وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة كالغاري، في ظل بدء المحقق منحة جديدة للدكتور Ungrin.

ملاحظة: هي لوحات Microwell متوفرة في أشكال مختلفة، اعتمادا على النتائج المرجوة. وتظهر المواصفات فضلا عن المبادئ التوجيهية تقريبي للأرقام الحد الأدنى والحد الأقصى من الخلايا التي ينبغي أن تستخدم مع كل شكل في الجدول 1. وmicrowells أصغر تفتق إلى نقطة حادة، وبالتالي ليس هناك حد أدنى حجم، على الرغم من التباين بين الأجسام الشبه الكروية يصبح أكثر أهمية في أحجام أصغر. الإنتاج الروتيني للالكروية من متوسط ​​اقل من 20 خلايا لكل واضح ومباشر 8. لم يتم مدبب حجم أكبر microwell بالكامل، لذلك يحاول تشكيل الأجسام الشبه الكروية من أعداد صغيرة من الخلايا قد يؤدي إلى أصغر الأجسام الشبه الكروية متعددة في كل microwell. بسبب اختلافات طفيفة في خصائص السطح، وإعداد مع الحل السطحي (الخطوة 1.2) ليست اختيارية عند استخدام لوحات AggreWell 400Ex. ويستند هذا البروتوكول على استخدام AggreWell 400 لوحات - لغيرها من الأشكال سلبياتULT الجدول 1. يتم تحديد عدد الخلايا ليتم تحميلها في كل بئر عن طريق ضرب عدد من microwells أنه يحتوي على عدد من الخلايا لتكون متفاوت لكل كروي. على سبيل المثال، لتوليد الأجسام الشبه الكروية من 1000 خلية لكل منهما، يجب أن يتم تحميل كل بئر مع (1،200 مرات الكروية 1،000 خلايا لكل =) 1.2 × 10 6 خلايا. يجب أن تحسب كثافة الخلية نظرا إلى أن الخلايا سيتم تحميلها في حجم 0.4 مل. وذلك لمثال الكروية شكلت من 1000 خلية لكل منهما، 1.2 × 10 6 خلايا في 0.4 مل يترجم إلى كثافة 3 × 10 6 خلايا لكل مل. 1. تستعد لاستقبال خلايا Microwells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات Microwell هي عقيمة على النحو المنصوص عليه، ويجب إزالة فقط من عبواتها في بيئة معقمة مثل الوزراء للسلامة الأحيائية الصفحي تدفق. ينبغي الحفاظ على العقم في جميع أنحاء البروتوكول. يجب أن يتعرض للخطر العقم، وresterilized الآبار باستخدام الايثانول 70٪ في استخدام المياهالخطوات التالية اختيارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من الايثانول 70٪ إلى كل بئر غير المستخدمة. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما بخار الإيثانول يجب تتخلل بسرعة أي فقاعات، وإذا كانت هناك أعداد كبيرة قد يكون من المرغوب فيه لإزالتها. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 ز س. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الإيثانول. ويمكن الآن أن تغسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني للاستخدام الفوري، أو تجفف الهواء للتخزين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان أن الخلايا لا تتفاعل مع سطح microwell، قد يكون مستعدا باستخدام بالسطح. بشكل عام هومن المستحسن أن تنفيذ هذه الخطوة في البداية، وبعد ذلك مقارنة الكروية ولدت مع وبدون microwells المغلفة بالسطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من محلول الشطف إلى كل بئر. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين لوحات في أربع درجات مع الحل السطحي في الآبار لحين الحاجة إليها إذا محكمة الغلق لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني على الفور قبل استخدامها. لا تسمح لوحاتلتجف بعد الطلاء. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلايا ملاحظة: إن تفاصيل إعداد الخلايا تختلف إلى حد ما مع نوع من الخلايا المحددة التي تجري دراستها. ومع ذلك لاحظنا هذه الشروط أن تكون فعالة مع طائفة واسعة من الخلايا، بما في ذلك خطوط مناقشتها هنا، وكذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفئران (ESC)، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (التوجيهية)، الخلايا الليفية، الأديم البدائية المفترضة، والخلايا اللحمية. استخدمت مجموعات أخرى هذا النظام بنجاح لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك تكون الغضروف من الخلايا الجذعية الوسيطة 9، الجيل موحدة السلائف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة 10، تحليلات السمية في خلايا الكبد 11 وتقييم تجديد النخاع الشوكي في السلمندر 12. يظهر بروتوكول معين للعمل مع خلايا HT29 هنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع قارورة T75 الخلايا HT29، المثقف في DMEM+ 10٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة النمو من القارورة، وإضافة 3 مل من التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التربسين الهضم بإضافة 3 مل من النمو المتوسط. اتخاذ قسامة لعد الخلايا ونقل ما تبقى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الطرد المركزي في التقدم، عد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح التربسين / خليط المتوسطة واستبدالها مع متوسط ​​نمو جديدة، وحجم تحددها كثافة الخلية المطلوبة والمحسوبة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة من أجل إزالة أي كتل. ملاحظة: ظروف الحصاد خلية سوف تختلف نوعا ما بين السطور. إذا كان البروتوكول تفارق لمثل الركض الخلايا من الفائدة المتاحة، التي ينبغي أن تستخدم كنقطة انطلاق. مع استخدام خطوط الخلايا الحساسة من التربسين قد يؤدي إلى موت الخلايا المفرطة. في هذه الحالات لاحظنا نتائج جيدة باستخدام TrypLE باعتبارها dissociati البديلةعلى كاشف 8. إذا كانت الخلايا تصبح تجمعت خلال التفكك وتفقد قدرتها على البقاء، إضافة إلى الدناز الحل الانزيم قد حل هذه. يمكن خفض أوقات التفكك وتوظيف خطوة سحن لتفريق كتل الخلايا أيضا زيادة قدرتها على البقاء. </li></ol> 3. تشكيل كروي ملاحظة: قد يتم إنشاء الأجسام الشبه الكروية في مجموعة متنوعة من الصيغ المتوسطة، ينبغي إجراء محاكمات ولكن الأولي خارج باستخدام المتوسطة التي كانت الخلايا المستزرعة، للتمييز عواقب التحول إلى نظام الثقافة 3 الابعاد من عواقب تغيير التركيبة المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل من النمو المتوسط ​​إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة قبل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 ملتعليق خلية في الكثافة المطلوبة (يحسب أعلاه). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا، دون إدخال فقاعات الهواء إلى microwells. فمن المهم للتأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر، من أجل الحصول على الأجسام الشبه الكروية متسقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. إذا ما كانت لوحة يست على مستوى الذات أثناء الطرد المركزي، قد تنشأ تيارات الحمل الحراري التي تؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للخلايا عبر microwells. لذلك، ينبغي أن تكون متوازنة لوحة داخليا وكذلك ضد لوحة أخرى، بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على كلا الجانبين من لوحة الناقل. </li></ol> ملاحظة: إذا كان يعتبر دليلا على التوزيع غير المتكافئ الخلية، قد يكون من الضروري تطبيق كمية صغيرة من تزييت إلى النقاط المحورية على الناقل لوحة - التشاور مع الشركة المصنعة للأجهزة الطرد المركزي للحصول على تعليمات. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم طرد الخلايا في microwells، فهي المقاومات معقولتانت لغسل الخروج من الاقتراحات بسيطة من لوحة. وينبغي تجنب الحركات المفاجئة التي تؤدي إلى الخوض في المتوسط، ولكن نقل لوحة من أجهزة الطرد المركزي إلى المجهر أو الحاضنة لا ينبغي أن يؤدي إلى تشريد خلية كبيرة. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، تحقق من أن الخلايا قد تتجمع داخل microwells، وأنها توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، ومراقبة عملية تشكيل كروي. وبعض خطوط الخلايا تشكيل الأجسام الشبه الكروية التعاقد في غضون 24 ساعة، والبعض الآخر قد يستغرق وقتا أطول. يظهر تطور من مجموعة لتجميع الخلايا في HT29 في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة الكروية من microwells ونقل إلى الثقافة والتعليق من النفث بها بلطف مع ماصة. بدلا من ذلك، الحفاظ على الأجسام الشبه الكروية في الموقع مع استبدال المتوسطة 8 - ومدة يعتمد على حجمها الأولي ومعدل النمو، الذي مواطنهالمعهد الوطني للإحصاء الوقت حتى تتفوق على microwells التي تم تشكيلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحل محل المتوسطة دون أن تفقد الكروية والمتوسطة نضح على حافة البئر باستخدام ماصة باستور. جلب ببطء غيض أسفل حتى يبدأ في رسم السائل من الغضروف المفصلي، واتبع الغضروف المفصلي على النحو ينخفض. ثم تضاف متوسطة جديدة ضد الجدار جيدا في نفس المكان. قد يتم فقدان بضعة الكروية، ولكن إذا ويستنشق المتوسطة دائما واستبدالها في نفس الموقف، وهذا العدد لا تزال صغيرة بالمقارنة مع أعداد كبيرة في البئر. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

