فإن الكتاب أود أن أنوه أعضاء في الماضي والحاضر من المختبر كيم، مارك Nilan للرعاية الزرد والصيانة، والدكتور روبرت ويلر لإجراء مناقشات مفيدة وتبادل البيانات، والمعاهد الوطنية للصحة منح 3RO1GM087308-02S1 و1P20RR024475-01A2 ومين الزراعية والغابات تجربة محطة (عدد النشر 3303) للحصول على التمويل.

1. رعاية الزرد والصيانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تربية: تفرخ قداس الزرد الكبار كما هو موضح سابقا 13. جمع الأجنة ولدت كما هو موضح سابقا 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مكروي (إذا رغبت): Microinject 1-4 مرحلة خلية الأجنة الزرد مع أليغنوكليوتيد] morpholino ضربة قاضية لمنتجات الجين أو مرنا إلى overexpress منتجات الجين كما هو موضح سابقا 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مجموعة كافية من الضوابط وهمية حقن (لا يقل عن 48 المعيشة، حقن وهمية الأسماك السيطرة و48 المعيشة، وهناك حاجة إلى التلاعب الأسماك تجريبيا لملء البئر صفيحة ميكروسكوبية 96). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأجنة: نمو الأجنة في أطباق بتري العميق عند 28 درجة مئوية في الماء البيض (60 ميكروغرام / مل الفوري المحيط بحر الملح في الماء المقطر-تعقيمها) حتى المرحلة التنموية المنشودة (استجابة الجهاز التنفسي هو انفجار لا يمكن كشفها باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة الزرد الذين تقل أعمارهم عن 2 يوما بعد الإخصاب 12). ملاحظة: لقد كان سbserved أن منع تصبغ في الأجنة الزرد إما عن طريق استخدام 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU) أو الزرد متحولة golden/slc24a5 لا يغير كثيرا من تحريض من قبل سلطة النقد الفلسطينية مضان (بيانات غير منشورة، الأجنة اختبارها في 48، 72، و 96 HPF). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجنة الميتة يوميا مع ماصة نقل البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الماء بعناية البيض القديمة وتجديد بالماء بيضة جديدة يوميا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة Dechorionate: في يوم من التجربة والأجنة dechorionate (إن الأجنة لا تزال في chorions الخاصة بهم) كما هو موضح سابقا باستخدام اثنين من ملقط غرامة 14 (هذا الاندفاع فحص الجهاز التنفسي يمكن أيضا إجراء تشريح على الكلى من الزرد الكبار 12 و بروتوكولات مفصلة عن الكلى تشريح من الزرد الكبار وقد وصفت في وقت سابق 16،17). </li></ol> 2. إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من H2DCFDA: زن من 1 ملغ من H2DCFDA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديssolve 1 ملغ من H2DCFDA في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مأخوذة 22 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف مأخوذة من H2DCFDA حل الأسهم في رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في الظلام كلما كان ذلك ممكنا لأن H2DCFDA هو الحساسة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مأخوذة متجر H2DCFDA في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيه - إعداد محلول المخزون من خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية): زن من 1 ملغ من سلطة النقد الفلسطينية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل القفازات، نظارات واقية وقناع). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل سلطة النقد الفلسطينية في 1 مل من DMSO لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 11 ميكرولتر مأخوذة في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن aliquots من سلطة النقد الفلسطينية حل السهم عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل H2DCFDA بإضافة جزء 1 محلول المخزون H2DCFDA إلى 1جزء DMSO (500 ميكروغرام / مل H2DCFDA تركيز النهائي). على سبيل المثال، إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون H2DCFDA و 20 ميكرولتر DMSO إلى رقائق ملفوفة 1.7 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل سلطة النقد الفلسطينية وذلك بإضافة جزء 1 محلول المخزون سلطة النقد الفلسطينية إلى 49 أجزاء المياه nuclease حرة (20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي سلطة النقد الفلسطينية). على سبيل المثال، وتمييع 10 ميكرولتر حل سلطة النقد الفلسطينية الأسهم في 490 ميكرولتر المياه nuclease خالية في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل الجرعات H2DCFDA مع تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل H2DCFDA في الماء البيض. يمكن تعديل وحدات التخزين أعدت للحلول الجرعات كما تريد، ولكن تأكد من أن تركيزات النهائي من الكواشف والحفاظ عليها. على الكلى، بدلا من الماء البيض، واستخدام نفس حجم medium/F-12 تعديل Dulbecco والنسر (50٪ DMEM، و 50٪ F-12، من دون أحمر الفينول). لجعل 5 مل من H2DCFDAالجرعات الحل، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي ملفوفة في احباط وصفت &#39;H&#39;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من المياه البيض (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى &#39;H&#39; وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى &#39;H&#39; ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 الجنين أو عينات الكلى (نصف كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا) وسوف توفر هذه الآبار قياسات مستوى من مضان الخلفية). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل حل H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الجرعات مع تركيزات النهائي من: H2DCFDA - 1 ميكروغرام / مل وسلطة النقد الفلسطينية - 400 نانوغرام / مل. لجعل 5 مل من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) في أنبوب 15 مل المخروطية الجديد المسمى &#39;H + P&#39;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 110 _6؛ لتر من الماء بيضة (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى &#39;H + P&#39; وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل، ثم إضافة 100 ميكرولتر من حل سلطة النقد الفلسطينية العاملة في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى &#39;H + P&#39; ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 عينات أو النصف الآخر من كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على حلول الجرعات على الجليد. </li></ol> 3. صفيحة ميكروسكوبية قارئ البرمجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصك: السلطة على القارئ صفيحة ميكروسكوبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء مصدر الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع برنامج لقراءة مضان: مثل الإثارة: 485 نانومتر؛ الانبعاثات: 528 نانومتر؛ بصريات الوظيفة: أعلى 510 نانومتر؛ الحساسية: 65، مع الهز الخطوة 5 ثانية قبل القراءة. </li></ol></li></ol> 4. حسنا 96 صفيحة ميكروسكوبية إعداد (انظر الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع اللوازم: الحصول الأطباق مع الأجنة dechorionated، أسود 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا، P200 pipettor ونصائح، دلو الثلج مع H2DCFDA وحلول الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية، P200 pipettor الأقنية، واثنين من الخزانات المعقمة، رقائق الألومنيوم، ومقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة واحد في كل بئر من 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا: استخدام مقص لقطع طرف ماصة بحيث الأجنة أو الكلى مناسبا من خلال فتح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين pipettor P200 إلى 100 ميكرولتر ونقل جنين واحد جنبا إلى جنب مع الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى أكبر عدد ممكن من آبار سوداء 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا كما تريد (ليس من الضروري تغيير غيض ماصة لكل مختلفة عينة الجنين داخل حالة تجريبية، ولكن قد يكون من الضروري تغيير نصائح بين الظروف التجريبية). تأكد من تجنب نقل chorions المتبقية، وهذه تميل إلى الانحراف البيانات التي تم جمعها. لنقل الكلى، وهو pipettor حجم أكبر (لتعيين 100 ميكرولتر) يمكن استخدامها، ويمكن خفض نصائح ماصة للحصول على حجم أكبر تتحمل، إذا لزم الأمر. قد يكون من الضروري لدمج الآبار دون الجنين أو الكلى العينات، ولكن معالحلول الجرعات للسيطرة على بعض التلاعب التجريبية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حلول الجرعات: صب H2DCFDA الحل الجرعات في العقيمة 25 مل الخزان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لماصة في وقت واحد 100 ميكرولتر من الحل H2DCFDA الجرعات في عمود واحد على البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (500 نانوغرام / مل تركيز النهائي من H2DCFDA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا (تغيير نصائح ليس من الضروري) للعديد من كأعمدة كما تريد (عادة ستة أعمدة أو 48 بئرا