نشكر ديبورا شتودر للمساعدة مع bioprinter. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت منحة اتفاق N ° NMP4-SL-2009-229292.

1. إعداد بولوكسامير 407 الحل إذا كانت متوفرة، نفذ إعداد الحل بولوكسامير في غرفة باردة (4 ° C). إن لم تكن متاحة، ووضع زجاجة في كوب مملوء بالماء المثلج. عند ارتفاع درجات الحرارة في بولوكسامير سوف يكون فوق نقطة الجل ولن يحل بشكل صحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 60 مل من الجليد الباردة حل PBS في زجاجة زجاج ويقلب بقوة باستخدام محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 24.5 غرام من بولوكسامير وإضافتها بكميات صغيرة لPBS الباردة. الانتظار حتى يذوب بولوكسامير جزئيا قبل أن يضيف أكثر من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحرك حل حتى يذوب كل بولوكسامير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة برنامج تلفزيوني الباردة حتى يتم التوصل إلى الحجم النهائي من 100 مل. فإن تركيز النهائي يكون 24.5٪ ث / V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التحريك الحل والسماح لها بقية في 4 درجات مئوية حتى الفقاعات والرغوة في حل اختفت. وسيتم نقل الفقاعات التي محاصرون داخل هلام لعخرطوشة rinter وسوف يؤدي إلى عيوب في قوالب الذبيحه المطبوعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر (مرشح 0.22 ميكرون) الحل مباشرة في خرطوشة الطباعة لإزالة أي جزيئات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسد إبرة. التصفية الخطوة يجب أن يؤديها في غرفة باردة (أو إن لم تكن متاحة مع نصائح تبريد، فلتر الخ) لتجنب التبلور من بولوكسامير في التصفية. الحفاظ على خرطوشة تحميلها في 4 درجات مئوية حتى 30 دقيقة قبل التجربة. </li></ol> 2. إعداد طابعة 3D وكان الطابعة 3D المستخدمة في هذا العمل &quot;BioFactory&quot; من regenHU. الجزء قذف النظام يتكون من عدة أجزاء. وترد خرطوشة تحت الضغط في الجزء العلوي إلى موصل عن طريق محول لور للقفل. الموصل يسد فراغات بين مخرج من خرطوشة ومدخل صمام الملف اللولبي. عند مخرج للصمام الملف اللولبي، والإبر بأقطار مختلفة يمكن استخدامها. هذه المواد هي مقذوف على فرعيإستراتي الذي يقام لمرحلة الانتقال من فراغ. ويصور أجزاء رئيسية من النظام في الشكل 1. النظم القائمة على قذف الأخرى يمكن استخدامها لعملية الطباعة، ويحتاج إلى عملية التحسين الذي يتعين القيام به لكل نظام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صمام الملف اللولبي (فوهة قطرها 0.3 مم) والإبرة (قطرها الداخلي 0.15 مم) في 1.5 مل أنابيب اختبار منفصلة مليئة الماء عالى النقاء ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوتية لتنظيف ساخنة لمدة 30 دقيقة. شطف الصمامات تنظيفها مع الايثانول وتجفيفها بمسدس النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت صمام وابرة في الطابعة وكذلك فارغة، خرطوشة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 3 بار ضغط على النظام وتفجير أي السوائل المتبقية من صمام تثبيت وإبرة مع الهواء المضغوط. لأقطار إبرة صغيرة، فمن المستحسن أن يكون لها مرشح (فلتر حقنة مشتركة، 0.45 ميكرومتر حجم المسام) مثبتة في الخروج من الهواء المضغوط لتجنب دخول الجسيمات الصغيرة التي يمكن أن تسد إبرة. