يوفر هذا البروتوكول وسيلة لتربية الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحشيات العملاقة. فمن السهل لتطوير الفينات العملاقة، وفقط مطلوب حجم صغير جدا من حل عينة لإعداد الفينة. إثبات الإجراء سيكون يوري أوتا، مرشح دكتوراه من مختبرنا.
تبدأ بإضافة 20 ميكرولتررس من حل POPC الطازجة و 4 microliters من الطازجة المعدة biotin-PEG-DSPE حل إلى قارورة الزجاج. يتبخر المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء حتى يتم تشكيل فيلم الدهون. وضع الفيلم في جهاز ادمة لمدة ساعة واحدة لتتبخر تماما المذيبات العضوية.
ثم إضافة 200 ميكروليتر من الزيوت المعدنية إلى القارورة. تغطية افتتاح القارورة مع فيلم البارافين البلاستيك، و sonicate محتويات القارورة في حمام بالموجات فوق الصوتية في 120 واط لمدة ساعة واحدة على الأقل. لإعداد فديكل صغير، إنشاء فيلم الدهون، كما أظهرت للتو، وإضافة 200 ميكرولترات من الجلوكوز 200 ملليمتر في متوسطة LB للفيلم.
ثم سونيكات الفيلم في 120 واط لمدة ساعة على الأقل، تليها البثق من الحويصلات العملاقة الناتجة في حويصلات صغيرة باستخدام طارد صغير وغشاء بولي مع حجم مسام 100 نانومتر. بالنسبة لخلية بكتيريا ما قبل الثقافة، تلقيح الإشريكية القولونية من لوحة LB إلى ملليلتر من متوسطة LB لثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، نقل 20 ميكرولترات من الثقافة الفائقة إلى 1.98 ملليلتر من متوسطة LB الطازجة لمدة ساعتين إضافيتين من الثقافة.
في نهاية الحضانة، تحقق من الكثافة البصرية في 600 نانومتر، أو قيمة OD 600، من محلول ما قبل الثقافة على مقياس الطيف. وينبغي استخدام حل ما قبل الثقافة مع OD 600 من واحد إلى 1.5. ثم اخلط محلول ما قبل الثقافة مع محلول السكروز الطازج والمتوسطة الجديدة LB، وفقا للجدول واحد.
لتشكيل الفينة العملاقة، إضافة 50 ميكرولترات من محلول مائي خارجي حديثا أعدت من الفويصلات العملاقة إلى أنبوب بلاستيكي 1.5 ملليلتر غطاء. طبقة بلطف 150 ميكرولترات من محلول الزيت المحتوي على الدهون على محلول مائي خارجي من الفينات العملاقة. احتضان الحل الناتج لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، قبل التحقق من أن واجهة الزيت والحلول مائي مسطح.
للمياه والنفط الخلية البكتيرية التي تحتوي على تكوين قطرات، إضافة اثنين microliters من محلول مائي داخلية أعدت حديثا من الفينات العملاقة إلى 50 ميكرولترات من محلول زيت المحتوية على الدهون سونيكاتيد في أنبوب بلاستيكي 0.6 ملليلتر غطاء. ثم، اضغط على أنبوب مستحلب اثنين من المكونات. بعد ذلك ، استخدم ماصة لإضافة 50 ميكرولترات من محلول قطرات الماء والزيت إلى واجهة الزيت والمحلول المائي ، ورواسب الفُيصلات العملاقة المحتوية على الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي.
ثم pirate طبقة النفط العلوي وجمع vesicles العملاقة. لإعداد غرفة مصنوعة يدويا، حفر حفرة سبعة ملليمتر مع لكمة جوفاء على 10 في 10 من قبل واحد ملليمتر ختم مزدوج الوجه، ثم لصق ختم مزدوج الوجه على 30 في 40 ملليمتر غطاء الزجاج. لإعداد غشاء ثنائي الطبقة مدعوم، إضافة 30 ميكرولترات من حل الحوية الصغيرة إلى ثقب الغرفة اليدوية.
احتضان الحويصلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، يغسل بلطف الثقب مرتين مع 20 ميكرولترات من متوسطة LB ، تكملها 200 ملليلتر جلوكوز. لشلّس الحويصلات العملاقة على غشاء ثنائي الطبقة الداعم، أدخل 10 ميكرولترات من نيوترافيدين في محلول الحويصلات العملاقة مائي الخارجي إلى الحفرة لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، بلطف غسل ثقب مرتين مع 20 ميكرولترات من LB المتوسطة، تستكمل مع الجلوكوز 200 millimiller، وإضافة كامل حجم حل الحيزل العملاقة إلى ثقب في الغرفة. ثم ختم الحفرة مع 18 في 18 ملليمتر غطاء الزجاج. لمراقبة نمو البكتيريا داخل الفينات العملاقة، حدد الهدف 40X على مجهر مقلوب، ووضع الغرفة على نظام مرحلة التدفئة المجهر.
ثم احتضان الخلايا البكتيرية المحتوية على حويصلات عملاقة في الغرفة في ظل ظروف ثابتة لمدة ست ساعات في 37 درجة مئوية، والتقاط وتسجيل الصور من نمو الخلايا البكتيرية كل 30 دقيقة، مع كاميرا أشباه الموصلات أكسيد المعادن التكميلية العلمية. وتتراوح الفُيصلات العملاقة التي تحتوي على خلايا بكتيرية عادةً في الحجم من 10 إلى 30 ميكرومتر. بالنسبة لكلا الأحجام من الحويصلات العملاقة ، تخضع خلايا الإشريكية القولونية لعمليات استطالة وتقسيم ، مع نمو بعض خلايا الإشريكية القولونية إلى عدد كبير جدًا من الخلايا خلال فترة المراقبة لمدة ست ساعات.
التردد النسبي للحرفيات العملاقة التي تحتوي على مستوى خلية واحدة هو ما يقرب من 10٪ من الفينات العملاقة التي تم الحصول عليها، والـ حويصلات عملاقة مغلفة على مستوى الخلية المفردة هي حوالي 50٪ من الفُيصلات العملاقة التي تحتوي على خلايا جرثومية. استقرار واجهة النفط والماء مهم للحصول على حويصلات عملاقة تحتوي على خلايا بكتيرية. الحرص على التعرق النفط بعناية قبل تصحيح vesicle العملاقة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية المفردة داخل الفُيَيْسَة العملاقة الفردية. طريقة الثقافة البكتيرية لدينا هي أداة جديدة في علم الأحياء الدقيقة استزراع البكتيريا البيئية غير المعروفة للحصول على أو تحليل منتجاتها الأيضية.
