Los autores desean agradecer a los miembros anteriores y actuales del laboratorio de Kim, Mark Nilan para el cuidado de pez cebra y el mantenimiento, el Dr. Robert Wheeler útil para los debates y el intercambio de datos, y las subvenciones del NIH 3RO1GM087308-02S1 y 1P20RR024475-01A2 y el Maine Agrícolas y Forestales Estación Experimental (Publicación 3303) para su financiación.

1. Cuidado y mantenimiento de pez cebra <ol><li> Ganadería: spawn Misa adultos de pez cebra como se ha descrito previamente 13. Recoger los embriones generados como se ha descrito previamente 14. </li><li> La microinyección (si se desea): microinject 1-4 etapa de célula embriones de pez cebra con oligonucleótidos de morfolino a desmontables productos de genes o de ARNm para sobreexpresar productos de genes como se ha descrito previamente 15. <ol><li> Mantener un número adecuado de simulacro controles inyectados (por lo menos 48 Viviendo, maqueta inyecta peces de control y 48 Viviendo, pescado manipulado experimentalmente se necesitan para llenar un pozo de microplacas 96). </li></ol></li><li> Mantener embriones: Crecer embriones en placas de Petri de profundidad a 28 ° C en agua de huevo (60 g / ml instantánea del mar del océano de la sal en el agua destilada en autoclave-) hasta la etapa de desarrollo que desee (una respuesta estallido respiratorio no es detectable mediante este protocolo en embriones de pez cebra menores de 2 días después de la fertilización 12). Nota: Ha sido observed que la prevención de la pigmentación en embriones de pez cebra a través de ya sea el uso de 1-fenil 2-tiourea (PTU) o el pez cebra mutante golden/slc24a5 no altera significativamente la inducción de la fluorescencia por PMA (datos no publicados, los embriones a las 48, 72, y 96 HPF). <ol><li> Retire embriones muertos a diario con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Decantar cuidadosamente el agua del huevo de edad y reponer con agua nueva diaria de huevos. </li></ol></li><li> Embriones Dechorionate: En el día del experimento, los embriones dechorionate (si los embriones se encuentran todavía en sus chorions) como se describió anteriormente utilizando dos pinzas finas 14 (este ensayo estallido respiratorio también se puede realizar en los riñones disecados de adultos de pez cebra 12 y los protocolos detallados para los riñones la disección de adultos de pez cebra se han descrito anteriormente 16,17). </li></ol> 2. Preparación de la Solución <ol><li> Preparar una solución madre de H2DCFDA: Pesar 1 mg de H2DCFDA. <ol><li> Dissolve 1 mg de H2DCFDA en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución de 1 mg / ml. </li><li> Hacer 22 alícuotas de esta solución madre en 1,7 ml tubos de microcentrífuga. </li><li> Envuelva las alícuotas de H2DCFDA solución madre en papel de aluminio y guardar en la oscuridad siempre que sea posible, porque H2DCFDA es sensible a la luz. </li><li> Alícuotas tienda H2DCFDA a -20 ° C hasta por 3 meses. </li></ol></li><li> PRECAUCIÓN - Preparar una solución madre de acetato miristato de forbol (PMA): Pesar 1 mg de PMA utilizando el equipo adecuado de protección personal (por ejemplo, guantes, gafas y mascarilla). <ol><li> Disolver la PMA en 1 ml de DMSO para obtener una solución madre de 1 mg / ml. </li><li> Hacer 11 alícuotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga. </li><li> Tienda alícuotas de PMA solución madre a -80 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Prepare una solución de trabajo de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo H2DCFDA añadiendo 1 parte de solución H2DCFDA acciones a 1DMSO parte (concentración final de 500 mg / ml H2DCFDA). Por ejemplo, añadir 20 l de solución madre H2DCFDA y 20 l de DMSO a una lámina envuelto 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Prepare una solución de trabajo de PMA: En el día del experimento, hacer una solución de trabajo PMA mediante la adición de 1 parte de solución de PMA acciones a 49 partes por nucleasa libre de agua (concentración final de 20 mg / ml de PMA). Por ejemplo, diluir 10 l PMA