نشكر T. Shatova للمناقشة مفيدة على التصميم التجريبي وتحليل البيانات. المساعدة والخبرة من G. باراديس، واعترف أفراد التدفق الخلوي الأساسية في معهد كوخ، وموظفي مختبر التكنولوجيا مايكروسيستمز في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا بامتنان. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EB011187 RC1-02، DE013023، DE016516، EB000351، وجزئيا من قبل المركز الوطني للسرطان معهد السرطان دعم (كور) المنح P30-CA14051 وMPP-09Call-انجر-60.

1. تخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين خزانات، وأصحاب والحلقات والأجهزة ميكروفلويديك في الايثانول 70٪. استخدام الحاويات (مثل جرة أو كوب) التي لديها غطاء لمنع التبخر وتلوث الغبار أو الجزيئات خارج. وضع الأجهزة في حاوية واحدة (1) والخزانات وO-حلقات في حاوية الثانية (2)، وأصحاب في الثالثة (3). </li></ol> ملاحظة: استخدام الايثانول 70٪ للتخزين هو الحفاظ على العقم. إذا كانت مكونات فقط من الحل هي الايثانول والماء (أي لا وكلاء تغيير طبيعة)، وينبغي أن تكون جميع مكونات النظام متوافق تماما ولن تتحلل بمرور الوقت. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير الحل الايثانول في حاويات (2) و (3) قبل كل استعمال لمنع انتقال التلوث عبر التجارب والتقليل من وجود جزيئات غير المرغوب فيها التي يمكن أن تسبب انسداد. </li></ol> 2. تجربة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاويات المكان (2) و (3) في حمام بالموجات فوق الصوتية للص 5-10 دقيقة قبل كل استعمال. هذا يساعد على إزالة أي جزيئات الملوثة من التجارب السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مساحة العمل نظيفة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع 70٪ محلول الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش جميع المواد (3 حاويات، وملاقط) بمحلول الإيثانول 70٪ قبل وضعها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. </li></ol> 3. جمعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنصوص عليها 2-3 مناديل منخفضة من الوبر في منطقة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خزانات البلاستيك من الحاويات مع ملاقط وتضعها على مناديل لتسهيل تبخر حل الإيثانول من الأسطح الداخلية. بلطف الاستفادة من الخزانات على السطح أو نفخ الهواء من خلالهم لتسهيل إزالة الحل الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج O-حلقات في الفتحة المناسبة على الخزانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حامل ورقائق من الحاويات منها والسماح لتتبخر الإيثانول (~ 1-2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط لوضع رقاقة المطلوب وجها حتى (أي الثقوب الوصول لأعلى) في حامل. رفع حاملمع رقاقة لeyelevel للتأكد من رقاقة والاستلقاء في حامل وتعديل إذا لزم الأمر مع ملاقط. هام: إذا لم يصلح الجهاز بشكل صحيح على حامله، هناك خطر في أن كسر أثناء الخطوات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وضع بلطف الخزانات على حامل ومواءمتها مع لقطات. كن حذرا بأن الحلقات لا تسقط من فتحاتها أثناء هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط برفق لأسفل على الخزانات حتى ينقرون في مكانها. تأكد من أن كلا الجانبين من خزانات آمنة وأن رقاقة يبدو أن في الموضع الصحيح. </li></ol> 4. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلايا ملتصقة (خطوط الأولية أو المنشأة): لوحة الخلايا 1-2 أيام قبل التجربة بحيث لا تزيد عن 80٪ متموجة في يوم التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا في التعليق (في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام ذات الصلة) وتهدف للتركيز التشغيل من 1.0 × 10 6 خلية / مل إلى 1.0 × 10 7 سلليرة سورية / مل. ملاحظة: إننا لم يلحظ تغييرات كبيرة في الأداء التسليم بسبب تركيز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج الخلايا والمواد تسليم المطلوب في أنبوب منفصلة للحصول على تركيز المواد المطلوبة للتجربة. هام: لأن طريقة التسليم وصفها يعتمد على نشرها لتسهيل التسليم، وتركيز المواد أعلى عائد أعلى التسليم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام حل 1 ميكرومتر من المواد المطلوبة للمحاكمات الأولية. ويمكن بعد ذلك معاير هذا التركيز عليها في التجارب المستقبلية حسب الحاجة. تركيز أقل ذكرت المستخدمة مع هذا الجهاز هي 10 نانومتر 21. </li></ol> 5. عملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط من خلايا ماصة والمادية التسليم في خزان (التصميم الحالي لديه القدرة القصوى 150 ميكرولتر). ملاحظة: معظم التصاميم الجهاز هي عكسها تماما وبالتالي لا يهم اتجاه تدفق من خلال القنوات. قد يتم تحميل العينات في أي من الخزانات اثنين. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق أنابيب الضغط إلى الخزان شغل وتشديد الجوز لضمان ختم الصحيح (ضيق الإصبع غالبا ما يكون كافيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الضغط إلى المستوى المطلوب على منظم. هذا يتحكم في السرعة التي تنتقل عبر خلايا الجهاز. لاحظ أنه لا يبدأ تدفق الخلية حتى يتم الضغط على زر. </li></ol> ملاحظة: في الأعمال السابقة، والنيتروجين أو الهواء المضغوط عملت بشكل جيد على قدم المساواة مع الغاز الناقل. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجهاز إلى مستوى العين وتوجيهه بحيث السائل في الخزان مرئيا بسهولة. ملاحظة: تعقب العمود السائل لاغلاق النظام قبل أن يتم تفريغ الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر للضغط الخزان ويبدأ تدفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكون مستوى السائل حوالي 2 مم من قاع الخزان، سرعان ما تتحول المنظم ل0 رطل لوقف التدفق. هام: إذا كان واحد فشل في وقف تدفق قبل يتم إفراغ الخزان، واحد مخاطر إخراج عينة من collectioن الخزان. نلاحظ أيضا أنه إذا كان عمود السائل لا يتحرك بوتيرة ملحوظة، أو قد تباطأ نسبيا إلى حد كبير في معدل التدفق الأولي (مثل 3X أبطأ)، وربما انسداد الجهاز شنت ويحتاج إلى تبادلها. يمكن تشغيل الجهاز انسداد يؤدي إلى موت الخلايا أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا المعالجة من خزان المناسبة ووضعها في أنبوب جمع المطلوب / لوحة. هام: لا تمييع الخلايا التي تم جمعها في أي مخازن في هذه المرحلة، ذلك لأن الخلايا porated سوف تستمر في امتصاص المواد لمدة تصل إلى 10 دقيقة 20. بعد أن مرت هذه النافذة، وتمييع الخلايا في وسائل الاعلام المطلوب / العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الخلايا المعالجة أكثر أو محاولة الظروف التجريبية البديلة، كرر الخطوات من 5،1-5،7 حسب الحاجة. نذكر بأن رقائق قابلة للعكس، وبالتالي عينات يمكن تركيبه في أي الخزان. ومن المؤكد أن تبادل رقائق حسب الحاجة إذا كانت تسد. تجاهل الأجهزة المسدودة. </li></ol> 6. التفكيك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; بلطف فصل الخزانات من صاحب الرئيسية عن طريق دفع جانبا مقطع الأسلحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل جزء في حاوية التخزين المناسبة (المفصل في القسم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الرقائق المستخدمة في وعاء منفصل للتخلص منها. </li></ol>

