Name: measurement of heme synthesis levels in mammalian cells
Uploaded: 2015-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

كانت خطوط الخلايا HCC4017 وHBEC30KT تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور جون مينا لل. وأيد هذا العمل من قبل أموال سيسيل H. وإيدا الأخضر للدكتور لى تشانغ.

تنبيه: بينما كان يعمل مع النشاط الإشعاعي، واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلوث من المجرب والمناطق المحيطة بها. التخلص من جميع النفايات التالية إرشادات السلامة من الإشعاع المحلية. 1. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور في 3.5 سم لوحات من هذا القبيل أن confluency يصل 80٪ -90٪ في يوم الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أن بذر confluency للخلايا يتوقف على نوع من الخلايا ومعدل نموها. عند علاج الخلايا مع كاشف لعدد معين من الأيام، البذور الخلايا بحيث confluency 80٪ -90٪ في اليوم القياس الهيم. إذا كان عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من 3.5 سم لوحات غير كاف، استخدم 6 سم لوحات مع نفس الكمية من ALA المشع كما في الخطوة التالية. ملاحظة: يوصى باستخدام لوحات فردية لأنه من الأسهل على التعامل مع لوحات فردية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل يوم من قياس الهيم، إضافة 0،1-0،3 μCi [14 C] 5-ALA وALA البارد للوصول إلى ج النهائيةoncentration من 20 ميكرومتر من إجمالي ALA إلى كل طبق الثقافة في نوبة منطقة العمل للعمل مع المواد المشعة ووضع لوحات العودة إلى الحاضنة. من الناحية المثالية، واحتضان مع ALA الإشعاعي لمدة 16 ساعة. ملاحظة: رديولبلد 5-ALA المطلوبة قد تختلف بين خطوط الخلايا. مطلوب العد الإشعاعي في الدقيقة (CPM) لا يقل عن 100 لتقليل الخطأ المرتبط العد. فإنه من المستحسن أن تحديد الحد الأدنى لل[14 C] 5-ALA اللازمة لخطوط الخلايا تحت الدراسة. بالنسبة لمعظم التجارب 0،1-0،3 μCi يكفي للحصول على قياس جيد. إضافة ALA البارد اختيارية. </li></ol> 2. استخراج هيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد ونقلهم الى تناسب المنطقة للعمل الإشعاعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء استخراج كامل وعملية التبخر في غطاء محرك السيارة واقية من الانفجار. لأن الأثير المخزنة يمكن أن تنفجر، واستخدام الأثير في زجاجات صغيرة وتتبخر أي سوائل المتبقية، لا تقم بتخزين الأثير فيزجاجة مفتوحة لأكثر من شهر واحد. لا تستخدم الأسيتون بالقرب من اللهب المكشوف وسخانات كما هو شديدة الاشتعال. متجر الأسيتون التي تحتوي على المواد الكيميائية في عبوات زجاجية كما يذوب البلاستيك زراعة الأنسجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة المتوسطة باستخدام ماصة. غسل خلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1X. نضح قبالة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1x إلى لوحات وجمع الخلايا في الجزء السفلي من لوحة باستخدام شرطي المطاط. نقل الخلايا التي تم جمعها من كل لوحة لوصفت قبل المبردة 2 مل أنبوب. جمع كل الخلايا في 2 مل أنابيب. ملاحظة: استخدم شرطي المطاط جديدة لكل لوحة لكشط الخلايا من كل لوحة. لكل لوحة هل تحتاج إلى أربع 2 مل أنابيب، أنبوب 1.5 مل وقارورة التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج PBS باستخدام ماصة، وإعطاء تدور القصير وإزالة PBS المتبقية. