או 96 היטב לphotoactivation של azF ב365 ננומטר (למשל להשתמש UV-מנורה) ל15 דקות ב 4 ° C. Maintain את הצלחת על קרח, כדי למנוע חימום מדגם ותמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור Eppendorf, צנטריפוגות כדי גלולה התאים, להסיר את supernatant ולהמשיך לניתוח. ניתן לאחסן את כדורים ב-20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי התא במאגר תמוגה המכילים 1% (w / v) DDM, 20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 ומעכבי פרוטאז. לאחר דגירה 1-HR ב 4 ° C, צנטריפוגה lysate התא 10 דקות ב 16,000 XG, ולהעביר את supernatant לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שרף 2B מב-sepharose 1D4 לsupernatant ו דגירה הלילה ב 4 ° C כדי immunopurify GPCR באמצעות epitope 1D4 מב C-הסופית המהונדס. למחרת לשטוף את החרוזים כמה פעמים עם חיץ תמוגה. דגימות Elute עם SDS 1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר חלק מeluent לבקבוקון המכיל נוזל נצנץ 15 מיליליטר ולסמוך על מונה נצנץ בטא לכמת את כמות המחייב הספציפי של ליגנד tritiated הקולט דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור את eluent מטוהר 1D4 מב שנותר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אנו משתמשים ב4-12% ג&#39;ל SDS-PAGE ולאחר מכן העברת חצי יבשה לקרום PVDF לimmunoblotting. אנו גם מסלול עם סולם חלבון סטנדרטי להנחות קירוב חזותי של משקל מולקולרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את קרום PVDF עם חלב 5% ב TBS חיץ המכיל 20-Tween 0.05%. לחקור את הקרום כדי לאשר ביטוי הקולטן באורך מלא עם 1D4 מב ואחרי שני נוגדנים אנטי העכבר IgG HRP-מצומדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק עם chemiluminescence המשופרת מגיב (ECL) ולחשוף את הקרום לautoradiography סרט לדמיין להקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקרום בסכין גילוח כדי להפריד בין נתיב לדוגמה, ואחריו על ידי חיתוך בסמני משקל מולקולריים ספציפיים. העבר את מקטעי קרום למבחנות המכילות נצנץ נוזל. לכמת את הכמות של טריטיום בכל מגזר קרום על ידי ספירה על דלפק בטא נצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את חיוביphotocrosslink עם זיהוי של טריטיום במסה המולקולרית לכאורה שווה לסכום של זו של GPCR ויגנד. </li></ol> 3. ממוקד Epitope תיוג ותא שטח צמוד לאנזים immunosorbent assay (ELISA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות שלאחר transfection, לשטוף תאים עם 1 מיליליטר 1x PBS וtrypsinize עם טריפסין 1 מיליליטר 0.25% במשך 3 דקות. להשלים עם 9 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS ו0.5 מ&quot;מ azF. Resuspend תאים ולספור את צפיפות התאים. אנו משתמשים hemocytometer סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לטפל צלחת מחייב גבוהה, ברורה תחתון 96 היטב עם של 0.01 מ&quot;ג / פולי-D-ליזין מיליליטר לכל טוב 100 מיליליטר. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף שוב ושוב עם 1x PBS ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 200 μl של תאי transfected בצפיפות של 6 x 04-8 אוקטובר x 10 4 תאים / היטב לצלחת 96 היטב ולחזור ל37 ° C ב 5% CO 2 אווירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת להכין את התאים לתיוג. לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 100 μl / גם לא PBS 1xo להוציא מדיה מצמיחה המכילה azF. ודא תאים נשארים דבקים, למשל, באמצעות PBS המכיל Ca 2 + ו Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50-200 מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine מיקרומטר ב1x HBSS / PBS ממניות נשמרו ב5-20 מ&quot;מ ב-PBS. החל 60 מיליליטר היטב כל אחד (בשלושת עותקים עבור כל מוטציה כתומה) ולחזור ל37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 4 שעות. שמור על סט של בארות ללא טיפול תווית ב1x HBSS / PBS. כמו כן כולל שליטת GPCR WT להשוות עם גרסאות azF-GPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים 3 פעמים עם 100 μl / טוב של חיץ חסימה, BB (1x PBS, BSA 0.5%), כדי להסיר את תווית unreacted לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 100 μl / טוב של paraformaldehyde 4% (שהוכן ממניות 16% ב 1x PBS) לתאים. דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף שלוש פעמים עם BB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פרוטוקול ELISA תא השטח סטנדרטי כדי לזהות קולט שכותרתו וביטוי הקולטן. דגירה עם נוגדן ראשוני ל1.5 שעות על קרח ואחרי משנייםהדגירה tibody בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של נוגדן אנטי הדגל M2 100 μl (דילול למשל 1:2,000 של נוגדנים שנעשה בBB) כדי לזהות epitope פפטיד דגל של מגיב תיוג FLAG-triarylphosphine. גם לחקור בארות מטופלים שאינם תווית כביקורת שלילית. הוספה אנטי CCR5 2D7 (אנו משתמשים 1:500 דילול) נוגדן לקבוצה של בארות נפרדת כדי לקבוע WT או ביטוי פני תא azF-GPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם BB, ודגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי העכבר IgG המשני (1:2,000 דילול) 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות תאים חמש פעמים עם BB. הוסף חוצץ איתור 50 μl: Amplex אדום, 20 מ&quot;מ H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 יחס) ו דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. לאסוף נתונים ספקטרליים על קורא צלחת רב גם הקרינה באקס λ = 530 וλ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal תיוג פלורסנט של GPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse10 7 תאים שנקטפו להביע WT או azF-Rhodopsin גרסאות במאגר solubilization 1 מיליליטר המכיל 1% (w / v) DM, 50 HEPES מ&quot;מ או טריס-HCl, pH 6.8, 100 mM NaCl, 1 מ&quot;מ CaCl 2 ומעכבי פרוטאז ל1 שעות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב15,000 XG עבור 10 דקות ולאסוף את החלק היחסי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl שרף 2B sepharose 1D4-מב ללכוד קולט באמצעות epitope 1D4 הסופית C המהונדס. דגירה עבור שעה 12 ב 4 ° C. שטוף את השרף שלוש פעמים עם 0.1% (w / v) DDM במאגר M 0.1 פוספט נתרן, pH 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.1 מ&quot;מ והעמסת-phosphine בנפח כולל של 0.3-0.5 מיליליטר לתייג קולט משותק על מטריצת immunoaffinity (2B sepharose 1D4-מב). דגירה של 12 שעה בטמפרטורת חדר. צנטריפוגה ולהסיר supernatant. שטוף את השרף להסרת תווית unreacted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute קולט שכותרתו עם חיץ elution 100 מיליליטר מכיל 0.1% (w / v) DDM ו0.33 מ&quot;ג / מיליליטר nonapeptide (פפטיד C9 נגד אפיטופ 1D4)ב2 חיץ פוספט מ&quot;מ, pH 6.0 על ידי דגירה על קרח במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור דגימות שכותרתו ידי-SDS תחת הפחתת תנאים. שטוף ג&#39;לים לזמן קצר ב PBS ולאחר מכן לדמיין את התיוג של azF-GPCR על ידי הקרינה בג&#39;ל. לדוגמא, השתמש בסורק הקרינה confocal עם לייזר באורך גל 488 ננומטר כדי לזהות קולט שונה עם והעמסת. </li></ol>