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الضغط وتثبيت خرطوشة محملة بولوكسامير. ينبغي أن تؤخذ في خرطوشة من الثلاجة حوالي 30 دقيقة قبل تركيب خرطوشة وبالتالي فإن بولوكسامير يمكن أن تصل إلى درجة حرارة الغرفة وهلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الضغط 3 بار للنظام والاستغناء بولوكسامير حتى يصل إلى رأس الإبرة ومقذوف في حبلا المستمر. </li></ol> 3. تعظيم الاستفادة من معلمات الطباعة لإنشاء هياكل 3D دقيقة، عملية الطباعة يجب أن يكون الأمثل للمواد المختارة والتركيز. اعتمادا على اللزوجة ونظام الطباعة 3D سيكون لكل مادة تسفر عن حجم صرفها محددة وسماكة الخط لمجموعة ثابتة من المعلمات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع برامج CAD مناسبة (قادرة على إنشاء ملفات ISO من الرسومات)، ورسم خط واحد حول نفس طول الهيكل الذي كنت تنوي طباعتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المجهر الشريحة الزجاجية 25 مم × 75 مم × 1مم أو أي الركيزة الأخرى في الطابعة وضمان الحصول عليها عن طريق تشغيل الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برنامج الطابعة، قم بتعيين صمام الملف اللولبي إلى ارتفاع وتيرة 50 هرتز وضبط الضغط العالي من 3 بار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طباعة طبقة واحدة من خط واحد مع سرعة مرحلة من 300 مم / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليل الضغط حتى يتم الوصول إلى عرض الخط المطلوب. يمكنك أيضا التحكم في وحدة التخزين التي هي مقذوف عبر الوقت الافتتاحية للصمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحد من وتيرة صمام حتى يمكن طباعة أي خط متواصل بعد الآن. اختيار تردد أعلى من هذه القيمة. </li></ol> ملاحظة: بمجرد تحقيق عرض الخط المطلوب وخطوط المستمر، وتحديد الأمثل سرعة مرحلة وسمك طبقة أي رفع الإبرة بعد طبقة واحدة مطبوعة. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طباعة عدة طبقات فوق بعضها البعض ومعرفة ما إذا كانت الإبرة في المكان المناسب فوق الطبقة السابقة بعد عدة طبقات المطبوعة. ضبط سمك طبقة (أسانسير إبرة<html> ) بحيث يتم طباعة كل طبقة على رأس واحد القادم (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليل سرعة مرحلة من المراحل من 300 مم / دقيقة تدريجي بحيث طبقات مقذوف تبدأ وتنتهي في نفس المواقف السابقة ومنها (الشكل 4). سرعات مرحلة عالية جدا تتسبب في المرحلة أن تتحرك قبل المادة مقذوف وقد لمست الطبقة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطباعة الهياكل دعامة اتبع الخطوات 3.1.-3.8.