وتم دعم هذه الجهود البحثية من قبل شعبة المؤسسة الوطنية للعلوم النقل (CBET) نظم تحت أرقام جائزة CBET-0853780-1159344 وCBET والمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (معهد علوم الصحة البيئية) الكيميائية، الهندسة الحيوية، البيئة، و تحت الجائزة عدد 1R43ES022567-01، والمعهد الوطني للسرطان، وبرنامج التصوير السرطان تحت الجائزة عدد CA127745-01. تم الحصول على صك لومينا IVIS المستخدمة في هذا العمل من دفاع الجيش الأجهزة برنامج البحوث جامعة في الولايات المتحدة.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد قارورة من إضاءة الحيوية HEK293 الخلايا من الأوراق المالية السائلة النيتروجين المجمد وتنمو لهم في متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 0.01 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1X مضادات الحيوية مضاد فطري، و 0.01 ملي البيروفات الصوديوم في T 75 الأنسجة قارورة الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. ملاحظة: إن وسائل الإعلام ومكونات تكميلية تختلف بناء على خطوط الخلايا، وبالتالي ينبغي أن يتم اختيار وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث المتوسطة كل 2-3 أيام حتى وصلت ~ 80٪ التقاء. ملاحظة: وسوف يستند كمية من الخلايا المطلوبة على التصميم التجريبي. إذا لزم الأمر، ويمكن الحصول على المزيد من الخلايا عن طريق subculturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا للاختبار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال يحوم بلطف القارورة ومن ثم التخلص من قضى PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة،أو حتى الخلايا قد فصل من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا منفصلة في برنامج تلفزيوني ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. ملاحظة: إذا كنت تستخدم خطوط الخلايا غير ملتصق، وخلايا منفصلة بواسطة الطرد المركزي ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إجمالي عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو غيرها من نظام العد الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في العذبة والمتوسطة prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أرقام البذور متساو من الخلايا في الآبار الفردية لوحة متعددة جيدا مبهمة. في هذا المثال، لوحة 5 × 10 5 خلايا في حجم مل 1 في كل بئر من لوحة 24 أيضا أسود. لوحة حجم مساو من المتوسطة في الآبار ثلاث نسخ لتكون بمثابة الشاهد السلبي. ملاحظة: عدد الخلايا مطلي في كل بئر هو مرن، ويمكن أن يكون الأمثل للتجارب الفردية. لكل خط الخلية إضاءة الحيوية، تجريبيا تحديد العلاقة بين عدد الخلايا وbiolumiخرج nescent، وكذلك الحد الأدنى من الخلية كشف حساب قبل أي اختبارات السمية. للقيام بذلك، وقياس تلألؤ بيولوجي عبر مجموعة واسعة من الأحجام السكانية (على سبيل المثال، 1 × 03 حتي 01 أكتوبر × 10 6 خلايا) في ظل ظروف التصوير موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع مجمع اختبار (ق) كما هو موضح أدناه. </li></ol> 2. التحضير الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المادة الكيميائية التي يجري اختبارها كحل المركزة للأسهم. في هذا المثال، استخدام 100 ملغ / مل من محلول المخزون مضاد حيوي من عائلة بليوميسين. ملاحظة: لتقليل الآثار السامة المحتملة المستندة إلى السيارة، خاصة إذا تم استخدام المذيبات العضوية كوسيلة لإضافة المواد الكيميائية، فمن المستحسن أن يكون تركيز الأسهم 1،000 مرات على الأقل تركيز بعد التطبيق المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأسهم الكيميائية المعدة مباشرة إلى الخلايا. في هذا المثال، جرعة المضاد الحيوي من الفائدة عند تركيزات النهائي من 100، 200، 300، و 400 ميكروغرام / مل في الثلاثيةيغضن الآبار. ترك ثلاثة آبار من الخلايا غير المعالجة والضوابط. ملاحظة: يجب أن يتم تحديد تركيز النهائي من المادة الكيميائية المستهدفة استنادا إلى أهداف محددة التجريبية. يتم اختبار مجموعة واسعة من التركيزات عادة للحصول على الطيف الكامل من الآثار السمية. </li></ol> 3. التصوير وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إضافة المواد الكيميائية، ووضع لوحة في غرفة التصوير من أداة مناسبة لاقتناء الصورة وقياس تلألؤ بيولوجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلألؤ بيولوجي قياس كل 15 دقيقة على مدى فترة 24 ساعة باستخدام 10 دقيقة وقت التكامل لكل قراءة. ملاحظة: في المرة التكامل المستخدمة في هذا المثال هو على أساس لكل لوحة ويمكن تعديلها لالقياس على أساس لكل جيدا باستخدام luminometers أخرى يختارها. ويمكن أيضا أن يتم ضبط الوقت التكامل على أساس خط الخلية إضاءة الحيوية الذي تم اختياره. لأن يتم إنتاج تلألؤ بيولوجي مستقل دون تدمير الخلايا أو أي مؤثر خارجي، وقراءةيمكن اتخاذها بالجلسات في أي نقطة الوقت المطلوب لتحقيق أهداف تجريبية محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة إضاءة الحيوية من كل بئر من خلال تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام برنامج متوافق. عرض الإخراج ضوء إما تدفق الإجمالي (الفوتونات / ثانية) أو متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سم 2 steridian /) من كل عينة. </li></ol>