solución madre en 490 l de nucleasa libre de agua en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. </li><li> Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA: En el día del experimento, hacer una solución de dosificación H2DCFDA con una concentración final de 1 mg / ml en agua H2DCFDA huevo. Los volúmenes preparados de las soluciones de dosificación se pueden modificar si lo desea, pero asegúrese de que se mantienen las concentraciones finales de los reactivos. Para los riñones, en lugar de agua de huevo, usar el mismo volumen de medium/F-12 de Dulbecco modificado de Eagle (50% de DMEM, 50% de F-12, sin rojo de fenol). Para hacer 5 ml de H2DCFDAdosificación de solución, utilice un 5 ml pipeta serológica para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un 15 ml tubo de centrífuga cónico envuelto en papel de aluminio y etiquetado &#39;H&#39;. <ol><li> Retire 10 l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como &#39;H&#39; y descarte. </li><li> Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA en el tubo cónico de 15 ml etiquetado &#39;H&#39; y agitar para mezclar (en este volumen es suficiente para 48 embriones o muestras de riñón (la mitad de un muy bien microplaca 96) y estos pozos suministrarán mediciones de nivel de la fluorescencia de fondo). </li></ol></li><li> Preparar una solución de dosificación de H2DCFDA + PMA: En el día del experimento, hacer una solución H2DCFDA + PMA de dosificación con concentraciones finales de: H2DCFDA - 1 g / ml y PMA - 400 ng / ml. Para hacer 5 ml de solución de dosificación H2DCFDA + PMA, utilizar una pipeta serológica de 5 ml para transferir 5 ml de agua de huevo (o DMEM/F-12) en un nuevo tubo cónico de 15 ml etiquetados &#39;H + P&#39;. <ol><li> Retire 110 _6; l de agua de huevo (o DMEM/F-12) a partir de los 15 ml tubo cónico como &#39;H + P&#39; y descarte. </li><li> Añadir 10 l de solución de trabajo H2DCFDA, a continuación, añadir 100 l de solución de trabajo de PMA en el tubo cónico de 15 ml etiquetados &#39;H + P&#39; y mezclar en vórtex (este volumen es suficiente para 48 muestras o el otro medio de un completo así microplaca de 96 ). </li></ol></li><li> Mantenga las soluciones de dosificación en el hielo. </li></ol> 3. Lector de microplacas Programación <ol><li> Preparar el instrumento: Encienda el lector de microplacas. <ol><li> Calentar la fuente de luz. </li><li> Establecer un programa para leer la fluorescencia: por ejemplo, excitación: 485 nm; emisión: 528 nm; Óptica Posición: top 510 nm; Sensibilidad: 65, con un temblor paso 5 segundos antes de la lectura. </li></ol></li></ol> 4. 96 Bueno microplacas Set Up (ver Figura 2) <ol><li> Reúna los materiales: Obtenga platos con embriones dechorionated, negro microplaca 96, pipeta p200 yconsejos, cubo de hielo con H2DCFDA y soluciones de dosificación H2DCFDA + PMA, multicanal p200 pipeta, dos depósitos de estériles, papel de aluminio y tijeras. </li><li> Transferencia de un embrión en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos: Utilice unas tijeras para cortar una punta de pipeta de tal manera que los embriones o los riñones en forma a través de la abertura. <ol><li> Establecer una pipeta p200 a 100 l y transferir un embrión junto con el agua de huevo (o DMEM/F-12) en la mayor cantidad de los pocillos de una microplaca de 96 negro así lo desea (no es necesario cambiar la punta de la pipeta para cada diferente muestra embrión dentro de una condición experimental, pero puede ser necesario cambiar las puntas entre las condiciones experimentales). Asegúrese de evitar la transferencia de chorions residuales, ya que estos tienden a sesgar los datos recogidos. Para la transferencia de los riñones, una pipeta de volumen grande (ajustado a 100 l) se puede utilizar y puntas de pipeta puede ser cortado para obtener un tamaño de diámetro más grande, si es necesario. Puede ser necesario incorporar pocillos sin muestras de embriones o renales, pero conlas soluciones de dosificación para controlar para algunas manipulaciones experimentales. </li></ol></li><li> Añadir soluciones de