نود أن نعترف أعضاء المختبر بوتشولز وسيغما الدريخ رني في الفريق للمناقشة. نود أن نشكر جمعية ماكس بلانك والفراء Bundesministerium Bildung اوند الإضافية اطلعوا سباقا الذهاب بيو [0315105] للحصول على الدعم. بعثة ® هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ

1. عالية الجودة المكتبات بعثة esiRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل كل الجينات في المصالح يتم اختيار المنطقة المستهدفة والأكثر عرضة محددة لاستخدام خوارزمية رني DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4 درجات DEQOR إمكانية إسكات جميع ممكن siRNAs 21 النيوكليوتيدات طويلة في مرنا المستهدفة استنادا للدولة من ال 4 فن التصميم والقيود. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحليل كل احتمال ممكن سيرنا التفاعل المتبادل مع جينات أخرى قبل تنفيذ عملية بحث BLAST ضد transcriptome للكائن دراستها. ويوفر البرنامج بذلك تحليلا للجودة الشاملة وعبر إسكات قدرات esiRNA المحتملة (300-600 غليان طول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تضخيمه في المنطقة المختارة من الجينات المستهدفة من قبل [كدنا] PCR باستخدام جينات محددة الاشعال يحيط بها سلاسل الحمض النووي الريبي ، بوليميريز - عاثية المروج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحقق من كل منتج PCR المستخدمة لإنتاج esiRNA بعثة للهوية من خلال تسلسل والنقاء من خلال تحليل Labchip الفرجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو كتب طويلة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي من PCR المنتجات التي بوليميريز الحمض النووي الريبي ، يعقبه الصلب من فروع كتب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدون esiRNAs بواسطة الهضم الأنزيمي محدود من الحمض النووي الريبي مزدوج الخيط الطويل باستخدام RNaseIII تليها تنقية عبر أنيون تبادل اللوني باستخدام أعمدة الدوران Q - sepharose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعجلت esiRNAs ومعلق في TE العازلة. ويتم قياس العائد من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية القياسات ويتم ضبط التركيز عن طريق إذابة في حجم مناسب لTE العازلة. يتم فحص الجودة الشاملة للمنتج النهائي عن طريق تحليل Labchip الفرجار. </li></ol> 2. اختيار خط الخلية وتعظيم ترنسفكأيشن للفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عاير كميات من esiRNA (استخدام Eg5 بأنها إيجابية وrenilla - luciferase والسيطرة السلبية) وزيادة كميات من كاشف ترنسفكأيشن في صفيحة 384 أيضا ، إضافة الخلايا واحتضان لمدة 48 ساعة. Eg5 هو بروتين kinesin المحركات المطلوبة لتجميع القطبين المغزل واستنزاف تؤدي إلى اعتقال الإنقسامية. كرر هذا الإجراء لالكواشف ترنسفكأيشن مختلفة وخطوط الخلية. هنا ، فإننا نستخدم خلايا هيلا مثقف وفقا للإجراءات العادية oligofectamine (Invitrogen) وكاشف ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختيار الظروف المثلى ترنسفكأيشن عدد الخلايا transfected مع Eg5 esiRNAs التي تظهر اعتقال الإنقسامية (شكل دائري) ، والعدد الكلي للخلايا transfected مع esiRNA (RLUC) renilla - luciferase بواسطة المجهر الضوئي. اختيار الشرط مع أقل سمية للRLUC النمط الظاهري وأكثر وضوحا لEg5. طريقة بديلة لتحسين ظروف ترنسفكأيشن ينطوي على خط معربا عن الخلية مستقرة EGFP (أو الجين مراسل مناسبة أخرى) تحت سيطرة المروج نشط التأسيسية. بعد ترنسفكأيشن لesiRNA ضد EGFP (أو الجين مراسل آخر) وRLUC (أو مناسبة أخرى esiRNA السيطرة السلبية) قياس تدق إلى