الدكتور Ungrin لديه مصلحة مالية في التكنولوجيا AggreWell باعتباره مخترع.

أنشأنا نظاما قد يتم إنشاء أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة من خطوط الخلايا متعددة من مصادر مختلفة. لدينا حتى الآن لمواجهة خط خلية ملتصقة التي لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في ظل هذه الظروف. لاحظنا سابقا في فقدان الخلية السكان عرضة للanoikis 5،8، ولكن حتى الآن لم تنشأ هذه المسألة مع خطوط الورم. هذا النظام هو تحجيم بشكل تعسفي مع مساحة السطح، مع السلوك متناسقة عبر microwells في 24 جيدا وشكل 6 جيدا، وكذلك المفاعلات الحيوية التي تحتوي على النموذج 50،000 microwells كل قيد التطوير في الوقت الحاضر. يجب كروي التماثل يكون مصدر قلق، ويمكن زيادة فترة حضانة في الخطوة 4.8 ليومين أو ثلاثة أيام. ويمكن أيضا أن المحتضنة الكروية لفترة بعد استخراج من microwells لزيادة التماثل، ولكن في هذه الحالة يجب توخي الحذر للحفاظ على كثافة منخفضة بما فيه الكفاية الثقافة، كما الكروية في اتصال مع واحد واي أخرىليرة لبنانية في كثير من الأحيان تندمج في الهياكل الأكبر حجما. لهذا السبب، حرصنا على الحفاظ سابقا الثقافات داخل microwells التي تشكلت المجاميع، مع الحد الأساسي هو حجم كروي. وهذا بدوره هو وظيفة كل من معدل النمو والحجم الأولي 8، وإذا تم التخطيط الثقافة تمديد داخل لوحة microwell، وهذا ينبغي النظر مقدما. وتشمل خيارات لمنع فرط، ينبغي أن يحدث، إما بدءا الكروية أصغر، أو توظيف microwells أكبر من لوحة AggreWell 800. يجب أن تفشل الكروية لزيادة في التماسك مع مرور الوقت، قد يكون سببا محتملا احدة موت الخلية. خاصة في المجاميع أكبر من الخلايا عملية الأيض نشطة للغاية، ويمكن قيود النقل الجماعي على إيصال الأوكسجين والمواد المغذية الضرورية يؤدي إلى نواة نخرية 2 - بالتالي كروي غير متماسكة قد يكون ببساطة نتيجة لموت الخلايا المفرطة. بدلا من ذلك، قياسات cohe الميكانيكيةوقد استخدمت سيون من الأجسام الشبه الكروية لتقييم القوات ملزمة بين الخلايا، في العلاقة مع المحتملة المتنقل من خط خلية معينة 13. سيكون من المثير للاهتمام أن التحقيق في العلاقة بين شكل كروي والمحتملة المتنقل، ربما باستخدام المعلمات المورفومترية مثل الاستدارة ومحيط لنسبة المساحة. بالإضافة إلى التحقيق في الخواص الميكانيكية والمورفومترية من الأجسام الشبه الكروية، والتجمع في النظام microwell يسمح الإنتاج على نطاق واسع من الأجسام الشبه الكروية مختلط تكوينها، تتألف من مزيج من أنواع خلايا متعددة و / أو المواد الحيوية 6،7. تفاعلات الخلايا السرطانية مع أنواع الخلايا الأخرى مهمة لنموذج أكثر عن كثب سلوك الأورام في الجسم الحي 14، وبالتالي فإنه قد يكون من مصلحة لتوليد الأجسام الشبه الكروية من الخلايا السرطانية في تركيبة مع الخلايا الليفية والخلايا البطانية، على سبيل المثال. ويمكن أيضا أن تدمج المجهرية الدقيقة لمختلف المواد الحيوية، ويمكن أن تؤثر على الإنتاج الاجتماعي للموئلخصائص eroid سواء بصورة مباشرة من خلال تفاعلها مع الخلايا 7،15، وكذلك خزانات للإفراج تسيطر عليها عوامل النمو والسيتوكينات في المناطق الداخلية من 16 كروي. إذا كان هناك أي قلق حول العقم، وعلى سبيل المثال عند العمل مع لوحة microwell التي سبق لها أن استخدمت بعض الآبار والتي قد أمضوا بعض الوقت في حاضنة كجزء من التجربة السابقة، يجوز resterilized الآبار مع الايثانول 70٪ في الماء. مرة واحدة وقد تم تشكيل الأجسام الشبه الكروية، كما انها قد تكون مفصولة من الخلايا الفردية المتبقية عن طريق تمرير تعليق على مصفاة الخلية. الخلايا الفردية سوف تمر من خلال، في حين سيتم الاحتفاظ الكروية. إذا اشتبه كروي من سفك خلايا يحتمل المنتشر على مدى ثقافة، قد يكون من المرغوب فيه أن تنفيذ هذا الإجراء عدة مرات - في البداية لإزالة الخلايا الفردية، وبالتالي إلى عزل purifieد السكان من الخلايا المنبعثة من الأجسام الشبه الكروية.