dosificación: Verter solución de dosificación H2DCFDA en un estéril 25 ml depósito. <ol><li> Utilizar una pipeta multicanal y p200 ocho consejos para pipetear simultáneamente 100 l de solución de dosificación H2DCFDA en una columna en la microplaca de 96 pocillos (concentración final 500 ng / ml de H2DCFDA). </li><li> Repita este (cambiando las propinas no es necesario) para tantas columnas como se desee (normalmente seis columnas o 48 pozos si llenar toda una microplaca de 96 pocillos). Añadir esta solución a la mitad de las muestras de embriones de control y la mitad de las muestras de embriones manipulados experimentalmente (un ejemplo de 96 pocillos de microplacas configurado se muestra en la figura 2, estos pozos (de color naranja) proporcionará los datos de fluorescencia de fondo en las muestras no inducidas con PMA) . </li><li> Verter la solución de dosificación H2DCFDA + PMA en una nueva, depósito de 25 ml estéril. </li><li> Use una pipeta multicanal p200 y ocho consejos para simultaneously pipetear 100 l de solución de dosificación H2DCFDA + PMA en las columnas restantes (rojo de color en la figura 2) de la microplaca 96 (de cambiar las boquillas no es necesario, las concentraciones finales de 500 ng H2DCFDA-/ ml y PMA-200 ng / ml) . </li></ol></li><li> Cubrir la placa con papel de aluminio. </li><li> Agite la microplaca durante aproximadamente 20 segundos a 150 rpm para homogeneizar las soluciones en cada pocillo. </li><li> Incubar la microplaca a 28 ° C cuando no se está leyendo. </li></ol> 5. La cuantificación de la fluorescencia <ol><li> Leer la microplaca en el tiempo = 0 h después de la adición de PMA utilizando los parámetros descritos en el paso 3.1.2. <ol><li> Siga tomando mediciones cada pocos minutos para el intervalo de tiempo deseado o se incuba la microplaca lámina envuelto a 28 ° C hasta un momento posterior y luego tomar una medición de punto final a una hora determinada (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA). </li></ol></li><li> Utilice un plástico transfer pipeta para recuperar los embriones procedentes de los pozos. </li><li> La eutanasia a los embriones de acuerdo a su cuidado de los animales y el protocolo de uso, por ejemplo, la inmersión en MS222 tricaína. </li><li> Deshágase de la microplaca y otros materiales desechables en el recipiente para residuos biológicos peligrosos. </li></ol> 6. Análisis de Datos <ol><li> Decidir sobre el punto de tiempo en el que usted desea comparar los valores de fluorescencia (por ejemplo, 4 horas después de la adición de PMA, Tabla 1). </li><li> Restar valor de fluorescencia del grupo de control-inducida ONU promedio de los valores de fluorescencia del grupo de control inducida por PMA individual. </li><li> Repita esto para el grupo experimental con y sin PMA. </li><li> Guarde estos valores de fluorescencia normalizados en dos columnas, el grupo de control + PMA y el grupo experimental + PMA (Tabla 2). </li><li> Calcular las medias y las desviaciones estándar para los valores de fluorescencia normalizados del control + Grou PMAP y el grupo experimental + PMA. </li><li> Comparar los valores de fluorescencia normalizados usando un test t no apareado para determinar la significancia estadística (Tabla 2). </li><li> Gráfico de los medios de control + grupo de PMA y el grupo experimental + PMA con barras de error reflejan las desviaciones estándar correspondientes. </li><li> Anote el nivel de significación en el gráfico y en la leyenda de la figura (Figura 2). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La función primaria de los fagocitos es detectar, engullir, y destruir patógenos. La capacidad de los fagocitos para producir una explosión respiratoria adecuada es crítica para esta función. Por lo tanto, la cuantificación de la respuesta de la explosión respiratoria es un método para permitir la comparación de la salud inmune innata y las funciones generales entre los grupos de personas y / o en respuesta a manipulaciones experimentales. Aquí se describe un protocolo para inducir, cuantificar y comparar la r...

