كانت خطوط الخلايا HCC4017 وHBEC30KT تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور جون مينا لل. وأيد هذا العمل من قبل أموال سيسيل H. وإيدا الأخضر للدكتور لى تشانغ.

تنبيه: بينما كان يعمل مع النشاط الإشعاعي، واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلوث من المجرب والمناطق المحيطة بها. التخلص من جميع النفايات التالية إرشادات السلامة من الإشعاع المحلية. 1. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور في 3.5 سم لوحات من هذا القبيل أن confluency يصل 80٪ -90٪ في يوم الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أن بذر confluency للخلايا يتوقف على نوع من الخلايا ومعدل نموها. عند علاج الخلايا مع كاشف لعدد معين من الأيام، البذور الخلايا بحيث confluency 80٪ -90٪ في اليوم القياس الهيم. إذا كان عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من 3.5 سم لوحات غير كاف، استخدم 6 سم لوحات مع نفس الكمية من ALA المشع كما في الخطوة التالية. ملاحظة: يوصى باستخدام لوحات فردية لأنه من الأسهل على التعامل مع لوحات فردية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل يوم من قياس الهيم، إضافة 0،1-0،3 μCi [14 C] 5-ALA وALA البارد للوصول إلى ج النهائيةoncentration من 20 ميكرومتر من إجمالي ALA إلى كل طبق الثقافة في نوبة منطقة العمل للعمل مع المواد المشعة ووضع لوحات العودة إلى الحاضنة. من الناحية المثالية، واحتضان مع ALA الإشعاعي لمدة 16 ساعة. ملاحظة: رديولبلد 5-ALA المطلوبة قد تختلف بين خطوط الخلايا. مطلوب العد الإشعاعي في الدقيقة (CPM) لا يقل عن 100 لتقليل الخطأ المرتبط العد. فإنه من المستحسن أن تحديد الحد الأدنى لل[14 C] 5-ALA اللازمة لخطوط الخلايا تحت الدراسة. بالنسبة لمعظم التجارب 0،1-0،3 μCi يكفي للحصول على قياس جيد. إضافة ALA البارد اختيارية. </li></ol> 2. استخراج هيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد ونقلهم الى تناسب المنطقة للعمل الإشعاعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء استخراج كامل وعملية التبخر في غطاء محرك السيارة واقية من الانفجار. لأن الأثير المخزنة يمكن أن تنفجر، واستخدام الأثير في زجاجات صغيرة وتتبخر أي سوائل المتبقية، لا تقم بتخزين الأثير فيزجاجة مفتوحة لأكثر من شهر واحد. لا تستخدم الأسيتون بالقرب من اللهب المكشوف وسخانات كما هو شديدة الاشتعال. متجر الأسيتون التي تحتوي على المواد الكيميائية في عبوات زجاجية كما يذوب البلاستيك زراعة الأنسجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة المتوسطة باستخدام ماصة. غسل خلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1X. نضح قبالة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 1x إلى لوحات وجمع الخلايا في الجزء السفلي من لوحة باستخدام شرطي المطاط. نقل الخلايا التي تم جمعها من كل لوحة لوصفت قبل المبردة 2 مل أنبوب. جمع كل الخلايا في 2 مل أنابيب. ملاحظة: استخدم شرطي المطاط جديدة لكل لوحة لكشط الخلايا من كل لوحة. لكل لوحة هل تحتاج إلى أربع 2 مل أنابيب، أنبوب 1.5 مل وقارورة التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج PBS باستخدام ماصة، وإعطاء تدور القصير وإزالة PBS المتبقية. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. دوامة ل resuspend الخلايا والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 &amp;# 956؛ ل من الخطوة 5 ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها على الجليد لقياس تركيز البروتين. ملاحظة: يجب إضافة خلية العازلة تحلل للخلايا وأبقى على الجليد لقياس تركيز البروتين في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور 90 ميكرولتر المتبقية من الخطوة 5 في 5000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 ° C؛ إزالة PBS تماما باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من استخراج العازلة الهيم (انظر قائمة المواد) إلى كل أنبوب. ثم دوامة لمدة 15 ثانية لخلط وضعت على الجليد لمدة 1 دقيقة، كرر هذا 3 مرات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العازلة استخراج الهيم (عب) ودوامة الأنبوب بسرعة إلى resuspend الكرية، هل أنابيب واحد فقط أو اثنين في وقت واحد لأن بيليه يجب معلق بسرعة دون أن تترك في HEB لفترة طويلة جدا. مرة واحدة يضاف HEB لجميع الأنابيب ومعلق بيليه ثم اتبع دوامة 15 ثانية و 1 دقيقة على دورة الجليد كما في الخطوة 8. ملاحظة أن بيليه قد لا تذهب تماما في HEB إذا تم ترك بيليه في المخزن المؤقت HEB ل يعدالوقت وليس معلق بسرعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.2 مل من ايثر إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 30 ثانية. تدور في 15000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: اثيل الأثير نفدت نصائح ماصة بسرعة. للسيطرة على هذا، ماصة إثيل الأثير صعودا وهبوطا مرة واحدة أو مرتين، وبذلك يساعد على عقد ايثر في ماصة. كرر هذه كل الوقت الذي يستخدم فيه طرف ماصة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العلوي (الأثير) المرحلة مع 1 مل ماصة لأنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 0.5 مل من 2 N حمض الهيدروكلوريك، ودوامة لخلط وتدور كما في الخطوة 9. ملاحظة: من الصعب أن نرى الفصل بين المراحل الأثير وحمض الهيدروكلوريك. لذلك، إضافة كميات صغيرة من التريبان الأزرق في 2 حل N حمض الهيدروكلوريك لاستخدامها أثناء التجربة، وهو ما يكفي لإعطائها اللون الأزرق الفاتح. وهذا سوف يساعد التمييز بين المرحلتين. ستكون المرحلة الدنيا الأزرق وستكون المرحلة الأثير العليا عديم اللون. نقل المرحلة الأثير عديم اللون العليا لأنبوب جديد والتخلص من حمض الهيدروكلوريك (الأزرق) المرحلة الدنيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 10 اثنينأكثر من مرة لغسل المرحلة الأثير مع 2 N حمض الهيدروكلوريك. نقل سوى المرحلة الأثير قصوى لأنبوب جديد خلال كل تكرار وتجاهل مرحلة حمض الهيدروكلوريك أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثالث مع حمض الهيدروكلوريك، ونقل المرحلة العليا مع 1 مل ماصة إلى قارورة التلألؤ. تجفيف العينات عن طريق تبخير ايثر عن طريق الحفاظ على العينات في غطاء الكيميائية O / N. </li></ol> 3. قياس النشاط الإشعاعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي اليوم التالي، إضافة 5 مل من السائل التلألؤ للعينات مجففة من الخطوة 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز جيدا لخلط. قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ. </li></ol> 4. الحسابات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا من الخطوة 2.6 باستخدام كميات متساوية من CelLytic M عازلة (انظر المواد القائمة) وتدور في 14000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من طاف وقياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة البروتين مقايسة. المبلغ الإجمالي للبروتين في ملغم (TP) = (90 ميكرولتر * اضرب. البروتين في81؛ ز / ميكرولتر) / 1000 الهيم مستوى التوليف (النشاط الإشعاعي / TP) = بمول / ملغ من البروتين. </li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الهيم يلعب دورا رئيسيا في توليد الطاقة الخلوية عن طريق التنفس 26. ومن المعروف غيرت الأيض الهيم أن تترافق مع أمراض مختلفة بما في ذلك السرطان 28،41. ومن المعروف تثبيط تخليق الهيم أن تسبب اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج في خلايا هيلا 26،41. وقد تبين ?...