هناك مجموعة متزايدة من الأدلة على أن الخلايا السرطانية تتصرف بشكل مختلف في ثلاث ثقافات الأبعاد مما يفعلون عندما مثقف على البلاستيك، وأن العوامل العلاجية التي تم تحديدها على منصات الأنسجة الثقافة التقليدية قد تفقد فعاليتها عندما انتقلت إلى نظام أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة 1. ولذلك فمن المستحسن أن دراسة سلوك الخلايا السرطانية في ظل هذه الظروف، وذلك لاكتساب نظرة ثاقبة البيولوجيا الكامنة وراءها، وأيضا لزيادة معدل نجاح الانتقال كلاء علاجية جديدة من مرفق الفرز إلى العيادة. نظام واحد نموذجا مفيدا مع تاريخ طويل توظف مجموعات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية المعروفة باسم الورم 1،2 الكروية. من الناحية المثالية، فإن التقنيات لتشكيل كروي يسمح إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة حجمها وتكوينها يتم التحكم من قبل المجرب. في حين شنقا الإفلات وكذلك لوحة نهج 3،4 قادرون على تحقيق بعض هذه إعادةيتطلبه، الإنتاجية تقتصر عادة، وتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية يصبح مهمة كثيفة العمالة. وقد وضعنا مؤخرا نظاما لحل تحديات مماثلة في مجال الطب التجديدي 5. توظيف التجميع القسري ضمن سلسلة من المكتظ الآبار ميكرون النطاق (انظر الشكل 1)، وهذا النهج يسمح توليد الأجسام الشبه الكروية من أرقام التعسفي من الخلايا، بما في ذلك مخاليط من أنواع خلايا متعددة 6، فضلا عن إدماج مختلف المواد الحيوية 7. تتشكل الأجسام الشبه الكروية بأعداد كبيرة - الآلاف إلى مئات الآلاف أو أكثر - ويمكن استخراجها مباشرة أو الاحتفاظ بها في microwells التي تشكلت مع تبادل متوسطة لمدة واحد على الأقل 8 إلى اثنين (المراقبة غير منشورة) أسابيع. وبالتالي هي مناسبة هذا النظام بشكل جيد لتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار لتقييم EFFEctiveness من وكلاء انتيتومور رواية أو التحقيقات البيولوجية الأساسية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