<ol>
	<li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors:+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery.">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li><li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states.">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists.">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+eukaryotic+genetic+code.">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis.">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li><li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes.">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li><li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes.">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li><li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin.">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li><li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal.">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li><li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes.">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li><li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal.">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li><li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5.">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li><li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4.">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li><li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli.">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li><li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid.">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li><li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+(GPCR)+using+genetically+encoded+photocrosslinkers.">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li><li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor.">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li><li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy.">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li><li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies:+application+to+GPCR+oligomerization.">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li><li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escaping+the+flatlands:+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes.">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li><li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation.">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strain-promoted+[3+++2]+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems.">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li><li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery.">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li><li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin:+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure.">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+&#197;+crystal+structure.">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 &#197; crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li><li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups.">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , (2013).</li><li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid.">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin:+characterization,+cross-reactivity,+and+application+as+structural+probes.">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li><li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor.">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li><li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+structure,+dynamics,+and+activation:+A+perspective+from+crystallography,+site-directed+spin+labeling,+sulfhydryl+reactivity,+and+disulfide+cross-linking.">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li><li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking:+use+of+a+photoactivatable+reagent.">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzophenone+photophores+in+biochemistry.">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation.">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li><li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)+lysine+for+site-specific+protein+modification.">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry &amp; biology. 15, 1187-1197 (2008).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