El sistema inmune está compuesto por dos ramas: la inmunidad innata y adaptativa. La inmunidad innata es evolutivamente más antigua que la inmunidad adaptativa. Los invertebrados se cree actualmente que sólo tienen inmunidad innata, mientras que los vertebrados poseen tanto las ramas innata y adaptativa. Mientras que la inmunidad adaptativa confiere inmunidad específica y duradera a ciertos agentes patógenos, la inmunidad innata es una respuesta inmediata a las bacterias invasoras, virus y hongos. Un aspecto crucial de la respuesta inmune innata implica la liberación de citocinas y quimiocinas, lo que resulta en la inflamación y el reclutamiento de fagocitos (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos) para engullir y destruir los invasores extraños. La respuesta inmune innata exitosos involucran: (1) el reconocimiento de microorganismos invasores; (2) la inducción de las cascadas de señalización apropiados (por ejemplo, liberación de citocinas y quimiocinas); (3) de desarrollo adecuado / números adecuados de células fagocíticas; (4) La migración de los fagocitos a sitios de infección; (5) inmersión de patógenos, y (6) la destrucción de microorganismos envueltos. Una deficiencia en cualquiera de estos pasos podría dar lugar al huésped que está siendo abrumado por, y sucumbir a la infección. Una respuesta inmune innata robusta es vital para la salud de los organismos, ya que es la primera línea de defensa contra los patógenos en todas las plantas y animales. En los vertebrados, sino que también potencia la respuesta inmune adaptativa 1. Por lo tanto, es fundamental que seamos capaces de evaluar todos los aspectos de la respuesta inmune innata, a fin de comprender mejor y optimizar su función. Muchos organismos modelo se utilizan para estudiar la inmunidad innata, que van desde Arabidopsis a C. elegans a Drosophila a ratones a células humanas cultivadas. Una ventaja de utilizar el pez cebra (Danio rerio) sistema modelo para estudiar la inmunidad innata es que el pez cebra es un vertebrado, con im tanto innata y adaptativadad, sin embargo, el desarrollo de la inmunidad innata y adaptativa están temporalmente separados. El pez cebra se basan únicamente en la inmunidad innata para la protección contra la infección hasta que la inmunidad adaptativa sea plenamente funcional, que produce alrededor de 4-6 semanas después de la fecundación 2. Además de las herramientas para la manipulación genética, la claridad óptica y rápido desarrollo, externa, la inmunidad innata como el modo de principio de defensa en embriones de pez cebra ofrece un modelo simplificado en el que para estudiar la complejidad de la respuesta inmune innata en vivo. Múltiples protocolos han sido desarrollados para evaluar las diferentes facetas de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra. Microarrays y RNAseq han validado que los perfiles de citoquinas producidas por la respuesta inmune innata de pez cebra son similares a la de los seres humanos y también han sugerido la implicación de los genes inesperados en la inmunidad innata 3,4. La transparencia del embrión de pez cebra y fluorescente, transgenic cepas de patógenos y pez cebra permiten la visualización de las interacciones huésped-patógeno dinámicas in vivo en tiempo real. Embriones de pez cebra transgénicos que expresan GFP bajo el control del promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos-específica 5,6 o el promotor específico de macrófagos MPEG1 7 han hecho posible para visualizar y cuantificar la migración de fagocitos a los sitios de infecciones localizadas 8, así como para visualizar la fagocitosis y la destrucción de marcado con fluorescencia patógenos 8,9. Embriones de pez cebra también son susceptibles a la generación de ensayos de alto rendimiento y pantallas químicos. En consecuencia, recientemente se han desarrollado métodos de alto rendimiento de análisis del transcriptoma después de la infección 10 y fagocitos migración a los sitios de lesión inducida químicamente 11. De las técnicas mencionadas anteriormente, ninguno evaluar cuantitativamente la etapa final de la destrucción de patógenos por los fagocitos. Esta etapa finalimplica un estallido respiratorio (es decir, la producción de ROS y otros compuestos tóxicos), que mata a los patógenos envueltos. La enzima NADPH oxidasa es una fuente importante de ROS en células fagocíticas. Asamblea de las subunidades de la NADPH oxidasa resultados de la enzima en la transferencia de electrones al oxígeno, la generación de aniones