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. دوامة ل resuspend الخلايا والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 &amp;# 956؛ ل من الخطوة 5 ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها على الجليد لقياس تركيز البروتين. ملاحظة: يجب إضافة خلية العازلة تحلل للخلايا وأبقى على الجليد لقياس تركيز البروتين في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور 90 ميكرولتر المتبقية من الخطوة 5 في 5000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 ° C؛ إزالة PBS تماما باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من استخراج العازلة الهيم (انظر قائمة المواد) إلى كل أنبوب. ثم دوامة لمدة 15 ثانية لخلط وضعت على الجليد لمدة 1 دقيقة، كرر هذا 3 مرات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العازلة استخراج الهيم (عب) ودوامة الأنبوب بسرعة إلى resuspend الكرية، هل أنابيب واحد فقط أو اثنين في وقت واحد لأن بيليه يجب معلق بسرعة دون أن تترك في HEB لفترة طويلة جدا. مرة واحدة يضاف HEB لجميع الأنابيب ومعلق بيليه ثم اتبع دوامة 15 ثانية و 1 دقيقة على دورة الجليد كما في الخطوة 8. ملاحظة أن بيليه قد لا تذهب تماما في HEB إذا تم ترك بيليه في المخزن المؤقت HEB ل يعدالوقت وليس معلق بسرعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.2 مل من ايثر إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 30 ثانية. تدور في 15000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: اثيل الأثير نفدت نصائح ماصة بسرعة. للسيطرة على هذا، ماصة إثيل الأثير صعودا وهبوطا مرة واحدة أو مرتين، وبذلك يساعد على عقد ايثر في ماصة. كرر هذه كل الوقت الذي يستخدم فيه طرف ماصة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العلوي (الأثير) المرحلة مع 1 مل ماصة لأنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 0.5 مل من 2 N حمض الهيدروكلوريك، ودوامة لخلط وتدور كما في الخطوة 9. ملاحظة: من الصعب أن نرى الفصل بين المراحل الأثير وحمض الهيدروكلوريك. لذلك، إضافة كميات صغيرة من التريبان الأزرق في 2 حل N حمض الهيدروكلوريك لاستخدامها أثناء التجربة، وهو ما يكفي لإعطائها اللون الأزرق الفاتح. وهذا سوف يساعد التمييز بين المرحلتين. ستكون المرحلة الدنيا الأزرق وستكون المرحلة الأثير العليا عديم اللون. نقل المرحلة الأثير عديم اللون العليا لأنبوب جديد والتخلص من حمض الهيدروكلوريك (الأزرق) المرحلة الدنيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 10 اثنينأكثر من مرة لغسل المرحلة الأثير مع 2 N حمض الهيدروكلوريك. نقل سوى المرحلة الأثير قصوى لأنبوب جديد خلال كل تكرار وتجاهل مرحلة حمض الهيدروكلوريك أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثالث مع حمض الهيدروكلوريك، ونقل المرحلة العليا مع 1 مل ماصة إلى قارورة التلألؤ. تجفيف العينات عن طريق تبخير ايثر عن طريق الحفاظ على العينات في غطاء الكيميائية O / N. </li></ol> 3. قياس النشاط الإشعاعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي اليوم التالي، إضافة 5 مل من السائل التلألؤ للعينات مجففة من الخطوة 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز جيدا لخلط. قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ. </li></ol> 4. الحسابات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا من الخطوة 2.6 باستخدام كميات متساوية من CelLytic M عازلة (انظر المواد القائمة) وتدور في 14000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من طاف وقياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة البروتين مقايسة. المبلغ الإجمالي للبروتين في ملغم (TP) = (90 ميكرولتر * اضرب. البروتين في81؛ ز / ميكرولتر) / 1000 الهيم مستوى التوليف (النشاط الإشعاعي / TP) = بمول / ملغ من البروتين. </li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الهيم يلعب دورا رئيسيا في توليد الطاقة الخلوية عن طريق التنفس 26. ومن المعروف غيرت الأيض الهيم أن تترافق مع أمراض مختلفة بما في ذلك السرطان 28،41. ومن المعروف تثبيط تخليق الهيم أن تسبب اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج في خلايا هيلا 26،41. وقد تبين أن الهيم ارتفاع مستوى التوليف ويرتبط مع تطور خلايا سرطان الرئة 28. ولذلك، فإنه سيكون من أهمية كبرى لقياس مستويات الهيم الحيوي في الخلايا تحت ظروف مختلفة. طريقة مناقشتها هنا لا تحديد المبلغ الإجمالي للالهيم وبالتالي، فإنه لا يوفر القيمة المطلقة للالهيم موجودة في الخلايا. وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب اللونية ومجموعات المتاحة لقياس مجموع مبالغ الهيم في الخلايا. على سبيل المثال، الهيم يمكن استخراجها من الخلايا والميتوكوندريا في خليط من الأسيتون وحمض الهيدروكلوريك ومختلطة مع 50٪ (ت / ت) الأسيتونتريل. ثم الخليط يمكن تطبيقهاإلى 3.9 × 300 مم C18 Bondclone العمود تليها شطف من الهيم في التدرج من الأسيتونيتريل تحتوي على 0،05٪ (V / V) حمض trifluoroacetic وتحديد المركبات الهيم في 400 نانومتر 44،45. سابقا، لقياس مستويات الهيم الحيوي في أنسجة الثدييات ومقتطفات خلية [14 C] -glycine واستخدمت [14 C] 5- ALA 46،47. على الرغم من الجلايسين وصفت يدخل الحيوي مسار الهيم في الخطوة الأولى ولكن يتم تصريف تشغيله بواسطة المسارات الأيضية الأخرى مما أدى إلى إدماج محدود لها في الهيم. الجلايسين ليس الأيض محدد لمسار الهيم الحيوي 48. من ناحية أخرى، وصفت 5-ALA غير محدد لمسار الهيم الحيوي. هذه الميزة تمنح ميزة الكمية للاستخدام 5-ALA على الجلايسين 46،48،49. لذلك، استخدام مشع 5-ALA هي طريقة أكثر تحديدا ودقة لقياس ومقارنة مستويات الهيم الحيوي. معظم جخطوات ritical للحصول على نتائج متسقة فيما يلي: 1) تأكد من أن الخلية confluency لا تذهب أعلى من 100٪ وليس أقل من 70٪ في مختلف الظروف. 2) يجب أن يكون مقدار النشاط الإشعاعي وأضاف في لوحة متطابقة لأن هذا الأسلوب هو حساس جدا. 3) لا ينبغي أن يكون استخراج العازلة الهيم القديم، فمن المستحسن أن تجعل جديدة في كل مرة. حجم النشاط الإشعاعي المطلوبة لكل لوحة صغيرة جدا وأنه من الصعب للحفاظ على كميات مماثلة عبر العينات. ولذلك، فمن المستحسن لجعل حل الأسهم العاملة في مستنبت، إذا باستخدام نفس المتوسطة لجميع العينات، آخر PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) يمكن استخدامها. العمل المحلول يمكن أن تكون على استعداد في مثل هذه الطريقة أن حجم الاستغناء في لوحة تحت 10 ميكرولتر. أيضا، لتكون أكثر دقة، والمتوسطة من عينات تكرار لحالة واحدة يمكن أن يؤخذ بها في أنبوب 50 مل والكميات المناسبة من النشاط الإشعاعي يمكن أن يضاف من المحلول العمل، ثم الاستغناء الظهر ه<html> كميات التأهيلية من متوسطة إلى لوحات. وإذا كان عدد من الخلايا محدودة، كما هو الحال في الثقافات الأولية، 12-جيدا أو 24-جيدا لوحات يمكن استخدامها لثقافة الخلايا