لذلك عندما نقوم بتقييم مضادات العدوى الجديدة، علينا أن نعالج أمرين. جانب واحد هو البكتيريا. إذا كانت planktonic أو علم الأغشية الحيوية ، والجانب الآخر هو وجود الخلايا المضيفة ، وخاصة الخلايا المضيفة الظهارية ، والتي تشكل حواجز بيولوجية ضيقة.
إذا تم تنفيذ هذه الحواجز، وكيف يمكن أن تكون الاستجابة الأحادية، ومع هذا النموذج الجديد، يمكننا في الواقع رصد كلا المعلمتين في نفس الوقت. عند علاج الالتهابات البكتيرية، علينا أن ندرك ما هو الجهاز المتضرر. على سبيل المثال ، إذا كانت الرئة ، يمكننا الاستفادة ، وإدارة الدواء موضعياً كهباء جوي.
ومع ذلك، إذا كنا نريد أن يكون لدينا نموذج لدراسة هذا، ونحن بحاجة إلى نموذج يسمح أيضا موقف الهباء الجوي وهو الحال في نموذجنا. الميزة الأخرى هي أنها تقوم على الخلايا البشرية، حتى نتمكن من تجنب المشاكل بسبب الاختلافات بين الحيوانات والأنواع. هذا النظام يمكن أن تعطيك المزيد من التبصر في مجال أبحاث العدوى عن طريق تسليط الضوء على الأحداث الجزيئية والخلوية خلال التفاعل بين الخلايا المضيفة والبكتيريا.
عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، تذكر أن تحقق من متوسط الخلية للعقم ومورفولوجيا الخلية وأن تكون حذراً عند التعامل مع يدعم نفاذية. زراعة خلايا ناقص CFBE41 O في قارورة T 75 مع الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية التي تحتوي على 10٪ FCS, 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية, و 600 ملليغرام لكل لتر الجلوكوز في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إضافة المتوسطة الطازجة إلى الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام.
بعد الخلايا وصلت إلى 70٪ التقاء، وغسلها مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وفصل مع ثلاثة ملليلتر من التربسين EDTA في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، إضافة سبعة ملليلتر من ميوم الطازجة والطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G لمدة أربع دقائق. بعد التخلص من المابير، في 10 ملليلتر من MEM، في حين تعطيل كتل مع الأنابيب لطيف.
عد الخلايا مع عداد الخلايا الآلي أو غرفة قياس الهيموسيت، ثم تمييع لهم إلى تركيز 200، 000 خلية لكل 500 ميكرولترتر للبذور في 12 لوحات جيدا مع يدعم نفاذية. إضافة 500 microliters من تعليق الخلية في بئر إلى الجانب apical من الدعم نفاذية. ثم إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى الجانب الجانبي القاعدي.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. في اليوم الثالث بعد البذر، إنشاء واجهة سائلة الهواء عن طريق إزالة المتوسطة من الجانب الجانبي القاعدي أولا ثم من الجانب apical. إضافة 500 ميكرولترات من MEM الطازجة إلى الجانب الجانبي القاعدي وتغيير المتوسطة كل يوم واحد حتى الخلايا تشكل أحادية التقاء.
لتقييم خصائص الحاجز الظهاري للخلايا، أضف 500 ميكرولترات من الخلية المتوسطة إلى الجانب المزلي، و1.5 ملليلتر إلى الجانب الجانبي القاعدي، ثم عاد لوحة إلى الحاضنة لمدة ساعة. قياس المقاومة الكهربائية مواد العبور أو TEER مع قطب عيدان آن STX2 ومتر أوم فولت الظهارية. لزراعة خلايا THP1، تنمو لهم في قارورة T 75 باستخدام 1640 1640 1640 متوسطة، وتستكمل مع FCS 10٪ في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تقسيم الخلايا كل يوم الثانية عن طريق بذر 2 مليون خلية لكل ملليلتر في قارورة T75 جديدة. للتمييز بين خلايا THP1، الطرد المركزي محتويات القارورة في 300 مرة G لمدة أربع دقائق، والتخلص من عظمى. Resuspend بيليه في وسط جديد ووضع في قارورة T75 جديدة.
أضف 10 نانوجرامات لكل ملليلتر PMA إلى الخلايا واعيدها إلى الحاضنة. لفصل الضامة مثل الخلايا، وغسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية، واحتضان لهم مع ثلاثة ملليلتر من محلول مفرزة الخلايا التي تحتوي على 0.5 ملليمولار EDTA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحقق من انفصال الخلايا تحت مجهر مقلوب.
عندما تكون الخلايا منفصلة، إضافة سبعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة والطرد المركزي لهم في 300 مرة G لمدة أربع دقائق. بعد إزالة عظمى، resuspend خلايا الضامة في ثلاثة ملليلتر من THP1 المتوسطة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، عد الخلايا، واحتضانها لمدة أقصاها ساعة واحدة قبل إعداد الثقافة المشتركة. لإنشاء الظهارية الضامة المشتركة الثقافة, إزالة المتوسطة من الغرفة السفلية من CFBE41 O ناقص monolayers وعكس بعناية الدعم داخل طبق بيتري الزجاج المعقم, استخدام مكشط الخلية لإزالة الخلايا متضخمة من خلال المسام الغشاء.