<ol>
	<li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+really+FDA+approved?.">Is it really FDA approved?.</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li><li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+cell+culture+technology.">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+human+ADME/Tox+drug+properties+in+drug+discovery.">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties.">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li><li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii.">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li><li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer.">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence.">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li><li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+(lux)+in+a+mammalian+cell+line.">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441 (2010).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+toxicant+bioavailability+using+a+constitutively+bioluminescent+human+cell+line.">Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line.</a> , 1-4 (2011).</li><li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells.">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li><li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter.">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase,+firefly+luciferase,+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models.">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).</li></ol>

إغلاق DM، SA ريب، وGS سيلر هي مؤسسي ومالكي من 490 في مجال التكنولوجيا الحيوية، وشركة

يوضح هذه الطريقة على استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل كما في المختبر فحص السمية الخلوية التي تتيح فحص الخلايا الحية التي يتعين رصدها بشكل مستمر على مدى حياتهم. هذا البروتوكول هو مرن، ويمكن تعديلها لاستيعاب ظروف تجريبية محددة كما هو مطلوب. على سبي...

في الولايات المتحدة، والمستحضرات الصيدلانية وغيرها من المنتجات المعدة للاستهلاك البشري تتطلب تقييم واسعة النطاق قبل الموافقة عليها لاستخدام المستهلك من قبل إدارة الغذاء والدواء. يتم وضع العبء المالي لتنفيذ هذا الاختبار على مطور 1، مما يزيد بشكل كبير من تكلفة تطوير مجمع جديد، وبالتالي يترجم إلى زيادة تكلفة بالنسبة للمستهلكين. في حين أن الكثير تقليديا من هذا الفحص قد تستغل الموضوعات الحيوان ليكون بمثابة وكلاء للالمضيفين الإنسان، وقد ثبت أن هذا عبئا ماليا كبيرا، مع ما يقدر بنحو 2.8 مليار دولار تنفق سنويا على ADME / توكس (الامتزاز، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، وإفراز، وسمية ) فحص وحده 2 و أدلة متزايدة تشير إلى أن النماذج الحيوانية لا يمكن التنبؤ بشكل موثوق الردود السمية الإنسان 3. ولذلك، في المختبر الإنسان الاختبارات القائمة على ثقافة الخلية وقد اكتسب شعبية على مدى العقدين الماضيين لما له من أقل نسبياالتكلفة، وأعلى إنتاجية، وتمثيل أفضل من التوافر البيولوجي البشرية وعلم السموم 4. الأساليب الحالية الخلية المستندة إلى ثقافة الفحص السمية تستخدم نقاط النهاية مختلفة، مثل قياس مستويات ATP، وفحص نشاط الانزيمات حشوية