أظهر هذا البروتوكول طريقة موحدة لبناء أورام ثلاثية الأبعاد من الأجسام الكروية. وقدمت هذه المنهجية دائرة عالية وتحليل محتوى عالي لتركيبات الورم 3D. باستخدام طريقة قياسية لبناء كروي الورم ونظام تصوير وتحليل عالي الإنتاجية ، يمكن زيادة فعالية ودقة اختبارات الأدوية التي تشكلت على كرويات ثلاثية الأبعاد بشكل كبير.
في هذا البروتوكول ، استخدمنا AMG510 لعلاج كروي NCI-H23 كمثال. من التجربة ، يمكننا ملاحظة تأثير كبير للدواء السرطاني المستهدف على كرويات الورم. للبدء ، ماصة 100 ميكرولتر من كاشف مضاد الالتصاق في كل بئر من صفيحة بئر 48 مع قاع بئر على شكل حرف U واحتفظ بها لمدة 10 دقائق.
بعد 10 دقائق ، نضح كاشف الطلاء واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم. ضع طبق الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. مراقبة الخلايا تحت المجهر.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا المزروعة في قارورة T25 مرتين باستخدام PBS لإزالة وسط المزرعة ومعالجة الخلايا الموسعة بملليلتر واحد من 0.25٪ trypsin EDTA لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكيد شكل الخلية تحت المجهر. ثم أوقف علاج التربسين عن طريق استنشاق معلق التربسين EDTA المستخدم في قارورة T25 وغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من الوسط الطازج.
انقل كل المعلق إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا واستخدم ملليلترا واحدا من الوسط الطازج لغسل الخلايا المتبقية وإضافته إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 186.48 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. أضف 10 ملليلتر من الوسط الطازج إلى حبيبات الخلية وماصة بلطف حتى تصبح الخلايا في تعليق متجانس.
نضح 0.1 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 0.9 ملليلتر من الوسط الطازج ثم ماصة التعليق جيدا. استخراج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا.
كرر هذه العملية مرة أو مرتين وخذ قيمة متوسطة. تمييع التعليق للوصول إلى كثافة البذر النهائية من 50،000 خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة قاع U 48 بئرا.
لف فيلم الختم حول اللوحة وجهاز الطرد المركزي عند 119.35 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اسحب الفيلم الواقي وأضف خمسة إلى ثمانية ملليلتر من الماء المعقم في قناة المياه المحيطة بالآبار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.
لا تقم بتغيير أو تكملة أي ماء إلى قناة المياه خلال هذه الفترة ولاحظ تجمع الخلايا خلال الأيام الخمسة التالية. لتضمين الجل ، بعد إخراج الجل المجمد من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 20 درجة مئوية تحت الصفر ، ضعه على صندوق ثلج طوال الوقت أثناء التجربة. مراقبة كرويات الخلية تحت المجهر.
قبل أن يبدأ تضمين الجل ، يجب التحقق من حالة الأجسام الكروية مرة أخرى. قم بإزالة 150 ميكرولترا من الوسط بعناية وقم بتضمين كل كروي في الجل عن طريق إضافة الجل السائل ببطء من جانب جدار البئر أثناء تحريك طرف الماصة المبرد مسبقا حول البئر وداخله. انتظر لمدة خمس دقائق وإذا لم ينتشر الجل بالتساوي ، ماصة الجل برفق بطرف ماصة 10 ميكرولتر.
يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل. أضف 75 ميكرولترا من الوسط إلى عناصر التحكم أيضا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يكتمل الهلام المائي بالكامل.
تأكيد حالة الهلام تحت المجهر. تراكب 125 ميكرولتر من الوسط الطازج على كل عينة وزراعة الكرويات لمدة 7 إلى 10 أيام أخرى. قم بإعداد مجموعات من الأجسام الكروية مع أربعة إلى ستة آبار لكل منها واختر ثلاثة منها على الأقل للتحليل.
حل الدواء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وإعداد حلول العمل 100 أضعاف مع DMSO. استخدم 0.1٪ DMSO كعنصر تحكم إيجابي وأضف 125 ميكرولترا من الوسط المعالج بالعقاقير إلى كل بئر. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في هذه المرحلة ، يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 175 ميكرولتر من الوسط. تحتوي عناصر التحكم على 200 ميكرولتر من الوسط. قم بقياس الصلاحية الكروية باستخدام مجموعة مقايسة alamarBlue وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
نضح 100 ميكرولتر من الوسط الطافي من كل بئر إلى لوحة اختبار جديدة. بعد ذلك ، قم بقياس الجدوى باستخدام مقياس ضوئي للصفائح الدقيقة. قم بقياسه في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 بعد تضمين الكرات في الجل.
أضف 80 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى كل بئر من طبق الاستزراع. ثم استبدل 100 ميكرولتر أخرى من الوسط المعالج بالعقاقير. تأكد من عدم وجود بقايا من الامار بلو في البئر.
نضح 100 ميكرولتر من الوسط قبل التصوير ووضع اللوحة على المسرح. الحصول على صور رقمية للكرويات باستخدام مجهر آلي بهدف عشرة أضعاف. يمكن للمجهر تركيز هذه الكرويات ومركزيتها تلقائيا.
انتظر التصوير التلقائي. يتم الحصول على أربع صور لكل كروي. يتم تشكيل صورة متكاملة ومعالجتها باستخدام البرنامج المتصل بنظام التصوير عالي المحتوى.
انقر فوق زر عملية تصحيح الصور واختر الصور المدمجة في البرنامج. اختر نموذج U net واكتب معدل التحويل. انقر في الجزء السفلي من الشاشة لبدء معالجة الصور.
احفظ بيانات القطر والمحيط والخشونة في برنامج جداول البيانات. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج مع الدواء وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في الهواء المرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يظهر في هذا الشكل صور برايت فيلد لكرويات الخلايا NCI-H23 المعالجة بتركيزات مختلفة من AMG510 والتي تم التقاطها تلقائيا بواسطة مجهر عالي المحتوى.
تمثل الأعمدة أياما مختلفة وتمثل الصفوف تركيزات مختلفة من المخدرات. وتشمل النتائج ثلاث كرويات لكل حالة. تم قياس صلاحية كروية الورم لمجموعات العينات المعالجة AMG510 في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10.
يظهر هذا الشكل صلاحية الخلية الطرفية للعينات ذات تدرجات التركيز. تم قياس أقطار كروية الورم في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10. تم تعريف نسبة النمو الكروي على أنها الحجم النهائي بالنسبة للحجم الأصلي وحسابها باستخدام أقطار كروية.
تم تعريف نسبة تثبيط النمو الكروي بالنسبة للحجم وحسابها باستخدام أقطار كروية. تم قياس خشونة الورم بواسطة البرنامج في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 ، مما يشير إلى غزو كرويات الورم. تم تحديد محيط الكروي ورسمه بواسطة البرنامج باستخدام خوارزميات التعلم العميق.
ثم تم قياس المناطق الكروية في المستوى البؤري بواسطة الصورة J وتم حساب مؤشر محيط زائد بناء على هذه البيانات. على الرغم من سهولة متابعة هذه الرسالة ، إلا أن العينات لا تزال بحاجة إلى التعامل معها بعناية.