إذا يملأ كامل صفيحة ميكروسكوبية 96 أيضا). إضافة إلى هذا الحل نصف العينات الجنين السيطرة والنصف من العينات الجنين التلاعب بشكل تجريبي (ويرد مثالا جيدا 96 صفيحة ميكروسكوبية حتى في الشكل 2، وهذه الآبار (برتقالي اللون) ستوفر البيانات مضان الخلفية في عينات لا يسببها مع سلطة النقد الفلسطينية) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الحل الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية في عالم جديد، خزان معقم 25 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لsimultaneously ماصة 100 ميكرولتر من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات في الأعمدة المتبقية (باللون الأحمر في الشكل 2) من البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (تغيير نصائح ليست ضرورية، تركيزات النهائي من H2DCFDA-500 نانوغرام / مل وPMA-200 نانوغرام / مل) . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صفيحة ميكروسكوبية بورق الألمنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز صفيحة ميكروسكوبية لحوالي 20 ثانية في 150 دورة في الدقيقة إلى التجانس الحلول في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية عندما لا يتم قراءتها. </li></ol> 5. مضان الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة صفيحة ميكروسكوبية في الوقت = 0 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية باستخدام المعلمات هو موضح في الخطوة 3.1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة اتخاذ قياسات كل بضع دقائق لالفاصل الزمني المطلوب أو احتضان رقائق ملفوفة صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية حتى نقطة وقت لاحق ومن ثم اتخاذ قياس نقطة النهاية في الوقت المطلوب (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ر البلاستيكاملحول ماصة لاسترداد الأجنة من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الأجنة وفقا لرعاية الحيوان واستخدام البروتوكول، على سبيل المثال الانغماس في تريكين MS222. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من صفيحة ميكروسكوبية ومواد أخرى يمكن التخلص منها في حاوية النفايات biohazardous. </li></ol> 6. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البت في نقطة الوقت الذي كنت ترغب في مقارنة القيم مضان (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية، الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح قيمة مضان متوسط ​​المجموعة الضابطة التي يسببها الغير من القيم مضان السيطرة على المجموعة الفردية سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا لصالح المجموعة التجريبية مع وبدون سلطة النقد الفلسطينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين هذه القيم مضان تطبيع في عمودين، ومراقبة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة التجريبية (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية للقيم مضان تطبيع للسيطرة + سلطة النقد الفلسطينية الحبوع والتجريبية مجموعة + سلطة النقد الفلسطينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة القيم مضان تطبيع باستخدام المفردة اختبار t لتحديد الدلالة الإحصائية (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرسم البياني وسائل السيطرة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة تجريبية مع أشرطة الخطأ تعكس الانحرافات المعيارية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل مستوى الدلالة على الرسم البياني وفي أسطورة الرقم (الشكل 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity:+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response.">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish,+Danio+rerio:+A+Gene+expression+Profiling.">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li><li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Profiling+and+Functional+Analyses+of+the+Zebrafish+Embryonic+Innate+Immune+Response+to+Salmonella+Infection.">Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection.</a> J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).</li><li>Ordas, A., Hegedus, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Sequencing+of+the+Innate+Immune+Transcriptomic+Response+of+Zebrafish+Embryos+to+Salmonella+Infection.">Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection.</a> Fish &amp; Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transgenic+Zebrafish+Model+of+Neutrophilic+Inflammation.">A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation.</a> Blood. 13, 3976-3978 (2006).</li><li>Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+Inflammation+by+Retrograde+Chemotaxis+of+Neutrophils+in+Transgenic+Zebrafish.">Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).</li><li>Ellett, F., Pase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+Promoter+Transgenes+Direct+Macrophage-Lineage+Expression+in+Zebrafish.">mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish.</a> Blood. 4, 56-56 (2011).</li><li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Zebrafish+is+Mediated+by+the+Cystic+Fibrosis+Transmembrane+Conductance+Regulator.">Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.</a> Infect. Immun. 11, 4542 (2010).</li><li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Reveals+Role+of+Phagocyte+Oxidase+in+Limiting+Filamentous+Growth.">Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth.</a> Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).</li><li>Rotman, J., van Gils, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+of+Innate+Immune+Gene+Expression+in+Zebrafish+using+Reverse+Transcription+-+Multiplex+Ligation-Dependent+Probe+Amplification.">Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification.</a> BMC Research Notes. 4, (2011).</li><li>d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Chemically+Induced+Inflammation+Assay+in+Zebrafish.">A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish.</a> BMC Biology. 8, 151 (2010).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Respiratory+Burst+Assay+using+Zebrafish+Kidneys+and+Embryos.">Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos.</a> Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).</li><li>Avdesh, A., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+Laboratory:+An+Introduction.">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Brothers, K. M., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Larvae.">Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney.">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish.">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).</li><li>Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Unconventional+Behavior+of+Neutrophils+in+Developing+Zebrafish.">Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li><li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'Definitive'+(and+'Primitive')+Guide+to+Zebrafish+Hematopoiesis.">The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li><li>Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Stimuli+Change+Expression+of+Genes+and+Neutrophil+Function+in+Fathead+Minnow+Pimephales+promelas+Rafinesque.">Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque.</a> Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Scale+Gradient+of+Hydrogen+Peroxide+Mediates+Rapid+Wound+Detection+in+Zebrafish.">A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish.</a> Nature. 459, 996-1000 (2009).</li><li>Thisse, B., Pflumio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+zebrafish+genome+during+embryogenesis.+(NIH+R01+RR15402).">Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402).</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2001).</li><li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Release+Clones:+A+High+Throughput+Expression+Analysis.">Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis.</a> ZFIN Direct Data Submission. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Table+18.4.">Table 18.4.</a> The Molecular Probes Handbook. , .</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الوظيفة الأساسية للالبالعات هو الكشف، تبتلع، وتدمير مسببات الأمراض. قدرة البالعات لإنتاج انفجار الجهاز التنفسي أمر بالغ الأهمية الكافية لهذه المهمة. وبالتالي، القياس الكمي للاستجابة انفجار الجهاز التنفسي هو أسلوب واحد للسماح للمقارنة بين الصحة العامة والمناعة ال...