المتاحة التطور الطبيعي، التي تحقق سلامة الغشاء الخلوي، أو تتبع مستوى النشاط الميتوكوندريا، لتقييم الجدوى الخلوية 5 ، 6. ومع ذلك، بغض النظر عن نقطة النهاية اختيار، وهذه الأساليب تتطلب كل الدمار من قبل عينة يمكن أن تؤخذ القياسات، وبالتالي إنتاج البيانات فقط عند نقطة زمنية واحدة. ونتيجة لذلك، فإن أعدادا كبيرة من العينات تحتاج إلى أن تكون مستعدة وتعامل بشكل متواز لدراسات السمية الحركية الأساسية، مضيفا مرة أخرى إلى التكلفة والعمالة المطلوبة لتطوير مجمع جديد. بدلا من ذلك، استخدام المقايسات يفرز وسيفيراز مثل Gaussia وسيفيراز 7، 8 Vargula وسيفيراز، وMetridia وسيفيراز 9وقد تم تطوير هذا يزيل الحاجة إلى تحلل الخلايا وتتطلب جزء من وسائل الإعلام لقياس نقطة النهاية، ولكن هذه لا تزال محدودة لأخذ العينات في نقاط زمنية محددة سلفا، وتتطلب أيضا إضافة الخارجية ركائز ضوء تفعيل. لتجنب يضر المطلوبة تدمير عينة وكذلك للقضاء على تكلفة ركائز، فقد تم تصميم خط الخلية البشرية التي تعبر عن تلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (لوكس) كاسيت الجين (luxCDABEfrp) للسماح للرصد المستمر للخلايا الحية مشابه إلى فلوري صبغ القائمة على التصوير الخلية الحية، ولكن من دون إجراءات إضافية التحقيق الفوتون تفعيل والمجهرية. هذا الخط خلية قادرة على انتاج جوهري إشارة ضوئية لاستمرار الكشف المباشر دون الحاجة إلى مؤثر خارجي، وبالتالي تجنب تدمير العينة. ميكانيكيا، في إشارة إضاءة الحيوية المتولدة من هذه الخلايا يؤديو عندما يحفز انزيم وسيفيراز luxAB-شكلت أكسدة من ألدهيد الدهنية طويلة السلسلة (توليفها ومجدد من المنتجات الجينات luxCDE استخدام ركائز داخلية المنشأ) في وجود انخفاض فيتامين بي الفوسفات (FMNH 2، التي يعاد تدويرها من FMN بواسطة الجينات فرب المنتج) والجزيئية الأكسجين 10. وبالتالي التعبير عن كاسيت لوكس في الخلية المضيفة تمكن الضوء ليتم إنتاجها والكشف دون تدمير الخلايا أو الخارجية بالإضافة الركيزة. وبالمثل، فإن التفاعل بين الجينات لوكس وFMN التطور الطبيعي المتاحة، وO 2 cosubstrates، وشرط لصيانة بيئة التي يمكن أن تدعم تحويل FMN إلى FMNH 2، ويضمن أن الإشارة إضاءة الحيوية الناتجة لا يمكن إلا أن يتم الكشف عن الكائنات ، خلايا نشطة عملية الأيض. سبق لها أن تستغل هذه المتطلبات لإثبات أن لوكس BASإد إضاءة الحيوية خرج يرتبط بقوة مع الخلوية حجم السكان 11 وأن التعرض مركب سام يضعف الإنتاج autobioluminescent بطريقة الاستجابة للجرعة 12. هنا نستخدم autobioluminescent الكلى الجنينية البشرية تتميز سابقا (HEK293) خط الخلية 11 للتدليل على فحص السمية الآلي من مضاد حيوي من عائلة بليوميسين مع الحمض النووي المعروف النشاط ضارا وذلك سبيل المثال ممثل للتحقق من صحة تطبيق خلايا الثدييات autobioluminescent لاختبار السمية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging 2.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Newer updates of this software is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662174</td>
			<td>96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), phenol red-free</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate, 100mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin, 100 mg/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin, 0.05%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity

وقد استخدمت الثدييات الخلية التي يوجد مقرها في فحوصات المختبر على نطاق واسع كبدائل للالتجارب على الحيوانات لدراسات السمية ولكن كانت محدودة بسبب التكاليف النقدية والزمنية عالية من إعداد العينات الموازية التي استلزم نظرا لطبيعة المدمرة لليراعة طرق الفحص القائم على وسيفيراز . هذا الفيديو يصف استخدام خلايا الثدييات إضاءة الحيوية بشكل مستقل، والتي لا تتطلب إضافة المدمرة للركيزة وسيفيرين، كطريقة غير مكلفة وسطحية لرصد آثار السامة للخلايا من مركب من الفائدة. خلايا الثدييات التعبير عن ثابت وتلألؤ بيولوجي البكتيرية كامل (luxCDABEfrp) كاسيت الجينات تنتج ذاتيا إشارة ضوئية أن قمم في 490 نانومتر دون إضافة ركيزة وسيفيرين مكلفة وربما التدخل، الإثارة من مصدر طاقة خارجي، أو تدمير العينة التي هي تقليديا أجريت أثناء إجراء التصوير الضوئيق. هذا الاستقلال من مؤثر خارجي يضع عبئا على الحفاظ على رد فعل إضاءة الحيوية فقط على الخلية، وهذا يعني أن الإشارة الناتجة هي فقط اكتشفت أثناء عملية الأيض نشطة. هذه الخاصية تجعل لوكس، معربا عن خط الخلية مرشح ممتاز لاستخدامها بوصفها biosentinel من الآثار السامة للخلايا وذلك لأن التغيرات في إنتاج إضاءة الحيوية التي تدل على آثار سلبية على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي. وبالمثل، فإن طبيعة الحكم الذاتي وعدم تدمير عينة تصاريح التصوير المتكرر لنفس العينة في الوقت الحقيقي طوال فترة التعرض السموم، ويمكن أن يؤديها عبر عينات متعددة باستخدام معدات التصوير القائمة بطريقة آلية.

في هذه الدراسة، تم رصد ديناميات HEK293 الخلايا autobioluminescent بشكل مستمر على مدى فترة 24 ساعة ردا على التعرض للمضادات الحيوية (الشكل 1). الآثار السامة من هذه المضادات الحيوية، والتي هي عضو في الأسرة بليوميسين المعروف لقتل الخلايا الحية عن طريق الربط بين والشق DNA 13،<...

Watch this Scientific Journal Video about Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity at JoVE.com

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات التعبير عن الجينات البكتيرية تلألؤ بيولوجي كاسيت (<em&gt; لوكس</em&gt;) إنتاج الضوء بشكل مستقل. وقد أظهرت ديناميات إضاءة الحيوية الناتجة عند التعرض للمواد الكيميائية لتعكس آثار العلاج على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي، مما يجعل هذه الخلايا على والمستمر، في الوقت الحقيقي أداة فحص السمية الرخيصة التي يمكن بسهولة أن تتكيف لأتمتة عالية الإنتاجية.

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

autonomously-bioluminescent-mammalian-cells-for-continuous-real-time

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Oak Ridge National Laboratory. خلايا الثدييات التعبير عن الجينات البكتيرية تلألؤ بيولوجي كاسيت ( لوكس) إنتاج الضوء بشكل مستقل. وقد أظهرت ديناميات إضاءة الحيوية الناتجة عند التعرض للمواد الكيميائية لتعكس آثار العلاج على النمو الخلوي والتمثيل الغذائي، مما يجعل هذه الخلايا على والمستم...

Video: Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...