أسفل فعالية وسمية التي مضان مثل الفرز بمساعدة خلية (FACS). تأكد من أن تستخدم لesiRNA EGFP مكملة تماما لمرنا المستهدفة. </li></ol> 3. إعداد الشاشة الابتدائية 5،6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين دقة pipetting لجميع المكونات المستخدمة في محطة pipetting الآلي (مثل الدلو ، وTecan WellMate ، مصفوفة). لأن المعلمات pipetting تتغير اعتمادا على نوع من الحل نوع وحجم وطبق هذا التحسين أن تتكرر في كل خطوة على حدة. إذا كان ذلك ممكنا ، ينبغي أن توضع في محطة pipetting تحت غطاء تدفق الصفحي لتجنب التلوث. يجب تطهير جميع المكونات المستخدمة قبل استخدام إما عن طريق التعقيم إذا أمكن ، أو عن طريق الرش مع الايثانول 75 ٪. تحسين غسل بروتوكولات بحيث عبر تلوث من بئر إلى بئر استبعادها. يمكن تفاصيل عن الاستفادة المثلى من pipetting الآلي لا يمكن إعطاء لقيود في الفضاء ، وتعتمد بشكل كبير على محطة pipetting المستخدمة. لمزيد من المعلومات تشير إلى المصنوعات البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect الخلايا في شكل جيد باستخدام 384 الأمثل من الشروط المذكورة أعلاه مع esiRNAs لEg5 وRLUC. استخدام نمط بالتناوب لEg5 esiRNA RLUC وتغطي لوحة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 48 ساعة إصلاح الخلايا مع البرد الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، في برنامج تلفزيوني ترطيب لمدة 15 دقيقة ، وصمة عار لمدة 25 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام / مل ودابي ميكروغرام / 100 مل ريبونوكلياز A (Qiagen). يغسل أخيرا مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة دابي ومضان على سبيل المثال عن طريق الفحص المجهري على نظام ScanR أوليمبوس. إنشاء رسم بياني عن طريق التآمر ضد دابي كثافة عدد الخلايا وتقييم توزيع دورة الخلية عن طريق حساب نسبة الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي 2N المحتوى للمرحلة - G1 ، &lt;2N&gt; 4N ل S - المرحلة ؛ 4N لوG2/M-phase &gt; 4N لعدم توازن الصبغيات / تعدد الصيغ الصبغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تجانس النتائج على لوحة. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين إذا النتائج تختلف اختلافا كبيرا لاستبعاد موقف EFFEسنت. مشكلة شائعة عند استخدام لوحات متعددة جيدا هو التبخر المعززة على حافة الآبار خلال فترة الحضانة. هذا يؤدي إلى ظروف تجريبية مختلفة في الآبار المختلفة ، والتي غالبا ما يترجم إلى لوحة - موقف آثار محددة. لهذا السبب ، فإننا ننصح لمغادرة جميع الآبار فارغة لحافة الشاشة. لمزيد من تقليل التبخر تأكد من أن يتم الاحتفاظ الحاضنات في الرطوبة العالية. علينا أيضا أن توظف بشكل روتيني الحواجز تبخر مثل الشريط ختم تنفس كورنينج التي تمنع التبخر. الموارد الأخرى أيضا لتأثيرات الموقف يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار ، مثل الاختلاف التقنية لنظام قراءات (المجهر ، لوحة القارئ ، الخ) أو الاختلافات في التعامل مع السائل (التدرجات ، التجانس من الحلول ، الخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفروق ذات دلالة إحصائية بين الضوابط الإيجابية والسلبية مقياسا لأهمية الفحص المستخدمة. هناك فرق كبير بين مراقبة سلبية (أو الضوضاء الخلفية ، للسيطرة وهمية) ، ونموذج يجب أن تكون وضعت قبل بدء الفرز الفعلي. مقياس جيد للدلالة إحصائية هو Z - عامل. يحسب Z عامل المعادلة التالية : Z = 1 -- (3 SD [نموذج] + 3 SD [وهمية] (*) | شارع [نموذج] -- شارع [وهمية] |) -1 ؛ مع SD : الانحراف المعياري ؛ شارع : متوسط. A - Z