وتقلل من كمية النشاط الإشعاعي المضافة لكل جيدا نسبيا. هذا البروتوكول هو واضحة وبسيطة، ويوفر مقاييس دقيقة لمستويات التوليف الهيم. في بعض الأحيان، قد يكون من الصعب resuspend الكرية خلية في استخراج العازلة الهيم (الخطوة 2.8) تماما. لتجنب هذا تكون سريعة في الخطوة 2.8، إضافة الهيم استخراج العازلة إلى 1-2 العينات في وقت واحد، دوامة ووضعها على الجليد. تأكد من استخراج العازلة الهيم ليست قديمة جدا. إذا كان الانحراف المعياري بين العينات تكرار مرتفع جدا، والانتباه إلى الخطوات التالية: 1) تمت إزالة PBS تماما في الخطوة 2.7. 2) تجنب إراقة عينة عندما تكون في مرحلة إثيل الأثير، اتبع طرف في الخطوة 2.9. 3) تأكد من إضافة النشاط الإشعاعي في لوحة وكانت confluency من العينات تكرار نفسه. ق ق = &quot;jove_content&quot;&gt; عن طريق المشع طريقة 5-ALA، وتمت مقارنة مستويات التوليف الهيم كما هو موضح سابقا 28 في العادي nonmalignant (HBEC) مقابل سرطان (HCC) الخلايا، وضعت من نفس المريض. تقنية الموضحة هنا يتطلب استخدام [14 C] 5-ALA، تمهيدا في طريق الهيم الحيوي (الشكل 1)، ويقيس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. في هذه التقنية، البروفيرين، بما في ذلك الهيم، استخرجت من الخلايا في خليط من الأسيتون، حمض الهيدروكلوريك المركز و50،51 المياه. تم فصل الهيم مزيد من البروفيرين عن طريق استخراج في ايثر وغسل المرحلة الأثير مع 2 N حمض الهيدروكلوريك 50،51. ثم، تم تحديد النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم باستخدام عداد التلألؤ. النتائج يمكن تطبيع من قبل المبلغ الإجمالي للبروتين أو عدد الخلايا. كانت تحول دون تركيب الهيم في خلايا هيلا باستخدام الأسيتون succinyl (SA) وانخفاض في مستوى تركيب الهيم لوحظ كما هو موضح مسبقاviously 26 (الشكل 3). هذه الطريقة مفيدة جدا لمقارنة مستويات التوليف الهيم في ظل ظروف مختلفة أو بين خطوط الخلايا (الشكل 4). فإنه يتطلب عددا قليلا من الخلايا ويوفر القياس والمقارنة بين مستويات التوليف الهيم في خلايا مختلفة معين. وليس المقصود بها لقياس دقيق لمستويات الهيم المطلقة في الخلايا. يتم استخدام أفضل ما لمقارنة مستويات التوليف الهيم في الخلايا مع خصائص مختلفة، مثل الخلايا السرطانية المختلفة. لأن الكوبالت، بدلا من الحديد، يمكن إدراجها في الهيم في الخطوة الأخيرة من تركيب الهيم وسيتم استخراج 51، وهذه الطريقة قد لا تسفر مقارنة دقيقة من التوليف الهيم، وإذا كانت وسائل الإعلام نمو تحتوي على مستويات مختلفة من الكوبالت أو الأيونات المعدنية الأخرى. ومع ذلك، فإن مسار الهيم الاصطناعية من حمض 5-أمينوليفولنيك إلى البروفيرين والهيم محددة جدا، وقياس مستويات التدفق من ع كلهومن المرجح أن يكون أكثر تعبيرا عن الأنشطة الأيضية ذات الصلة الهيم، بغض النظر عن ايونات المعادن athway. في المقابل، فإن طريقة استخدام الحديد بالكشف عن 59 فقط من جانب الطريق دمج الحديد لتشكيل الهيم 52. على الرغم من أن هذا هو أكثر تحديدا، في وجود مستويات عالية من الأيونات المعدنية، قد لا يعكس مستويات التوليف الهيم الكشف عن إمكانات التمثيل الغذائي للخلايا معينة مثل الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، الحديد يمكن عزلها في أماكن الخلوية الأخرى بجانب الميتوكوندريا لجعل الهيم. وعلى وجه العموم، ونحن نعتقد أن استخدام [4- 14 C] 5-ALA هي طريقة أكثر عملية لقياس مستويات الهيم عند المقارنة بين خلايا مختلفة مع خصائص مختلفة.