<ol>
	<li>Schaffert, D., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+synthetic+polymer-based+systems.">Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems.</a> Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).</li><li>Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+therapeutics:+a+summary+and+pharmacological+classification.">Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+by+Direct+Delivery+of+Reprogramming+Proteins.">Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvalent+Oligonucleotide+Gold+Nanoparticle+Conjugates+as+Delivery+Vehicles+for+Platinum(IV)+Warheads.">Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).</li><li>Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+PTPs+with+small+molecule+inhibitors+in+cancer+treatment.">Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).</li><li>Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Delivery+of+Quantum+Dots+for+Live+Cell+Labeling+and+Organelle+Tracking.">Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking.</a> Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dots+for+Live+Cells+in+Vivo+Imaging,+and+Diagnostics.">Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li><li>Dahan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Dynamics+of+Glycine+Receptors+Revealed+by+Single-Quantum+Dot+Tracking.">Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li><li>Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+Silica+Nanoparticles+for+Intracellular+Delivery+of+Membrane-Impermeable+Proteins.">Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).</li><li>Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+gene+transfer.">Cationic lipids used in gene transfer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-structure-regulated+cell-membrane+penetration+by+monolayer-protected+nanoparticles.">Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles.</a> Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules.">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li><li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotube+Molecular+Transporters:+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells.">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li><li>li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Gene+Therapy:+New+Developments+In+Vivo+and+In+Vitro.">Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro.</a> Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).</li><li>Fox, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices:+a+review.">Electroporation of cells in microfluidic devices: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).</li><li>Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation:+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation.">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel,+High-Throughput+Microfluidic+Device.">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li></ol>

المؤلفين أرمون Sharei، روبرت لانغر، وكلاوس ينسن F. هي مساهمي الشركة SQZ التكنولوجيات الحيوية التي تنتج الأجهزة ميكروفلويديك المستخدمة في هذه المقالة.

قد تحتاج بعض جوانب الإجراءات التجريبية وصفها (أي عوامل أخرى من تصميم رقاقة وسرعة التشغيل) ليكون الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا والمواد التسليم يتم تطبيق نظام ل. المناقشة التي يلي عناوين بعض العوامل الأكثر شيوعا التي يجب مراعاتها عند تصميم التجارب. <p class="jove_c...