، ولكن بدلا من رسم خط واحد رسم نقطة واحدة. المعلمات إلى التركيز على عند الطباعة الركائز هي الضغط (ينظم سماكة طبقة وقطر عمود من بولوكسامير)، وهي المرة الاولى من صمام (حجم مقذوف) ووقت الإقامة من رأس الطباعة في الموضع حيث تودع الركيزة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تحسين المعلمات، طباعة عدة طبقات من خط ينبغي أن يؤدي إلى جدار صلب، أو في حالة من النقاط، عمود. حفظ المعلمات لاستخدامها لاحقا. </li></ol>&gt; 4. الطباعة وشطف من العفن عكسي استخدام المعلمات وجد أثناء إجراء التحسين من هذه النقطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طباعة البنية الداخلية (هنا هو مجموعة عمود) على شريحة المجهر والزجاج، واتركها لتجف بين عشية وضحاها. هذا أ) يقلل من حجم وسمك الهياكل وب) يوفر التصاق أفضل بين هيكل والركيزة، حتى انطلاقه خلال الردم يمكن تجنبها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع برنامج CAD، رسم الهيكل الذي يتكون من الجدار الخارجي الذي يحيط هيكل كنت تنوي ومزال بعيدا وشغلها. طباعة هيكل مع بولوكسامير. سوف طباعة الجدار يستغرق 6 دقائق. </li></ol> انتباه: الجدار يجب أن تكون مطبوعة 3.5 مم على الأقل بعيدا عن البنية الداخلية بسبب الأبعاد من الإبرة. وإلا فإن الطباعة من الجدار الخارجي سوف يدمر البنية الداخلية <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الذي تريد ردم SACR الخاصقالب ificial مع (هنا الاغاروز 1٪ في الماء منزوع الأيونات). يجب أن يكون الحل الاغاروز درجة حرارة بين 35 درجة مئوية و 45 درجة مئوية. تحت درجة الحرارة هذه، فإن الاغاروز يصلب بسرعة كبيرة جدا؛ أعلاه درجة الحرارة هذه، فإنه قد تدمر الركائز المطبوعة لأن بنية بولوكسامير شأنها أن تخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء القالب ببطء الذبيحه مع حل الردم باستخدام ماصة. وينبغي أن يتم هذا ببطء لتجنب تدمير بنية داخل الجدار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للهلام حل ردم أو تشعبي واعتمادا على البوليمر المستخدمة. في حالة الاغاروز أخذت مكان التصلب عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان القالب الذبيحه تجمعت عليها في حمام الثلج لمدة 10 دقيقة إلى أزل هيكل بولوكسامير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطخة بنية ردم بمنديل ورق وضعه على الزجاج الجديد شريحة المجهر. اضغط على هيكل بعناية على شريحة المجهر والزجاج لتجنب تسرب من هيدروجيل الثالث من الفراغ في الفضاء بينهيكل ردم وشريحة المجهر والزجاج. </li></ol> 5. ملء الفراغات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لملء الفراغات من قبل بولوكسامير مزال غادر، وملء حل البوليمر المقصود في حقنة مزودة إبرة G 30. في هذا المثال، استخدمنا ميتاكريليت الجينات 1٪ في محلول كلوريد الصوديوم 0.15 M مع إضافة 0.05٪ W / V الليثيوم فينيل-2 ،4،6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) و 2.5٪ V / V-488 من اليكسا الفيبرينوجين مترافق . تمت إضافة اليكسا-488 الفيبرينوجين مترافق لأغراض التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photopolymerize البوليمر مع كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية (100 واط، 365 نانومتر، المسافة من الركيزة كان 3.5 سم) لمدة 5 دقائق وصورة بناء باستخدام مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان أو متحد البؤر. </li></ol>