الهيم، وهو مجمع الحديد الحديدية وبروتوبرفيرين IX هو جزيء المركزي لنقل واستخدام الأوكسجين في الكائنات الحية تقريبا كل 1-3. هيكل فريد من الهيم تمكنه من العمل باعتبارها الناقل من الغازات ثنائية الذرة والالكترونات، وكذلك لأداء مختلف الوظائف الأخرى 1-5. على سبيل المثال، الهيم بربط الأوكسجين في الهيموجلوبين والميوجلوبين لنقل وتخزين 6،7 الأوكسجين. كما أنها تعمل حاملة الإلكترون في cytochromes خلال التنفس وتعمل كجهة مانحة الإلكترون لتفاعلات الأكسدة والاختزال التي حفزتها الانزيمات السيتوكروم P450 8،9. واحدة من السمات الأكثر أهمية من الهيم غير ذلك، فإنه يمكن أن تلعب الأدوار التنظيمية في العمليات الخلوية والجزيئية مثل النسخ الجيني، تخليق البروتين والصغرى RNA نشوء حيوي 4. على سبيل المثال، فإنه يؤثر على نسخ من العديد من الجينات من خلال مراقبة نشاط من الثدييات النسخي كاظمة Bach1 وتفصيل النووي الثديياتeptor القس-erbα 10-15. الهيم ينظم تفعيل بروتين الهيم المنشط (هاب) (1) الذي يلعب دورا هاما في تفعيل الجينات المسؤولة عن التنفس والسيطرة على الضرر التأكسدي، ردا على الهيم أو الأكسجين 16. ينظم الهيم أيضا النسخ الجيني في الخلايا العصبية عن طريق عامل نمو الأعصاب (NGF) يشير 3،17-20. كما ينظم تخليق البروتين في الخلايا محمر الثدييات عن طريق تحوير نشاط التنظيم الهيم eIF2α كيناز (HRI) 21-24. وعلاوة على ذلك، يؤثر الهيم نشاط البروتينات الأساسية يشير مثل التيروزين كيناز JAK2 والهلال الأحمر السوداني، والتي تعتبر ضرورية لعمل الخلية سليم و4،20،25 نمو الخلايا. فقد وجد أن في هيلا خلايا الهيم تثبيط يسبب اعتقال دورة الخلية وتفعيل علامات الشيخوخة المرتبطة وموت الخلايا المبرمج 26. وترتبط كل من هيم نقص أو زيادة مستويات الهيم مع آثار صحية خطيرة في البشر 27. والجزيئي الزوارالثانية وقد أظهرت الدراسات الوبائية وجود علاقة إيجابية من السعرات الهيم عالية وزيادة خطر الأمراض، مثل مرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والشرايين والسرطانات عدة بما في ذلك سرطان الرئة وسرطان القولون والمستقيم وسرطان البنكرياس 27،28. باستخدام زوج متطابق من مختبر خلايا الرئة العادية وسرطان المؤلفين وجدت أن الخلايا السرطانية قد زادت من مستويات استهلاك الأوكسجين، والتوليف الهيم والبروتينات المشاركة في امتصاص الهيم والأكسجين استخدام 28. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط تخليق الهيم انخفض استهلاك الأكسجين، والانتشار، وتشكيل الهجرة ومستعمرة من الخلايا السرطانية 28. وبالتالي، فإن التقلبات في مستويات الهيم الذاتية يلعب دورا هاما في تنظيم العمليات الجزيئية والخلوية 3،4،28،29. في الثدييات، والتخليق الحيوي للالهيم يحدث في ثماني خطوات، تشمل الإنزيمات الموجودة في الميتوكوندريا والعصارة الخلوية 4 (الشكل 1). الهيم biosynأطروحة تبدأ في المصفوفة الميتوكوندريا مع التكثيف من الجلايسين وsuccinyl، لجنة الزراعة لتكوين حمض 5-أمينوليفولنيك (5-ALA)، يحفزه ALA سينسيز (ALAS) 4،31. هذا هو معدل الحد خطوة في التخليق الحيوي الهيم في الخلايا nonerythroid. 