ويتكون الجهاز المناعي من فرعين: المناعة الفطرية والتكيفية. المناعة الفطرية هي أكثر تطويريا القديمة من الحصانة على التكيف. ويعتقد حاليا أن يكون اللافقاريات المناعة الفطرية فقط، في حين تمتلك كل من الفقاريات فروع الفطرية والتكيفية. في حين الحصانة التكيف يمنح الحصانة محددة وطويلة الأمد لبعض مسببات الأمراض، والحصانة الفطرية هو استجابة فورية لغزو البكتيريا، والفيروسات، والفطريات. أحد الجوانب الحاسمة للاستجابة المناعية الفطرية ينطوي على الإفراج عن السيتوكينات و chemokines، مما يؤدي إلى التهاب وتجنيد البالعات (مثل الضامة، العدلات) لابتلاع وتدمير الغزاة الأجانب. الاستجابات المناعية الفطرية الناجحة تنطوي على: (1) الاعتراف الكائنات الدقيقة الغازية، (2) تحريض من أجهزة الطرد المركزي الإشارات المناسبة (على سبيل المثال الإفراج عن السيتوكينات وكيموكينات)، (3) التنمية السليمة / أعداد كافية من الخلايا البلعمية، (4) هجرة البالعات إلى مواقع الإصابة، (5) الإحاطة من مسببات الأمراض، و (6) تدمير الكائنات الحية الدقيقة غارقة. وهناك نقص في أي واحدة من هذه الخطوات يمكن أن تؤدي إلى المضيف طغيان، والخضوع ل، والعدوى. A الاستجابة المناعية الفطرية قوية أمر حيوي لصحة الكائنات الحية لأنها خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض في جميع النباتات والحيوانات. في الفقاريات، فإنه يقوي أيضا الاستجابة المناعية التكيفية 1. لذا، فمن الأهمية بمكان أن نكون قادرين على تقييم جميع جوانب الاستجابة المناعية الفطرية من أجل فهم أفضل وذلك لتحسين وظيفتها. وتستخدم العديد من الكائنات الحية نموذج لدراسة المناعة الفطرية، بدءا من Arabadopsis إلى C. ايليجانس لذبابة الفاكهة إلى الفئران إلى الخلايا البشرية المستزرعة. ميزة لاستخدام الزرد (دانيو rerio) نظام نموذجي لدراسة المناعة الفطرية هي أن الزرد هو الفقاريات، مع كل الفطرية والتكيفية ايمفقد المناعة، إلا أن تطور المناعة الفطرية والتكيفية يتم فصل زمنيا. الزرد تعتمد فقط على الحصانة الفطرية للوقاية من العدوى حتى يصبح الحصانة التكيف تعمل بكامل طاقتها، والذي يحدث بعد حوالي 4-6 أسابيع الإخصاب 2. بالإضافة إلى أدوات للتلاعب الجيني، والوضوح البصري، وتنمية الخارجية السريعة، والحصانة الفطرية كوضع مبدأ الدفاع في الأجنة الزرد توفر نموذج مبسط للدراسة تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية في الجسم الحي. وقد وضعت بروتوكولات متعددة لتقييم جوانب مختلفة من الاستجابة المناعية الفطرية في الأجنة الزرد. والتحقق من صحتها وميكروأرس RNAseq أن ملامح خلوى التي تسببها الاستجابة المناعية الفطرية الزرد هي مماثلة لتلك التي للبشر ولقد اقترح أيضا إشراك الجينات غير متوقعة في المناعة الفطرية 3،4. شفافية الجنين الزرد والفلورسنت، transgenجيم سلالات من مسببات الأمراض والزرد تسمح لرؤية ديناميكية التفاعلات المضيف الممرض في الجسم الحي في الوقت الحقيقي. جعلت الأجنة الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP تحت سيطرة العدلات محددة الميلوبيروكسيداز المروج 5،6 أو بلعم محددة MPEG1 المروج 7 من الممكن تصور وقياس الهجرة بلعمية إلى مواقع الالتهابات الموضعية 8 وكذلك لتصور البلعمة وتدمير fluorescently المسمى مسببات الأمراض 8،9. الأجنة الزرد هي أيضا قابلة للتوليد فحوصات عالية الإنتاجية وشاشات الكيميائية. وفقا لذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب إنتاجية عالية من التحليل Transcriptome على بناء 10 وإصابة الهجرة بلعمية إلى مواقع الإصابة التي يسببها كيميائيا 11. من التقنيات المذكورة أعلاه، فإن أيا كميا تقييم المرحلة النهائية من الدمار من قبل الممرض البالعات. هذه المرحلة النهائيةينطوي على انفجار الجهاز التنفسي (أي إنتاج ريوس والمركبات السامة الأخرى)، والذي قتل مسببات الأمراض اجتاحت. أوكسيديز NADPH الانزيم هو المصدر الرئيسي للROS في الخلايا البلعمية. تجميع مفارز من نتائج انزيم أوكسيديز NADPH في نقل الإلكترونات إلى الأكسجين، وتوليد الأنيونات الفائق. من خلال التفاعلات الإنزيمية لاحقة، ويمكن بعد ذلك تحويلها الفائق في بيروكسيد الهيدروجين وحمض تحت الكلور (الشكل 1A). هو انفجار الجهاز التنفسي من البالعات الذي يقتل مسببات الأمراض وبالتالي، فإن القياس الكمي لإمكانات الجهاز التنفسي انفجار الأجنة الزرد يدل على صحة المناعة الفطرية بشكل عام. وضعنا مقايسة على أساس مضان لقياس