عامل 1&gt; Z&gt; 0.5 يشير إلى وجود انفصال ذات دلالة إحصائية للضوابط السلبية (والضجيج) من الضوابط الإيجابية 7. </li></ol> 4. الشاشة الرئيسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 384 جيدا لوحات لزراعة الأنسجة ترنسفكأيشن esiRNAs من الاستفادة الأمثل من الشروط المذكورة أعلاه. هنا ، فإننا نستخدم esiRNA 15ng لكل بئر الذائبة في TE 5μl العازلة. يجب أن يتم تحميل مواقع السيطرة ثمانية على الاقل في لوحة التحكم مع مناسبة الإيجابية والسلبية لعملية بيولوجية درس (هنا : Eg5 وRLUC). لتجنب الآثار موقف يتم تحميلها على حافة الآبار مع العازلة TE 5μl فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5μl OptiMEM (Invitrogen) التي تحتوي على Oligofectamine 0.2μl لكل بئر ، ومزيج احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق على الخلية الخليط ترنسفكأيشن (هنا : 40μl لتعليق الخلية هيلا في 25 خلية / ميكرولتر تركيز ؛ أي ما يعادل 1000 في الخلايا أيضا) ، واحتضان لمدة 72 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الحمض النووي المحتوى على المجهر الآلي (أوليمبوس ScanR ، راجع أعلاه). تقييم باستخدام Z - إحصاءات لاختيار درجة ضرب : Z - تحسب لجميع الدرجات esiRNAs العينة باستخدام إشارة سلبية للتحكم كمرجع. علما ، و- Z النتيجة ليست هي نفسها كما Z - عامل. Z - عشرات توفير قدر الإحصائية لأهمية القيم في عينة المقارنة لتحكم (وهمية). يتم احتسابها بعد المعادلة : Z = (القيمة [مثال] -- متوسط ​​[وهمية]) * المعايير الانحراف [صورية] -1. لاختيار بلغت عتبة لابد من تطبيقها. عادة ، وهي معايير الأهمية مثل : 2 &lt;Z يستخدم &lt;-2 ، ولكن تبعا لنوعية ورقة العمل ، ودرس عملية بيولوجية أو ببساطة نطاق الشاشة ، وعتبات مختلفة قد تكون قابلة للتطبيق. يمكن بجانب الإحصاءات Z - درجة السهل أن تستخدم أيضا أساليب تقييم أكثر تفصيلا الرياضية (يمكن العثور في الداخل لأول مرة في مجال تقييم واسعة من البيانات الإحصائية للتحري آخرون مالو 8). </li></ol> 5. الشاشة الثانوية والتحقق ضرب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة ثانوية يلي الشاشة الرئيسية للقضاء على ايجابيات كاذبة بسبب أخطاء تجريبية أو تأثيرات خارج الهدف. وينبغي ليضرب مختارة تتكرر نفس الإجراءات المستخدمة في الشاشة الرئيسية لأكبر عدد من نسخ مكررة (3-5) للسماح لأفضل تقييم الإحصائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي التحقق منها لتوجيه ضربات يمكن استخدام esiRNA الثانوية غير متداخلة (أو إسكات آخر الزناد غير المتداخلة) ضد الأهداف المحددة في الشاشات الأولية. ينبغي تطبيق نفس مقايسة وتلا ، كما على الشاشة الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن في نهاية المطاف يمكن التحقق من صحة هذه الجينات التي اختارتها الانقاذ رني عبر الأنواع 9. وبالتالي هو transfected ستابلي البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) الترميز مثل الماوس ortholog من الجينات في الخلايا. BAC - ثوابت الحفاظ على الجينات في سياقها الجينومية والسماح للتعبير تقريبا الفسيولوجية. ورني ضد الجينات البشرية الذاتية يترك التعبير دون تغيير الماوس التحوير الذي ينقذ لرني - النمط الظاهري. رني الانقاذ يوفر الذهب القياسية للتحقق من الظواهر رني المتاحة حتى الآن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، تتم دراسة المرشحين المصادق بتفصيل أكبر لجني في نهاية المطاف فهم الآلية. ويمكن في كثير من الحالات يمكن استخدام رني في هذه التجارب ، على سبيل المثال في المقايسات والثانوي أكثر تفصيلا. </li></ol>