אנו מתארים כאן המתודולוגיה חזקה לשילוב באתר הספציפי של בדיקה תגובתי, azF, לGPCRs ולהדגים שלושה יישומים שימושיים של כלי זה כדי ללמוד את המבנה ודינמיקה של GPCRs. השיטה שלנו לאתר באופן ספציפי לשלב UAAs עוקפת בעיה בסיסית עם אסטרטגיה חלופית המבוססת על תיוג כימי 32, 33 או צירוף p...

קולטנים Heptahelical G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווים superfamily של חלבוני קרום דינמיים מאוד שלתווך אותות תאיים חשובים ומגוונים. בפרדיגמה הקלסית, הפעלת קולטן בשילוב עם שינויי קונפורמציה יגנד-Induced. 1, 2 פיתוחים אחרונים בתחום הביולוגיה מבנית של GPCRs סיפק תובנה משמעותית על המנגנונים המולקולריים של איתות הטרנסממברני. 3-5 עם זאת, כדי להבין בדייקנות כימית גדולה יותר מנגנון תפקודי ודינמיקה מבנית של איתות GPCR, ערכת כלים של גישות נדרש לשלב בדיקות מולקולריות וכימיות אינפורמטיבי לחקור מתחמי איתות פעילים. לשם כך, מתאמנים שיטה לאתר במיוחד להציג את אי - או מינימאלי בדיקות מביכות לקולטניים ביטא מבוססות על חומצת אמינו לא טבעית mutagenesis (UAA) באמצעות ענבר קודון טכנולוגית דיכוי חלוץ העבר על ידי ג שולץ וoworkers. 6 מותאמים המתודולוגיה mutagenesis UAA כדי להשיג מערכת mutagenesis ביטוי תשואה גבוהה ולחלבונים כגון GPCRs, שקשה לבטא במערכות Heterologous ביותר אחרות מאשר בתאי יונקים. שימוש במדכאים מהונדסים מאונך tRNA והתפתח זוג synthetase aminoacyl-tRNA לUAA ספציפי, אנחנו אתר ספציפי הצגנו UAAs בGPCRs היעד לידי ביטוי. השילוב המוצלח של UAAs, p-אצטיל-L-פנילאלנין (ACF), p-בנזואיל-L-פנילאלנין (BzF), ו-p azido-L-פנילאלנין (azF) הוכח בGPCRs המודל שלנו - רודופסין ואנושי קולט chemokine CC, CCR5. 7, 8 באופן עקרוני, UAA ניתן לקודד גנטי בכל מיקום בתוך רצף החלבון ונכס זה הוא כלי רב ערך ביוכימיים כפי שהיא מאפשרת סריקה חד קודון של GPCR יעד. אנו מתמקדים כאן דווקא ברבגוניות של UAA, azF, שבה יש עזי תגובתילעשות מחצית. בנוסף משמש כבדיקה ייחודית אינפרא אדום (IR), 8, 9 azF יכול גם לשמש כמקשר צולב photoactivatable על ידי מגיב עם אמינים ראשוניים שכנים או מימני אליפטי. בנוסף, קבוצת azido אינרטי מבחינה ביולוגית יכולה להשתתף כידית כימית סלקטיבית בתגובות תיוג bioorthogonal. כאן אנו מציגים דוגמאות הממחישות את היישומים השימושיים התאגדות אתר ספציפי של azF לGPCRs, כגון photocrosslinking הממוקד למלכודת מורכבת קולטן ליגנד, ושינוי של GPCRs ידי תיוג epitope bioorthogonal ואסטרטגיות תיוג ניאון. ריאגנטים photoactivatable שימשו ללמוד מערכות ביולוגיות מאז 1960s. 10 בתקופה זו, שפע של ניסויי crosslinking הקולטן ליגנד דווח ללמוד מתחמי GPCR, שרובם כללו שימוש בligands photoaffinity. 11, 12 עם זאת, אלה יישומים טכני מוגבלים, כפי שהם requirסינתזת דואר של ligands נושאת קבוצת crosslinking. 13-15 יתר על כן, עם מחצית crosslinker ביגנד, זה מאתגר לזהות את מיקומו של Crosslink על GPCR. אתר ספציפי בהכנסת קבוצות photocrosslinking כUAAs לחלבונים באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי היא קידום יקר. 16, 17 פיתחנו טכניקת photocrosslinking לזהות את הממשק מחייב את קולטן זה מעורב בהיווצרות קומפלקס הקולטן ליגנד ב לחיות תאים על ידי החדרת קבוצות photolabile לGPCRs. 18, 19 כאן אנו מתארים את הפרוטוקול ושיטת ניתוח נתוני ניסוי ליישום טכנולוגית photocrosslinking ממוקד זה כדי לזהות את אתר הקישור של ליגנד מולקולה קטנה, maraviroc tritiated, על CCR5. שיטה זו מנצלת את הכימות המדויק של הידית רדיואקטיביים ביגנד, בנוסף לשמירה על המבנה כימי יליד יגנד. טכניקות הקרינה מבוססת לתמוך בהבנה המדויקת של הבסיס המבני של הפעלת קולטן ישירות על ידי חיטוט מדינת קונפורמציה של הקולטן. 20, 21 עם זאת, הטכניקות בעל הגמישות להציג תוויות ניאון לGPCRs אתר ספציפיות הן מוגבלות. אנו מעוניינים בהפעלת אסטרטגיות שינוי הכימי bioorthogonal כדי להקל על זיהוי מולקולה בודדת (SMD) של קומפלקסי איתות GPCR. 22 קבוצת azido יכולה להשתתף בתהליכים כימיים bioorthogonal כגון קשירת Staudinger-Bertozzi, 23, 24 אזיד-קידם מתח ללא נחושת חיי בן אשר alkyne (SpAAC) 25 וחיי בן אשר, הייתה זרז נחושת אזיד-alkyne (CuAAC). 26 אנו מתמקדים כאן בתגובת קשירת Staudinger-Bertozzi המערבת את התגובה הספציפית בין אזיד וphosphine. אנו מדגימים את השימוש בשני נגזרי phosphine שונים, מצומדת לאפיטופ פפטיד (פפטיד FLAG) או תווית ניאון(העמסה) כדי להשיג שינוי ספציפי לאתר של GPCRs. אנו מותאמים בעבר התנאים לתיוג ספציפי לאתר של rhodopsin azF גרסאות באמצעות המבנה הגבישי רנטגן וסימולציות דינמיות לבחור אתרי יעד שהם ממס חשוף. 27, 28 אנחנו גם איירנו את ההיתכנות להשגת תיוג ללא רקע בStaudinger- קשירת Bertozzi. 