5-ALA ومن ثم تصديرها إلى العصارة الخلوية التي تحدث فيها الخطوات الأربع المقبلة لتشكيل مولد الكوبروبرفيرين III (CPgenIII)، وهو ما يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا، حيث يتم تحويلها إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX). وأخيرا، يتم تضمينها جزيء واحد من الحديد إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX) لإنتاج الهيم، وهو رد فعل يحفزه فيروكيلاتاز (FECH) 2،4. مستوى الهيم الحيوي يعتمد بالدرجة الأولى على مستوى ALAS الانزيم الذي يسيطر بإحكام من قبل الحديد داخل الخلايا والهيم (4). الحيوي من الهيم يمكن أن تتأثر عيوب وراثية، وتوافر بعض المعادن والفيتامينات (على سبيل المثال، الريبوفلافين والزنك)، والتعرض للسموم (مثل الألومنيوم والرصاص)، نقص الأكسجين، والحمى، ومستويات بعض المنشطات (على سبيل المثال، الاستروجين) 32-35. يتم تبديل مستوى تخليق الهيم في مختلف الحالات المرضية. انخفضت الحيوي الهيم يمكن أن يسبب فقر الدم وكذلك الأمراض العصبية 3،36. بدلا من ذلك، زيادة الحيوي الهيم يلعب دورا هاما في تطور بعض أنواع السرطان 28،37. وقد تبين الهيم أن تكون حاسمة لنمو والتميز وبقاء الدهنية الثدييات، محمر والخلايا العصبية 4،38-41. على سبيل المثال، نقص الهيم يؤدي إلى تلف محوار في الماوس الأساسي العصبونات القشرية عن طريق تثبيط الغلوتامات NMDA (N -methyl-D اسبارتاتي) مستقبلات 17. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط تخليق الهيم يسبب موت الخلايا المبرمج في الإنسان الظهارية عنق الرحم سرطان خلايا هيلا 26،41. لذلك، وقياس مستويات الهيم الحيوي في خلايا مختلفة في ظل ظروف مختلفة المهم لدراسة المسببات وprogressiعلى العديد من الأمراض. نحن هنا تصف طريقة سريعة وحساسة لقياس مستوى تخليق الهيم الخلايا باستخدام [4- 14 C] حمض 5-aminolevulic. هذا هو أسلوب بديل لأساليب أخرى باستخدام 55 أو الحديد 59 الحديد. نحن نفضل استخدام 14 C لإشعاعه ضعيف جدا. في المقابل، لا بد من حماية قوية للعمل مع نظائر الحديد. وعلاوة على ذلك، المقصود هذه الطريقة لقياس ومقارنة التوليف الهيم في خلايا مختلفة في موازاة ذلك بطريقة سريعة. من أجل قياس مستويات الهيم مطلقة، يمكن للمرء استخدام أسلوب المحددة سابقا التي تنطوي على استخدام HPLC 42،43.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Diethy ether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Hydrochloric acid)</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Scintillation cocktail&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>882470</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled 4-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C aminolevulinic acid</td><td>Perkin-Elmer life sciences</td><td></td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CelLytic M</td><td>Sigma</td><td>C2978</td><td>Mammalian cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specific reagent&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Dispense&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Heme extraction buffer:&lt;br /&gt;Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)</td><td>Acetone&lt;br /&gt; Concentrated HCl&lt;br /&gt;Water</td><td>25 ml&lt;br /&gt;1.3 ml&lt;br /&gt;5 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