الهيم، وهو مجمع الحديد الحديدية وبروتوبرفيرين IX هو جزيء المركزي لنقل واستخدام الأوكسجين في الكائنات الحية تقريبا كل 1-3. هيكل فريد من الهيم تمكنه من العمل باعتبارها الناقل من الغازات ثنائية الذرة والالكترونات، وكذلك لأداء مختلف الوظائف الأخرى 1-5. على سبيل المثال، الهيم بربط الأوكسجين في الهيموجلوبين والميوجلوبين لنقل وتخزين 6،7 الأوكسجين. كما أنها تعمل حاملة الإلكترون في cytochromes خلال التنفس وتعمل كجهة مانحة الإلكترون لتفاعلات الأكسدة والاختزال التي حفزتها الانزيمات السيتوكروم P450 8،9. واحدة من السمات الأكثر أهمية من الهيم غير ذلك، فإنه يمكن أن تلعب الأدوار التنظيمية في العمليات الخلوية والجزيئية مثل النسخ الجيني، تخليق البروتين والصغرى RNA نشوء حيوي 4. على سبيل المثال، فإنه يؤثر على نسخ من العديد من الجينات من خلال مراقبة نشاط من الثدييات النسخي كاظمة Bach1 وتفصيل النووي الثديياتeptor القس-erbα 10-15. الهيم ينظم تفعيل بروتين الهيم المنشط (هاب) (1) الذي يلعب دورا هاما في تفعيل الجينات المسؤولة عن التنفس والسيطرة على الضرر التأكسدي، ردا على الهيم أو الأكسجين 16. ينظم الهيم أيضا النسخ الجيني في الخلايا العصبية عن طريق عامل نمو الأعصاب (NGF) يشير 3،17-20. كما ينظم تخليق البروتين في الخلايا محمر الثدييات عن طريق تحوير نشاط التنظيم الهيم eIF2α كيناز (HRI) 21-24. وعلاوة على ذلك، يؤثر الهيم نشاط البروتينات الأساسية يشير مثل التيروزين كيناز JAK2 والهلال الأحمر السوداني، والتي تعتبر ضرورية لعمل الخلية سليم و4،20،25 نمو الخلايا. فقد وجد أن في هيلا خلايا الهيم تثبيط يسبب اعتقال دورة الخلية وتفعيل علامات الشيخوخة المرتبطة وموت الخلايا المبرمج 26. وترتبط كل من هيم نقص أو زيادة مستويات الهيم مع آثار صحية خطيرة في البشر 27. والجزيئي الزوارالثانية وقد أظهرت الدراسات الوبائية وجود علاقة إيجابية من السعرات الهيم عالية وزيادة خطر الأمراض، مثل مرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والشرايين والسرطانات عدة بما في ذلك سرطان الرئة وسرطان القولون والمستقيم وسرطان البنكرياس 27،28. باستخدام زوج متطابق من مختبر خلايا الرئة العادية وسرطان المؤلفين وجدت أن الخلايا السرطانية قد زادت من مستويات استهلاك الأوكسجين، والتوليف الهيم والبروتينات المشاركة في امتصاص الهيم والأكسجين استخدام 28. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط تخليق الهيم انخفض استهلاك الأكسجين، والانتشار، وتشكيل الهجرة ومستعمرة من الخلايا السرطانية 28. وبالتالي، فإن التقلبات في مستويات الهيم الذاتية يلعب دورا هاما في تنظيم العمليات الجزيئية والخلوية 3،4،28،29. في الثدييات، والتخليق الحيوي للالهيم يحدث في ثماني خطوات، تشمل الإنزيمات الموجودة في الميتوكوندريا والعصارة الخلوية 4 (الشكل 1). الهيم biosynأطروحة تبدأ في المصفوفة الميتوكوندريا مع التكثيف من الجلايسين وsuccinyl، لجنة الزراعة لتكوين حمض 5-أمينوليفولنيك (5-ALA)، يحفزه ALA سينسيز (ALAS) 4،31. هذا هو معدل الحد خطوة في التخليق الحيوي الهيم في الخلايا nonerythroid. 5-ALA ومن ثم تصديرها إلى العصارة الخلوية التي تحدث فيها الخطوات الأربع المقبلة لتشكيل مولد الكوبروبرفيرين III (CPgenIII)، وهو ما يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا، حيث يتم تحويلها إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX). وأخيرا، يتم تضمينها جزيء واحد من الحديد إلى بروتوبرفيرين التاسع (PPIX) لإنتاج الهيم، وهو رد فعل يحفزه فيروكيلاتاز (FECH) 2،4. مستوى الهيم الحيوي يعتمد بالدرجة الأولى على مستوى ALAS الانزيم الذي يسيطر بإحكام من قبل الحديد داخل الخلايا والهيم (4). الحيوي من الهيم يمكن أن تتأثر عيوب وراثية، وتوافر بعض المعادن والفيتامينات (على سبيل المثال، الريبوفلافين والزنك)، والتعرض للسموم (مثل الألومنيوم والرصاص)، نقص الأكسجين، والحمى، ومستويات بعض المنشطات (على سبيل المثال، الاستروجين) 32-35. يتم تبديل مستوى تخليق الهيم في مختلف الحالات المرضية. انخفضت الحيوي الهيم يمكن أن يسبب فقر الدم وكذلك الأمراض العصبية 3،36. بدلا من ذلك، زيادة الحيوي الهيم يلعب دورا هاما في تطور بعض أنواع السرطان 28،37. وقد تبين الهيم أن تكون حاسمة لنمو والتميز وبقاء الدهنية الثدييات، محمر والخلايا العصبية 4،38-41. على سبيل المثال، نقص الهيم يؤدي إلى تلف محوار في الماوس الأساسي العصبونات القشرية عن طريق تثبيط الغلوتامات NMDA (N -methyl-D اسبارتاتي) مستقبلات 17. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط تخليق الهيم يسبب موت الخلايا المبرمج في الإنسان الظهارية عنق الرحم سرطان خلايا هيلا 26،41. لذلك، وقياس مستويات الهيم الحيوي في خلايا مختلفة في ظل ظروف مختلفة المهم لدراسة المسببات وprogressiعلى العديد من الأمراض. نحن هنا تصف طريقة سريعة وحساسة لقياس مستوى تخليق الهيم الخلايا باستخدام [4- 14 C] حمض 5-aminolevulic. هذا هو أسلوب بديل لأساليب أخرى باستخدام 55 أو الحديد 59 الحديد. نحن نفضل استخدام 14 C لإشعاعه ضعيف جدا. في المقابل، لا بد من حماية قوية للعمل مع نظائر الحديد. وعلاوة على ذلك، المقصود هذه الطريقة لقياس ومقارنة التوليف الهيم في خلايا مختلفة في موازاة ذلك بطريقة سريعة. من أجل قياس مستويات الهيم مطلقة، يمكن للمرء استخدام أسلوب المحددة سابقا التي تنطوي على استخدام HPLC 42،43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