29 אנו מדגימים כאן הנוהל הכללי המועסק על מנת להשיג ניאון תיוג של קולט חומר ניקוי, solubilized כי הוא משותק על מטריצת immunoaffinity ולאחר מכן דמיינו ידי הקרינה בג&#39;ל. בנוסף, אנו מדגימים הארכה שימושית על אסטרטגית תיוג זה כדי לזהות עמדות נוחות לתיוג על הקולטן של מבנה ידוע, CCR5. זו מתבצעת באמצעות אסטרטגית תיוג פפטיד epitope ממוקדת המסתמכת על שינוי bioorthogonal של azF-GPCR גרסאות בפורמט חצי תפוקה גבוהה מבוסס תאים. 30 זהשיטה מנצלת את תכונות זיהוי רב שלבים של ELISA על פני קרום תא כדי לפקח על אירועי תיוג. מתודולוגיות אנו דנים כאן הן כלליות ועקרוניים יכולות להיות מיושמות על כל GPCR משולב עם azF באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. בפרוטוקולים שהוצגו כאן פירוט אנו השלבים כרוכים בביטוי תאים היונקים של קולטנים משולבים עם UAAs כגון azF בשיטה טבעית חומצת אמינו mutagenesis והיישומים הבאים שלהם כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של GPCRs.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pSVB. Yam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Ye et al., 2009)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine Plus</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine: 18324-012 
			Plus: 11514-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-azido-L-phenylalanine</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>6162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td>
			<td>Spectronics Corporation</td>
			<td></td>
			<td>azF is activated by 365-nm light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3117405001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium-labeled ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From collaborator (Grunbeck et al., 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD apparatus</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>Apparatus for semi-dry transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat powered milk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9934262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint A</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-273</td>
			<td>Scintillation fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>333726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Beta-Scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin 1D4 mAb</td>
			<td>National Cell Culture Center</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyblot CL AR film</td>
			<td>Denville</td>
			<td>E3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Targeted photocrosslinking materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLAG-triarylphosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GPHOS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CCR5 2D7 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3601</td>
			<td>Clear bottom, high binding EIA/RIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG</td>
			<td>KPL, Inc.</td>
			<td>474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>DE Healthcare Products</td>
			<td>97-93399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td>Perseptive Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein-phosphine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Huber et al., submitted 2012)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonapeptide (C9 peptide)</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>62190</td>
			<td>Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% (w/v) n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310LA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1D4-sepharose resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td>SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Scanner with 488-nm wavelength laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Fluorescent labeling materials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetically-encoded molecular probes to study g protein-coupled receptors