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

الكتاب تعلن العلاقات المالية مع الكيانات التجارية التي قد يكون لها مصلحة في العمل المقدم.

لقد أصبح التدخل RNA تقنية قياسية لدراسة الخسائر من الظواهر ذات وظيفة. على نطاق واسع ، مجموعات من الوسطاء رني المتوفرة من مختلف الموردين ، وتوفير وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة لإسكات الجينات. فتح هذا الباب لفحص منتظمة لرئيسى لاعبين في كثير من العمليات البيولوجية السماح منظور الجينوم النطاق بشأن طائفة واسعة من الأنواع المختلفة وأنواع الخلايا. ارتفاع معدلات سلبية كاذبة وزائفة إيجابية تشكل تحديا مشتركا في شاشات رني. لمعالجة هذه المشكلة ، وقد استثمرت جهودا كبيرة لتحسين كفاءة وعلى وجه الخصوص بتشغيل خصوصية إسكات. كان الاكتشاف المهم أن مجموعة من siRNAs مختلفة تستهدف نص يعزز إلى حد كبير نفس النوعية المستهدفة. لأنه أنتج مجموعة معقدة جدا من siRNAs مختلفة من endoribonuclease ، esiRNAs مرتفعة مشغلات خصوصية المستهدفة ، وتخفيض معدل إيجابية كاذبة في شاشات رني. وقد أثبتت esiRNAs أيضا لتحقيق knockdowns كفاءة ، وخفض أيضا سعر سلبية كاذبة. لأن الشاشات رني يطالبون من الناحية الفنية ، فإنها من المرجح ان تظل تحديا لأداء على أساس روتيني لبعض الوقت. لكن ، وكما كواشف المختبرات وأدوات الحصول على أفضل وأكثر خبراتهم ، تعتبر استخدام شاشات رني في البيولوجيا الحديثة لزيادة في المستقبل.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي الآلية الأساسية الخلوية للتحكم في التعبير الجيني. هي التي يسببها رني الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل قصيرة الصغيرة التي تعرف أيضا باسم الرناوات التدخل (siRNAs). على المدى القصير المزدوج تقطعت بهم السبل الرناوات تنشأ من السلائف مزدوجة يعد تقطعت بهم السبل نتيجة نشاط المقامر ، وهو بروتين من عائلة الثالث من ريبونوكلياز endonucleases. الشظايا الناتجة مكونات الحمض النووي الريبي إسكات المعقدة التي يسببها (RISC) وتوجيهه إلى الهدف مرنا وما شابه ذلك. RISC يشق على مرنا الهدف مما يقلل من التعبير عن بروتين ترميز 1،2،3. وقد أصبح وسيلة قوية رني وتستخدم على نطاق واسع تجريبية لفقدان دراسات وظائف الجينات في خلايا الثدييات الصغيرة الاستفادة الرناوات التدخل. حاليا اثنين من الطرق الرئيسية تتوفر لإنتاج صغيرة الرناوات التدخل. أسلوب واحد يتضمن التركيب الكيميائي ، في حين أن أسلوب بديل توظف الانقسام endonucleolytic محددة الهدف الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل منذ فترة طويلة الثالث ريبونوكلياز في المختبر. وبذلك ، يتم إنتاج مجموعة متنوعة من سيرنا مثل [أليغنوكليوتيد] الذي يعرف أيضا باسم endoribonuclease المعدة أو esiRNA سيرنا. مقارنة بين فعالية siRNAs كيمائيه وesiRNAs يظهر أن كلا من مشغلات هي كامنة في إسكات الجينات المستهدفة. ويمكن أن الاختلافات ينبغي ألا ينظر إليه عند مقارنة التحديد. العديد من واحدة تنتج كيميائيا توليفها siRNAs بارزة خارج الهدف آثار ، في حين أن مزيج معقد المتأصلة في esiRNAs يؤدي الى ضربة قاضية أكثر تحديدا 10. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم تصميم الجينوم النطاق المكتبات esiRNA بعثة واستخدامه لفحص رني التي تجسدت شاشة محتوى الحمض النووي لتحديد الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية. نعرض كيفية تحسين بروتوكول ترنسفكأيشن والفحص لفرز في إنتاجية عالية. أيضا كيف نبرهن على مجموعات كبيرة من البيانات يمكن تقييمها إحصائيا والحاضر وسائل للتحقق من صحة يضرب الابتدائي. أخيرا ، يمكن أن نعطي نقطة انطلاق لمزيد من التوصيفات الوظيفية الزيارات التحقق من صحتها.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.

Video: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

البكتيرية تسليم المستجيبات رني : Transkingdom رني

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.