superóxido. A través de reacciones enzimáticas posteriores, superóxido a continuación, puede ser convertido en peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (Figura 1A). Es la explosión respiratoria de los fagocitos que mata a los patógenos y, por tanto, la cuantificación de la potencial explosión respiratoria de los embriones de pez cebra es indicativo de la salud inmune innato general. Hemos desarrollado un ensayo basado en la fluorescencia para cuantificar el estallido respiratorio en grupos de embriones de pez cebra individuales 12. Este ensayo utiliza la no fluorescente, forma reducida de un colorante permeable a las células disponibles comercialmente. Este colorante, 2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA), se convierte en el fluorescentecompuesto ciento, 2 &#39;, 7&#39;-diclorofluoresceína (DCF), tras la oxidación. Los diversos ROS generados por el estallido respiratorio de fagocitos pueden oxidar H2DCFDA y generar fluorescencia 24. La aparición de la fluorescencia se puede utilizar para cuantificar y comparar la respuesta de estallido respiratorio entre los grupos de pez cebra. El acetato de miristato de forbol agonista de la proteína quinasa C (PMA) se utiliza para inducir químicamente NADPH oxidasa para producir ROS y por lo tanto aumentar lecturas de fluorescencia (Figura 1B). Aquí, ofrecemos un protocolo detallado de una versión modificada y optimizada de este embrión ensayo estallido respiratorio de pez cebra. Este ensayo se puede usar para comparar el estallido respiratorio entre los grupos de embriones de pez cebra individuales en el tiempo y / o en respuesta a las manipulaciones experimentales (por ejemplo, morfolino mediada desmontables de proteínas). El uso de este método, en conjunción con otros ensayos de inmunidad innata de pez cebra, proporcionará una imagen más completa de la compleja y críticarespuesta inmune innata.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

La explosión respiratoria de los fagocitos es parte de la respuesta inmune innata a la infección por patógenos e implica la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS son tóxicos y funciona para matar los microorganismos fagocitadas. En la cuantificación in vivo de fagocito-ROS derivados proporciona información con respecto a la capacidad de un organismo para montar una respuesta inmune innata robusta. Aquí se describe un protocolo para cuantificar y comparar ROS en embriones de pez cebra enteros tras la inducción química de la explosión respiratoria de los fagocitos. Este método hace uso de un compuesto no fluorescente que se vuelve fluorescente tras la oxidación por ROS. Individuales embriones de pez cebra se pipetean en los pocillos de una microplaca y se incubaron en este sustrato fluorogénico con o sin un inductor químico de la explosión respiratoria. La fluorescencia en cada pocillo se cuantifica en puntos de tiempo deseado utilizando un lector de microplacas. Las lecturas de fluorescencia se ajustan para eliminar la fluorescencia de fondo y después se compared usando una prueba t no pareada. Este método permite la comparación del potencial de explosión respiratoria de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo y en respuesta a manipulaciones experimentales tales como la precipitación de proteínas, la sobreexpresión, o tratamiento con agentes farmacológicos. Este método también puede ser usado para monitorear la respuesta de estallido respiratorio en los riñones disecados enteras o preparaciones de células de riñones de adultos de pez cebra y algunas otras especies de peces. Creemos que la relativa simplicidad y adaptabilidad de este protocolo se complementan los protocolos existentes y serán de interés para los investigadores que buscan comprender mejor la respuesta inmune innata.

Aquí, ofrecemos datos que comparan la respuesta estallido respiratorio en los embriones de pez cebra (de tipo silvestre, AB fondo) a 48 y 72 horas después de la fecundación (HPF). Los 48 embriones HPF actuado como nuestro grupo de control y los 72 HPF embriones como nuestro grupo experimental. El tamaño de la muestra utilizada fue de 24 embriones inducidos por la ONU-y 24 embriones PMA inducida por la etapa de desarrollo. Las lecturas de fluorescencia en bruto (en unidades de fluorescencia relativa (RFU)) se obtuvie...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.6K vistas.  University of Maine.  La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente. 

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...