<ol>
	<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+photocrosslinked+Lutrol+hydrogel+for+tissue+printing+applications.">Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications.</a> Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).</li><li>Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+nanoarrays+generated+by+Dip-Pen+Nanolithography.">Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography.</a> Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Mironov, V., Reis, N., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+bioprinting:+a+beginning.">Review: bioprinting: a beginning.</a> Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).</li><li>Odde, D. J., Renn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-guided+direct+writing+of+living+cells.">Laser-guided direct writing of living cells.</a> Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).</li><li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting:+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures.">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).</li><li>Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+mixing+in+three-dimensional+microvascular+networks+fabricated+by+direct-write+assembly.">Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly.</a> Nature. 2, 265-271 (2003).</li><li>Engelhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+2D+protein+microstructures+and+3D+polymer-protein+hybrid+microstructures+by+two-photon+polymerization.">Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization.</a> Biofabrication. 3, 025003 (2011).</li><li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+technology+to+produce+living+tissue.">Printing technology to produce living tissue.</a> Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+promises+and+challenges.">Organ printing: promises and challenges.</a> Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line.">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).</li><li>Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fiber+deposition+of+cell-laden,+viable,+patterned+constructs+for+bone+tissue+printing.">Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing.</a> Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).</li><li>Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+tissue-engineering+constructs,+using+photopolymerizable+hydrogels+and+stereolithography.">Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography.</a> Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).</li><li>Cook, C., Wang, T., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+Printing+of+Enzymes+for+Glucose+Biosensors.">Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors.</a> Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).</li><li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications.">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).</li><li>Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+Glucose+Biosensor+by+Piezoelectric+Inkjet+Printing.">Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing.</a> , 82-85 (2009).</li><li>Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue/organ+building+system.">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> J. Micromech. Microeng. 22, (2012).</li><li>Malmsten, M., Lindman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembly+in+Aqueous+Block+Copolymer+Solutions.">Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions.</a> Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).</li><li>Cebotari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+tissue+engineered+human+heart+valves+using+autologous+progenitor+cells.">Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells.</a> Circulation. 114, I132-I137 (2006).</li><li>Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+application+of+tissue+engineered+vascular+autografts:+clinical+experience.">Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience.</a> Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).</li><li>Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders:+new+possibilities+for+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty.</a> Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).</li><li>Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+reconstitution+of+a+functional+mammalian+urinary+bladder+by+tissue+engineering.">De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering.</a> Nature. 17, 149-155 (1999).</li><li>Wood, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+skin.">Tissue engineering of skin.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).</li><li>Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+tissue+engineering--in+vivo+and+in+vitro+applications.">Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications.</a> Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).</li><li>Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+skin+substitutes.">Tissue engineering of skin substitutes.</a> Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).</li><li>Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+fiction+or+science.">Organ printing: fiction or science.</a> Biorheology. 41, 371-375 (2004).</li><li>Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+organ+printing+2:+fusion+of+cell+aggregates+in+three-dimensional+gels.">Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels.</a> The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).</li><li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li><li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+polymerization:+from+fundamentals+to+biomedical+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature. 11, 768-774 (2012).</li><li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering.">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).</li><li>Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hydrogels+for+bio-printing+applications.">Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).</li><li>He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+fabrication+of+microstructured+chitosan-gelatin+scaffolds+using+rapid+prototyping.">Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping.</a> Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).</li><li>Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+collagen+scaffolds+with+predefined+internal+morphology+made+by+solid+freeform+fabrication.">Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication.</a> Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-demand+three-dimensional+freeform+fabrication+of+multi-layered+hydrogel+scaffold+with+fluidic+channels.">On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels.</a> Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).</li><li>Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+(MMP)+sensitive+PEG+diacrylate+(PEGDA)+hydrogels+with+spatial+variations+in+matrix+properties+direct+vascular+cell+invasion.">Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion.</a> J. Tissue. 6, 302-302 (2012).</li><li>Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerized+poly(ethylene)+glycol+diacrylate+(PEGDA)+microfluidic+devices.">Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices.</a> Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).</li><li>Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+immobilized+RGD+peptide+in+alginate+scaffolds+on+cardiac+tissue+engineering.">The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering.</a> Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).</li><li>Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinked+alginate+hydrogels+with+tunable+biodegradation+rates+and+mechanical+properties.">Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties.</a> Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).</li><li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels.">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).</li><li>D'Arrigo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+methacrylate+derivatives+and+calcium+alginate+interpenetrated+hydrogel+networks+for+biomedical+applications:+physico-chemical+characterization+and+protein+release.">Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release.</a> Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li><li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting.">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+of+collagen/chondroitin+sulfate/hyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering.">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تعلن.