כדי להקל על מחקרים מבניים ודינמיים של קולטן מצמידים חלבון G (GPCR) איתות מתחמים, גישות חדשות נדרשות להציג בדיקות או תוויות אינפורמטיבי לקולטניים ביטא שלא להפריע פונקצית קולטן. אנחנו השתמשנו בטכנולוגית דיכוי קודון ענבר גנטי לקודד חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין (azF) בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs הביעה heterologously בתאי יונקים. הרבגוניות של קבוצת azido מודגמת כאן ביישומים שונים כדי ללמוד GPCRs בסביבה התאית האם שלהם או בתנאי solubilized חומרי ניקוי. ראשית, אנו מדגימים מבוסס תאי טכנולוגית photocrosslinking ממוקד כדי לזהות את השאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR בי יגנד מולקולה הקטנה שכותרתו טריטיום הוא crosslinked לחומצת אמינו azido גנטי מקודדת. לאחר מכן, אנו מדגימים שינוי ספציפי לאתר של GPCRs ידי reac קשירת Staudinger-Bertozzi bioorthogonaltion כי מטרות קבוצת azido באמצעות נגזרי phosphine. אנחנו דנים באסטרטגיה כללית לתיוג פפטיד epitope הממוקד של החלבונים בממברנה באו לידי ביטוי בתרבות ובזיהוי שלה באמצעות גישת ELISA המבוססת על כל התא. לבסוף, אנו מראים כי azF-GPCRs יכולה להיות מתויגת באופן סלקטיבי עם בדיקות ניאון. מתודולוגיות שנדונו הן כלליות, בכך שהם יכולים באופן עקרוני להיות מיושמים על כל עמדת חומצת אמינו בכל ביטוי GPCR לחקור מתחמי איתות פעילים.

אנחנו מועסקים על המתודולוגיה mutagenesis חומצת אמינו לא טבעית לאתר באופן ספציפי, להציג את הבדיקות מולקולריות לGPCR באמצעות הענבר קודון טכנולוגית דיכוי. ערכה באיור 1 מתארת ​​את הצעדים הבולטים של המתודולוגיה ויישומים השונים של שילוב UAA תכליתי, p-azido-L-פנילאלנין (...

Watch this Scientific Journal Video about Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  The Rockefeller University.  אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי ש?...

Video: Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

הידרופוניקה: מערכה צדדית לחקר תגובות הקצאת צמח מזין לזמינות מזין וחשיפת אלמנטים רעילים

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...