مكان 200، 000 الضامة THP1 في 200 ميكرولترات من RPMI على الجانب الجانبي القاعدي من إدراج مقلوب في كل بئر، وإغلاق أطباق بيتري، واحتضان لهم لمدة ساعتين. ثم ضع إدراج مرة أخرى في 12 لوحات صغيرة جيدا وإضافة 500 ميكرولترات من MEM المتوسطة إلى الجانب الجانبي القاعدي من إدراج نفاذية. تلقيح 15 ملليلتر من رطل تكملها 300 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين مع مستعمرة واحدة من P aeruginosa, PAO1GFP, احتضان البكتيريا لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية, في حين تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة، نقل البكتيريا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وأجهزة الطرد المركزي في 3، 850 مرات G لمدة خمس دقائق. تجاهل الماثرة وإضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة التي تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر وضبط تركيز البكتيريا مع متوسطة لثقافة الخلية إلى تركيز نهائي من 200،000 مستعمرة تشكيل وحدات لكل ملليلتر، والذي يتوافق مع تعدد العدوى من بكتيريا واحدة لكل خلية ظهارية.
إضافة 100 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى الجانب apical من الدعم نفاذية واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة للسماح للبكتيريا لإرفاق الخلايا، ثم إزالة بعناية السائل apical مع ماصة لاستعادة شروط ALI. لتجارب العلاج من المخدرات، إضافة 500 ميكرولترات من محلول المخدرات المخففة في خلية المتوسطة إلى الجانب apical. ثم إضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة الخلية إلى الجانب الجانبي القاعدي.
جمع 500 ميكرولترات من الوسط الجانبي غير نمطي والباسدسية و تجمع لهم لتقييم CFU من البكتيريا غير المرفقة. لتقييم بقاء البكتيريا المرفقة أو الداخلية ، أضف 500 ميكرولترات من الماء البارد المعقم المعقم إلى كل حجرة من الدعم نفاذية ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إذا تقييم CFU من العينات المجمدة، ذوبانها في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم استخدام نصائح ماصة لكشط سطح الغشاء مع الحرص على عدم وضع الكثير من الضغط على الآبار. الماصات صعودا وهبوطا لإزالة جميع المحتويات الملتزم بها. مع التعليق البكتيري من كلا الكسور، وجعل واحد إلى 10 تخفيف المسلسل مع توين برنامج تلفزيوني وطبقة البكتيريا على لوحات أجار lb.
احتضان لوحات أجار في 30 درجة مئوية لمدة 16 إلى 72 ساعة، ثم عد المستعمرات وحساب CFU. مورفولوجيا الثقافة المشتركة الناتجة عن الخلايا الظهارية القصبية البشرية و الضامة على الجانب الجانبي المزين من الدعامات القابلة للنفاذ تظهر هنا. A أعلى قياس TEER والمناعة لبروتينات تقاطع ضيق ZO1، أثبتت سلامة الحاجز الظهارية.
لنموذج عدوى بكتيرية، تم تلقيح P aeruginosa على خلايا ناقص CFBE41 س. ولوحظت الضامة على الجانب apical من الثقافة المشتركة بعد ست ساعات من العدوى. انخفض TEER إلى 250 أوم لكل سنتيمتر مربع ، مما يشير إلى حاجز ظهاري للخطر ، والذي اقترحه أيضًا تلطيخ ZO1.
يتم عرض هجرة عبر الضامة من خلال المسام القابلة للتسرب من المرشح والبكتيريا التي تُمَتَكُثَى بواسطة خلايا THP-1 على الجانب الزّامي هنا. في الثقافات أحادية THP-1، هجرة الضامة في وقت مبكر من ساعة واحدة بعد العدوى. وفي الوقت نفسه شوهدت الهجرة بعد ثلاث ساعات بعد العدوى في الثقافة المشتركة.
تم تصوير الثقافات المشاركة المصابة المعالجة بالتبراميسين لمدة ست أو 20 ساعة باستخدام المجهر الليزري المناوب. دون علاج، إما الخلايا الظهارية أو الضامة توفي بعد 20 ساعة من العدوى. على الرغم من رؤيته بعد ست ساعات من العلاج في صور المجهر ، أظهر فحص CFU أن البكتيريا لم تتكاثر.
ومع ذلك، استعادت البكتيريا قدرتها على الانتشار بعد العلاج لمدة 20 ساعة. كما تم قياس TEER من الثقافات الأحادية والثقافات المشتركة. لم الثقافة المشتركة من الخلايا ناقص CFBE41 س مع THP-1 لا تستحث أي تغييرات في سلامة الحاجز الظهاري مقارنة بزراعة أحادية.
عند الإصابة، انخفضت قيمة TEER. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن الخلايا جالسة بشكل صحيح وعدم تعطل غشاء التصفية. لذلك تحتاج خطوات البذر الخلية إلى أن يتم تنفيذها بعناية.
بالإضافة إلى هذا البروتوكول، فإن ابخاخ المضادات الحيوية على إدراج سيجعل من الممكن معرفة ما إذا كانت التغيرات البقاء على قيد الحياة البكتيريا بالمقارنة مع الظروف الغمرية.