هنا نقدم، لأول مرة، واستخدام البوليمر thermoresponsive لقالب الذبيحه التي يمكن مزال بسرعة في الماء البارد بسبب الانتقال هلام سول من بولوكسامير من ~ 20 درجة مئوية. سرعة العملية برمتها يجعل بولوكسامير مثيرة للاهتمام لخلق السريع للهياكل البوليمر الحيوي الذي لا يمكن طباعتها مع ?...

جعلت نهج هندسة الأنسجة تقدما كبيرا خلال السنوات الماضية فيما يتعلق تجديد الأنسجة والأعضاء البشرية 19،20. ومع ذلك، حتى الآن، والتركيز على هندسة الأنسجة كثيرا ما كان يقتصر على الأنسجة التي لديها بنية بسيطة أو أبعاد صغيرة مثل المثانة 21،22 أو الجلد 23-25. جسم الإنسان، ومع ذلك، يحتوي على العديد من الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد حيث يتم ترتيب الخلايا والمصفوفة خارج الخلية بطريقة محددة مكانيا. لتصنيع هذه الأنسجة، مطلوب تقنية يمكن وضع الخلايا والسقالات المصفوفة خارج الخلية ضمن بناء ثلاثي الأبعاد في مواقع محددة. Bioprinting لديه القدرة على أن تكون هذه التقنية حيث الرؤية من تصنيع الأنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تتحقق 10،11،26-28. يتم تعريف Bioprinting بأنها &quot;استخدام عمليات نقل المواد عن الزخرفة وتجميع يختلط بيولوجياالمواد evant - الجزيئات والخلايا والأنسجة، والمواد الحيوية القابلة للتحلل -. مع منظمة المقررة لإنجاز واحد أو أكثر من الوظائف البيولوجية &quot;4 وهو يشمل العديد من التقنيات المختلفة التي تعمل في مختلف القرارات وجداول الطول، بدءا من قرار اللجنة الفرعية ميكرون من اثنين سوف الفوتون البلمرة 29 إلى قرار من 150 ميكرون إلى 420 ميكرون للطباعة قذف 1،12،30. ليس مادة واحدة أو تركيبة المواد تلبية متطلبات كل طريقة 31. للطباعة البثق، المعلمات الرئيسية هي اللزوجة والوقت دبق 32، حيث اللزوجة العالية ودبق السريع ومرغوب فيه. 3D الطباعة هو الأسلوب الذي يسمح لخلق سهلة من قوالب فداء لخلق هندستها معقدة 30،33،34. ويستند هذا على عملية بناء قالب باستخدام تقنية النماذج الأولية السريعة مثل bioprinter قذف. يتم استخدام قالب الأضاحي إنشاؤهالتشكيل هياكل معقدة من المواد التي يصعب طباعتها بسبب اللزوجة المنخفضة وبطء وقت دبق. الطريقة المعروضة هنا ينطوي على إنشاء قالب الذبيحه التي تتكون من المواد التي يذوب بسرعة في درجة حرارة منخفضة ويمكن أن يكون مقذوف بدقة. كتلة كوبوليمر بولي (جلايكول الإثيلين) 99 بولي (البروبيلين جليكول) 67 بولي (جلايكول الإثيلين) 99 (المعروف أيضا باسم بلورونيك F127 أو بولوكسامير 407) يستوفي هذه المتطلبات. وقد تم بالفعل استخدامه في نسخة معدلة في الطباعة قذف 1، ولكن على حد علمنا، لم يتم استخدامها لطباعة نسخة معدلة في لها بسبب عدم الاستقرار في البيئات السائلة. بولوكسامير 407 يظهر أيضا استجابة السلوك الحراري معكوس 18 أي أن يتحول من هلام لسول على التبريد. الأهم من ذلك، فإنه يمكن أن تكون مطبوعة في هياكل منحنية بشكل تعسفي معقدة مع الدقة العالية جدا. وهذا يسمح للإنشاء هيدروجيل منظم منمنخفض اللزوجة المواد، في هذه الحالة بطيء التبلور الاغاروز، من قبل pipetting الحل في القالب الذبيحه المطبوعة. مزيج من الطباعة القالب الذبيحه مع الدقة العالية وشطف سريع لها من هيدروجيل منظم مسبوكة يجعل من وسيلة سريعة ومرنة لإنشاء قوالب مع هندستها مختلفة دون استخدام قناع أو طابع بقدر ما هو مطلوب منها في أساليب الطباعة الحجرية. هيدروجيل منظم مسبوكة يمكن ملء مع مزيد من مادة أخرى غير مناسبة للطباعة قذف بسبب اللزوجة منخفضة. هذا هو في حالتنا الجينات اللزوجة المنخفضة حل ميتاكريليت. هنا نقدم طريقة thermoresponsive قوالب الذبيحه العكسي لتنميط هيدروجيل باستخدام المثال من مجموعة عمود.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poloxamer (Pluronic F127)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2443</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAD software</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>BioCAD</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alginate methacrylate</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F13191</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>50004</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioprinter</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>Biofactory</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Valve</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>300 &mu;m Nozzel Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>150 &mu;m Inner Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeiss Axioobserver with ApoTome</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Light Source</td>
 <td>UVP</td>
 <td>Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp</td>
 <td>100 W</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

printing thermoresponsive reverse molds for the creation of patterned two-component hydrogels for 3d cell culture