يخدم الهيم كمجموعة التعويضية لمجموعة واسعة من البروتينات المعروفة باسم hemoproteins، مثل الهيموغلوبين، والميوجلوبين cytochromes. وتشارك في مختلف العمليات الجزيئية والخلوية مثل النسخ الجيني والترجمة وتمايز الخلايا وتكاثر الخلايا. مستويات الحيوي من الهيم تختلف باختلاف الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا وغيرت في الحالات المرضية مثل فقر الدم واعتلال الأعصاب والسرطان. هذه التقنية تستخدم [4- 14 C] حمض 5-أمينوليفولنيك ([14 C] 5-ALA)، واحدة من السلائف في وقت مبكر من مسار الهيم الحيوي لقياس مستويات التوليف الهيم في خلايا الثدييات. هذا الاختبار يشمل حضانة الخلايا مع [14 C] 5-ALA تليها استخراج الهيم وقياس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. هذا الإجراء دقيق وسريع. يقيس هذا الأسلوب المستويات النسبية للالهيم الحيوي بدلا من المحتوى الكلي الهيم. للتدليل على استخدام هذا ميتاليكIQUE مستويات الهيم الحيوي قيست في العديد من خطوط الخلايا الثديية.

وقد استخدم هذا الأسلوب لمقارنة مستويات التوليف الهيم في الحالات العادية (HBEC30KT) مقابل السرطان (HCC4017) خلايا الرئة الشكل 2 يوضح مستوى أعلى من التوليف الهيم في الخلايا السرطانية (HCC4017) من خلايا الرئة العادية (HBEC30KT). وقد تم قياس مستوى تخليق الهيم أيضا في الخلايا الطبيعية والسرطانية في وجود الميتوكوندريا uncoupler الكربونيل السيانيد 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). تم علاج الخلايا مع 10 ميكرومتر CCCP لمدة 24 ساعة قبل قياس مستويات التوليف الهيم. كما هو متوقع، انخفضت مستويات التوليف الهيم (الشكل 2) في وجود CCCP في كل من الخلايا الطبيعية والسرطانية. وقد تبين أنه سبق أن تركيب الهيم يمكن تمنعها succinyl الأسيتون (SA)، المانع من امكانات ومحددة من 5 أمينوليفولنيك نازعة الماء حمض (الاد) وهو الانزيم الثاني في الهيم التخليق الحيوى المسار 41. باستخدام هذه الطريقة، تم قياس مستويات التوليف الهيم في خلايا هيلا في وجود وتقاسم المنافعسينعقد من 0.5 ملي SA. الشكل (3) يبين أن مستويات التوليف الهيم انخفضت بأكثر من 10 أضعاف في وجود SA. لمزيد من شرح استخدام هذه التقنية، تم قياس مستويات التوليف الهيم ومقارنة في 4 السرطان وخطوط الخلايا HEK293T كما هو مبين في الشكل (4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig1.jpg" /> الشكل 1. الحيوي مسار الهيم في البشر للأسف، 5-أمينوليفولنيك سينسيز حامض؛ 5-ALA، حمض 5-أمينوليفولنيك. الاد، نازعة الماء ALA. PBG، برفوبيلينوجين. HMBS، سينسيز hydroxymethylbilane. HMB، hydroxymethylbilane. أوروس، يوروفيرينوجين III سينسيز؛ UPgenIII، يوروفيرينوجين الثالث؛ UROD، يوروفيرينوجين كربوكسيل؛ CPgenIII، مولد الكوبروبرفيرين الثالث؛ CPOX، مولد الكوبروبرفيرين III أوكسيديز. PPgenIX، protoporphyrinogen التاسع؛ PPOX، protoporphyrinogen التاسع أوكسيديز. PPIX، بروتوبرفيرين التاسع؛ FECH، فيروكيلاتاز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51579/51579fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig2.jpg" /> الشكل 2. مستويات الهيم الحيوي في الحالات العادية (HBEC30KT) والسرطان (HCC4017) خلية خطوط، في غياب وجود 10 ميكرومتر الميتوكوندريا uncoupler CCCP. وكان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها) وذلك كان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51579/51579fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig3.jpg" /> الشكل 3. مستويات الهيم الحيوي في خلايا هيلا في القيمة المطلقةسينعقد وجود 0.5 ملم من التوليف الهيم المانع succinyl الأسيتون (SA). تم علاج الخلايا مع SA لمدة 3 أيام قبل قياس الهيم. كان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها)، وكان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51579/51579fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/51579/51579fig4.jpg" /> . تم تنفيذ الشكل 4. مقارنة بين مستويات الهيم الحيوي في 4 السرطان وHEK293T خطوط الخلايا الفحص وفقا للبروتوكول. كانت تزرع HCC4017 في ACL4 وسائل الإعلام، A549 وH1395 في RPMI1640 تستكمل مع 5٪ FBS، HEK293T وهيلا في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. للتحليل الإحصائي، وتمت مقارنة مستويات التوليف الهيم في الخلايا السرطانية والخلايا HEK293T إلى مستوى تخليق الهيم في HCC4017 الخلايا، باستخدام ولش 2-عينة اختبار t. **، ص قيمة &lt;0.005. كان مستوى الخلفية مماثل لمستوى عينة فارغة (السائل التلألؤ وحدها)، وكان أقل من 2٪ من عنصر التحكم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51579/51579fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

التوليف والأداء التحفيزي من الذهب مقحم في جدران Mesoporous السيليكا

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Chemistry

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Immunology and Infection

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

إنتاج مصل خالي من الهيباتوسفيرات البشرية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القوى

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Developmental Biology

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Bioengineering

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Medicine

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

قياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة باستخدام فحص كولوريمتري قائم على الباثوفينانثرولين

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...