يتم التعرف على نحو متزايد باعتبارها الكروية الورم في المختبر نموذجا هاما للسلوك الخلايا السرطانية في ثلاثة أبعاد. أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الثقافات ورقة ملتصقة التقليدية، فإنها ألخص أكثر دقة وتعقيد التفاعلات الموجودة في الأورام الحقيقي. من أجل تسخير هذا النموذج لتقييم أفضل لبيولوجيا الأورام، أو فعالية من وكلاء علاجية جديدة، فمن الضروري أن تكون قادرة على توليد الأجسام الشبه الكروية بتكاثر، في الطريقة التي تسيطر عليها وبأعداد كبيرة. ويتكون النظام من مجموعة AggreWell عالية الكثافة من microwells على شكل هرم، الذي يتم طرد تعليق خلايا مفردة. أعداد خلايا تجميع في الجزء السفلي من كل microwell، وعدد ونسبة من أنواع الخلايا متميزة تشارك تعتمد فقط على خصائص التعليق قدم من قبل المجرب. وبالتالي، فإننا قادرون على توليد الأجسام الشبه الكروية الورم من حجم التعسفي وتكوينها معمن الحاجة إلى تعديل منصة تكنولوجيا الأساسي. مئات microwells لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح الثقافة بدورها ضمان مستويات إنتاج مرتفعة للغاية يمكن تحقيقها من خلال عملية مكثفة nonlabor مباشرة. وبالتالي فإننا نتوقع أن هذا البروتوكول سوف يكون مفيدا على نطاق واسع للباحثين في مجال كروي الورم.