يخدم الهيم كمجموعة التعويضية لمجموعة واسعة من البروتينات المعروفة باسم hemoproteins، مثل الهيموغلوبين، والميوجلوبين cytochromes. وتشارك في مختلف العمليات الجزيئية والخلوية مثل النسخ الجيني والترجمة وتمايز الخلايا وتكاثر الخلايا. مستويات الحيوي من الهيم تختلف باختلاف الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا وغيرت في الحالات المرضية مثل فقر الدم واعتلال الأعصاب والسرطان. هذه التقنية تستخدم [4- 14 C] حمض 5-أمينوليفولنيك ([14 C] 5-ALA)، واحدة من السلائف في وقت مبكر من مسار الهيم الحيوي لقياس مستويات التوليف الهيم في خلايا الثدييات. هذا الاختبار يشمل حضانة الخلايا مع [14 C] 5-ALA تليها استخراج الهيم وقياس النشاط الإشعاعي إدراجها في الهيم. هذا الإجراء دقيق وسريع. يقيس هذا الأسلوب المستويات النسبية للالهيم الحيوي بدلا من المحتوى الكلي الهيم. للتدليل على استخدام هذا ميتاليكIQUE مستويات الهيم الحيوي قيست في العديد من خطوط الخلايا الثديية.

وقد استخدم هذا الأسلوب لمقارنة مستويات التوليف الهيم في الحالات العادية (HBEC30KT) مقابل السرطان (HCC4017) خلايا الرئة الشكل 2 يوضح مستوى أعلى من التوليف الهيم في الخلايا السرطانية (HCC4017) من خلايا الرئة العادية (HBEC30KT). وقد تم قياس مستوى تخليق الهيم أيضا في الخلايا الط?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells at JoVE.com

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

measurement-of-heme-synthesis-levels-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Video: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

التصوير من تلألؤ بيولوجي Upregulation هيم - 1 أوكسيجيناز في إجراء شا غوا

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...