انفجر الجهاز التنفسي في مجموعات من الأجنة الزرد الفردية 12. يستخدم هذا الاختبار في غير الفلورسنت، وانخفاض شكل، صبغة خلايا قابلة للاختراق متاحة تجاريا. هذه الصبغة، 2 &#39;، 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (H2DCFDA)، يتم تحويلها إلى الفلوريةمجمع المائة، 2 &#39;، 7&#39;-dichlorofluorescein (DCF)، بناء على الأكسدة. يمكن للROS المتنوعة الناتجة عن انفجار الجهاز التنفسي بلعمية أكسدة H2DCFDA وتوليد مضان 24. ظهور مضان يمكن استخدامها لقياس ومقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي بين مجموعات من الزرد. ويستخدم البروتين كيناز C خلات ناهض phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) للحث على كيميائيا أوكسيديز NADPH لإنتاج ريوس وبالتالي زيادة قراءات مضان (الشكل 1B). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة من نسخة معدلة ومحسنة من هذا الجنين الزرد الجهاز التنفسي انفجار الفحص. هذا الاختبار يمكن استخدامها للمقارنة بين انفجار الجهاز التنفسي بين مجموعات من الأجنة الزرد الفردية مع مرور الوقت و / أو استجابة لالتلاعب التجريبية (مثل morpholino بوساطة البروتين ضربة قاضية). استخدام هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع غيرها من فحوصات المناعة الفطرية الزرد، وتقديم صورة أكثر اكتمالا من المعقدة والحرجةالاستجابة المناعية الفطرية.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

انفجار الجهاز التنفسي بلعمية هي جزء من الاستجابة المناعية الفطرية للإصابة الممرض وينطوي على إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). ROS سامة وتعمل على قتل الكائنات الحية الدقيقة phagocytized. في الجسم الحي الكمي للالمشتقة بلعمية ROS يوفر معلومات بشأن قدرة الكائن الحي على شن استجابة مناعية فطرية قوية. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد ومقارنة ROS في الأجنة الزرد كله على الحث الكيميائي للانفجار الجهاز التنفسي بلعمية. هذا الأسلوب يجعل من استخدام مركب غير الفلورسنت التي يصبح الفلورسنت على الأكسدة التي كتبها ROS. و pipetted الأجنة الزرد الفردية في آبار من صفيحة ميكروسكوبية والمحتضنة في هذا الركيزة الفلورة مع أو من دون محفز الكيميائية للانفجار في الجهاز التنفسي. وكميا مضان في كل بئر في نقاط زمنية المطلوب باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم تعديل قراءات مضان للقضاء على مضان الخلفية ثم شاركmpared باستخدام المفردة اختبار t. يسمح هذا الأسلوب للمقارنة من احتمال انفجار الجهاز التنفسي الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة وردا على التلاعب التجريبية مثل ضربة قاضية البروتين، من overexpression، أو العلاج مع وكلاء الدوائية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الكلى تشريح كله أو مستحضرات خلية من الكلى من الزرد الكبار وبعض أنواع الأسماك الأخرى. ونحن نعتقد أن البساطة النسبية والقدرة على التكيف من هذا البروتوكول سوف تكمل البروتوكولات القائمة وسوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يسعون إلى فهم أفضل للاستجابة المناعية الفطرية.

هنا، ونحن نقدم بيانات مقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الأجنة الزرد (من النوع البري، AB الخلفية) في 48 و 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). 48 HPF الأجنة بمثابة المجموعة الضابطة لدينا و72 HPF الأجنة كمجموعة تجريبية لدينا. وكان حجم العينة المستخدمة 24 الأجنة التي يسببها للامم المتح?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish at JoVE.com

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الاستجابة المناعية الفطرية يحمي الكائنات الحية من الإصابة الممرض. وثمة عنصر حاسم من الاستجابة المناعية الفطرية، وانفجر الجهاز التنفسي بلعمية، وتولد أنواع الاكسجين التفاعلية التي تقتل الكائنات الدقيقة الغازية. نحن تصف مقايسة انفجر الجهاز التنفسي يحدد مقدار أنواع الاكسجين التفاعلية تنتج عندما يتم الناجم عن الاستجابة المناعية الفطرية كيميائيا.

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K Views.  University of Maine.  الاستجابة المناعية الفطرية يحمي الكائنات الحية من الإصابة الممرض. وثمة عنصر حاسم من الاستجابة المناعية الفطرية، وانفجر الجهاز التنفسي بلعمية، وتولد أنواع الاكسجين التفاعلية التي تقتل الكائنات الدقيقة الغازية. نحن تصف مقايسة انفجر الجها...

Video: Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...