قد بسهولة أن تتولد الأجسام الشبه الكروية من خطوط الورم متعددة من أصول مختلفة واستخراج التشريحية في الثقافة الايقاف. الشكل 3 يوضح التحكم في حجم متسقة يمكن الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب، مع السكان كروي موحد للغاية تحت كل حالة. الخلافات خط واضح في السلوك واضحة أيضا، مع خلايا سرطان القولون HT29 وTE6 خلايا سرطان المريء تشكيل الأجسام الشبه الكروية المكتظ مع حدود محددة بشكل حاد، في حين أعطى الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا تؤدي إلى الكروية أقل تماسكا مع حدود غير منتظمة (انظر مناقشة لأسباب ممكن ). أدى القوى الداخلية أقوى في المجاميع أكثر تماسكا أيضا في انهيار إلى شكل أكثر توازنا حتى حين لا يزال في microwells التي تشكلت، في حين أن المجاميع LNCaP، لا سيما على حجم أكبر والاحتفاظ بها بشكل واضح هندسة مربع هرمي لل microwells. العلاقة بين أرقام خلية الإدخال وفيز<html> سوف حجم كال من كروي الناتجة تعتمد على عدد من المتغيرات. وربما يتم تخفيض كميات النظرية على أساس المنتج من حجم لكل خلية وعدد الخلايا التي تستخدمها فقدان الخلية، والتي بدورها قد تشمل فقدان الخلايا خلال مرحلة وحيدة الخلية تعليق، فضلا عن فقدان من المجاميع الصغيرة بشكل مفرط بسبب عدم كفاية أعداد الدول المجاورة، ومن المجاميع الكبيرة بشكل مفرط بسبب نقل القيود ونخر في قلب. كما تتأثر بأي حجم الانتشار التي قد تحدث أثناء عملية التجميع. كما سوف تختلف هذه المعايير من خط الخلية إلى خلية خط، إذا رغبت الكروية ذات الأبعاد المادية محددة يجب تحديد العدد الصحيح من الخلايا لإدخال تجريبيا. كما تقريب الأولى، ومن المتوقع أن يزيد مع الجذر التكعيبي لعدد من الخلايا أدرجت قطر كروي - على سبيل المثال بزيادة 8 أضعاف في عدد الخلايا ينبغي أن يؤدي إلى مضاعفة قطر كروي. <html> _content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي الإنتاج كروي. ويتكون النظام من microwell مجموعة من معبأة بإحكام مربع هرمي microwells (625 سم 2 في ل400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ حجم م)، في الخلايا التي قد تكون بالطرد المركزي. يتم إحضارها الخلايا معا عن طريق الجدران الجانبية المنحدرة، ويتم التحكم في حجم كروي الناجم عن كثافة متفاوتة من تعليق الخلية المستخدمة. 50665fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. تجميع خلايا عنقودية في الأجسام الشبه الكروية. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة HT29 خلايا لكل منهما. مباشرة بعد الطرد المركزي (A)، وتتجمع خلايا فضفاضة في الجزء السفلي من كل microwell. لاحظ أن مجموعات ويقابل بشكل موحد نحو أسفل اليمين في هذه الحالة. هذا مقبول بشرط تظل أحجام كتلة متناسقة عبر صفيف. إذا رأيت اختلافات حجم الكتلة كبيرا من جانب واحد من مجموعة إلى أخرى، انظر ملاحظة في الخطوة 3.5. بعد حضانة لمدة 24 ساعة (B)، تسببت قوات لاصقة بين الخلايا مجموعات لتجميع وتشكيل الأجسام الشبه الكروية متماسكة، والتي قد ثم يتم استخراج (C). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> ص /&gt; الشكل 3. الأجسام الشبه الكروية ولدت في لوحات microwell. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة (A، C، E) أو ألف وخمسمائة (B، D، F) خلايا سرطان القولون HT29 (A، B)، LNCaP خلايا سرطان البروستاتا (C، D) أو TE6 خلايا سرطان المريء (E، F). ملاحظة اتساق الكروية ضمن إعداد، وأيضا الاختلاف بين خطوط الخلايا - ولا سيما المجاميع LNCaP فضفاض بالمقارنة مع معبأة أكثر كثافة HT29 والخلايا TE6. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> تنسيق Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> عرض Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Microwells لكل سم 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Microwells لكل بئر </td><td> 1،200 </td><td> 4،700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> الخلايا الحد الأدنى لكل microwell * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> خلايا الأقصى في microwell * </td><td> 2،000 </td><td> 2،000 </td><td> 10،000 </td></tr><tr><td> الحد الأدنى خلايا لكل بئر * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> خلايا أقصى لكل بئر * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70٪ حجم الإيثانول (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - الشطف حجم الحل (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - حجم متوسط ​​التحميل المسبق (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - حجم التحميل الخليوي (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * أرقام من الخلايا في microwell ليست سوى تقريب هذه القيمة كما سوف تختلف مع حجم الخلايا المحددة المستخدمة، وينبغي أن تحدد تجريبيا </td></tr></tbody></table> الجدول 1. AggreWell الخيارات والتعديلات البروتوكول.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

ونحن نقدم بروتوكول لتوليد أعداد كبيرة (آلاف إلى مئات الآلاف) من حجم موحد وتكوين الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها الورم، وذلك باستخدام لوحات microwell متاحة تجاريا.

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.4K Views.  University of Calgary.  ونحن نقدم بروتوكول لتوليد أعداد كبيرة (آلاف إلى مئات الآلاف) من حجم موحد وتكوين الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها الورم، وذلك باستخدام لوحات microwell متاحة تجاريا. 

Video: Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

إنتاج المواد الكيميائية من قبل<em&gt; كليبسيلا بنيومونياي</em&gt; استخدام الخيزران هدروليزيت كمادة وسيطة

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video