Bioprinting هو التكنولوجيا الناشئة التي جذوره في صناعة النماذج الأولية السريعة. عمليات الطباعة المختلفة يمكن تقسيمها إلى bioprinting الاتصال 1-4 (البثق، وتراجع القلم والطباعة الحجرية الناعمة)، تماس bioprinting 5-7 (نقل إلى الأمام ليزر، ترسب الحبر النفاث) والتقنيات القائمة على الليزر مثل اثنين من الفوتون بلمرة ضوئية المنشأ 8. ويمكن استخدامه في العديد من التطبيقات مثل هندسة الأنسجة 9-13، 14-16 والتصنيع الدقيق جهاز الاستشعار البيولوجي كأداة للرد على أسئلة بيولوجية أساسية مثل التأثيرات من شارك في زراعة أنواع مختلفة من الخلايا 17. خلافا لأساليب الطباعة التصويرية أو لينة الطباعة الحجرية المشتركة، bioprinting قذف لديه ميزة أنه لا يحتاج إلى قناع منفصلة أو ختم. باستخدام CAD البرمجيات، وتصميم هيكل يمكن أن تتغير بسرعة وتعديلها وفقا لمتطلبات المشغل. هذا يجعل bioprinting أكثر مرونة من القائم الطباعة الحجريةالنهج. نحن هنا لشرح الطباعة من العفن فداء لإنشاء بنية 3D متعددة المواد باستخدام مجموعة من الأعمدة داخل هيدروجيل كمثال على ذلك. هذه الركائز يمكن أن تمثل هياكل جوفاء لشبكة الأوعية الدموية أو الأنابيب داخل قناة دليل العصب. كانت المواد المختارة للقالب الذبيحه بولوكسامير 407، البوليمر thermoresponsive مع خصائص الطباعة ممتازة الذي يوجد سائلا عند 4 ° C ومادة صلبة فوق درجة حرارة دبق لها ~ 20 درجة مئوية لمدة 24.5٪ W / V حلول 18. هذه الخاصية تسمح للقالب الذبيحه المستندة إلى بولوكسامير إلى أن مزال على الطلب ولها مزايا أكثر من تفكك البطيء للمادة الصلبة وخاصة بالنسبة للهندستها الضيقة. وقد طبع بولوكسامير على الشرائح الزجاجية المجهر لإنشاء قالب فداء. كان pipetted الاغاروز في قالب ويبرد حتى دبق. بعد شطف من بولوكسامير في الماء البارد الجليد، وملئت الفراغات في القالب الاغاروز مع الجينات ميتاكريليت SPIKED مع FITC الفيبرينوجين المسمى. وبعد ذلك عبر ربط فراغات مملوءة الأشعة فوق البنفسجية وتم تصويرها في بناء مع مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان.

وأظهرت النتائج أن ممثل تقنية القالب العكسي (مبين في الشكل 2) سيخلق هلام المهيكلة التي يمكن شغلها مع المواد الثانية. في بداية كل عملية الطباعة هي الأمثل المعلمات الطبعة الأولى. سوف التعديلات خطوة حكيمة من المعلمات يؤدي إلى بنيات متعددة الطبقات المطبوعة هو مبي...

Watch this Scientific Journal Video about Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture at JoVE.com

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

تم استخدام bioprinter لخلق الهلاميات المائية منقوشة على أساس العفن فداء. تم ردم القالب بولوكسامير مع هيدروجيل الثاني، ثم مزال، وترك الفراغات التي كانت مليئة هيدروجيل الثالث. يستخدم هذا الأسلوب شطف سريع والقابليه جيدة من بولوكسامير لتوليد أبنية معقدة من البوليمرات الحيوية.

قوالب الطباعية عكس Thermoresponsive لإنشاء منقوشة الهلاميات المائية ثنائي مكون للثقافة الخلية 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K Views.  Cartilage Engineering & Regeneration. تم استخدام bioprinter لخلق الهلاميات المائية منقوشة على أساس العفن فداء. تم ردم القالب بولوكسامير مع هيدروجيل الثاني، ثم مزال، وترك الفراغات التي كانت مليئة هيدروجيل الثالث. يستخدم هذا الأسلوب شطف سريع والقابليه جيدة من بولوكسامير لتوليد أبنية معقدة من البوليمرات ?...

Video: Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

اختبارات الثقافة المشتركة عاليه الانتاجيه للتحقيق في التفاعلات الميكروبية

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

عكس النسخ حلقة بوساطة Isothermal التضخيم (RT-LAMP) القول للكشف المحدد والسريع لفيروس بحيرة البلطي

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

ب. ايروجينوسا مصابة 3D شارك الثقافة من الخلايا الظهارية القصبي و الضامة في واجهة الهواء السائل لتقييم ما قبل الإكلينيكي من المضادة للعدوى

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...