تسليم الجزيئات إلى السيتوبلازم الخلية هو خطوة حاسمة في التطبيقات العلاجية والبحوث. جسيمات متناهية الصغر بوساطة التسليم، على سبيل المثال، أظهرت المحتملة في العلاج الجيني 1،2، بينما التسليم البروتين هو وسيلة واعدة لتؤثر على وظيفة الخلوية في كل من السريرية والمختبرية 3 4 الإعدادات. غيرها من المواد، مثل المخدرات جزيء صغير، نقاط الكم، أو جزيئات الذهب، هي ذات فائدة في تطبيقات تتراوح بين علاجات السرطان 5،6 إلى 7،8 وضع العلامات داخل الخلايا، وجزيء واحد تتبع 9. غشاء الخلية غير منفذ إلى حد كبير الجزيئات. العديد من التقنيات القائمة استخدام الجسيمات النانوية البوليمرية 10،11، 12 الجسيمات الشحمية، أو التعديلات الكيميائية 13 لتسهيل اضطراب الغشاء أو تسليم endocytotic. في هذه الأساليب، وكفاءة التسليم وخلية حيوية تعتمد غالبا على هيكل اله الجزيء المستهدف ونوع من الخلايا. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون فعالة في إيصال المواد موحد هيكليا، مثل الأحماض النووية، ولكن في كثير من الأحيان غير ملائمة لإيصال أكثر تنوعا من الناحية الهيكلية المواد، مثل البروتينات والمواد النانوية 14،15 7. وعلاوة على ذلك، فإن آلية تعطيل جسيم داخلي أن معظم هذه الطرق تعتمد على كثير من الأحيان غير فعالة، وبالتالي ترك الكثير من المواد المحاصرين في الهياكل حويصلة 16. أخيرا، الأساليب التي غالبا ما يتم تطويرها للاستخدام مع خطوط الخلايا التي أنشئت لا تترجم بشكل جيد إلى الخلايا الأولية. طرق غشاء poration، مثل التثقيب الكهربائي 17،18 وsonoporation 19، وبديلا جذابا في بعض التطبيقات، ولكن من المعروف أنها تسبب انخفاض بقاء الخلية، ويمكن أن تكون محدودة من قبل المسؤول عن تسليم المواد المستهدفة. تشوه الميكانيكية السريع للخلايا، واتباع نهج ميكروفلويديك إلى التسليم، في الآونة الأخيرة demonstrated مزاياه أكثر التقنيات الحالية في سياق إعادة برمجة الخلية 20 وتسليم المواد متناهية الصغر 21. يعتمد هذا الأسلوب على تعطيل الميكانيكية س غشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد الموجودة في المخزن المؤقت المحيطة بها. وقد أثبت نظام تمكين المحتملة في تحدي سابقا أنواع الخلايا (مثل الخلايا المناعية الأولية والخلايا الجذعية) والمواد (مثل الأجسام المضادة وأنابيب الكربون النانوية). هنا، يتم وصف الإجراء عامة لاستخدام هذه الأجهزة للتسليم داخل الخلايا من الجزيئات المستهدفة. هذا الإجراء هو تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم، ومع ذلك، فمن المستحسن أن أحد إجراء التحسين وجيزة من الظروف، كما هو مفصل في المبادئ التوجيهية لدينا تصميم ذكرت سابقا 20، لأي طلبات غير المبلغ عنها سابقا. حتى الآن، تم استخدام النظام بنجاح لإيصال الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، وجزيئات الذهب، نقاط الكم، أنابيب الكربون النانوية، والبروتينق، والبوليمرات ديكستران 20،21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:375px;">Device Holder &#38; Plastic reservoir</td>
			<td style="width:136px;">SQZ Biotechnologies</td>
			<td style="width:149px;">Holder</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSRFortessa Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Cell Squeeze</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">O-Rings</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>9452K311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressure system to operate device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Pressure System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell squeezing as a robust, microfluidic intracellular delivery platform

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. وقد أظهرت هذه التقنية في معالجة التطبيقات المحتملة صعبة سابقا؛ بما في ذلك، والتسليم إلى الخلايا الأولية المناعي، وإعادة برمجة الخلية، وأنابيب الكربون، والكم نقطة التسليم. تعتمد هذه المنصة خالية من ناقلات ميكروفلويديك على اضطراب الميكانيكية للغشاء الخلية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من المواد المستهدفة. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لاستخدام لهذه الأجهزة ميكروفلويديك بما في ذلك، والتجمع الجهاز، وإعداد الخلايا، وتشغيل النظام. هذا النهج يتطلب التسليم الأمثل موجزة عن نوع الجهاز وظروف التشغيل للتطبيقات يبلغ عنها سابقا. الإرشادات المتوفرة هي تعميم لمعظم أنواع الخلايا والمواد التسليم وهذا النظام لا يتطلب مخازن المتخصصة أو خطوات التعديل الكيميائي / الاقتران. هذا العمل كما توفرق توصيات بشأن كيفية تحسين أداء الجهاز والمتاعب اطلاق النار على المشاكل المحتملة المتعلقة انسداد، الكفاءة تسليم منخفضة، وبقاء الخلية.

يحتوي الشكل 1 تخطيطي وصفية للنظام التسليم ميكروفلويديك. أرقام 2A-B توضيح نتائج نموذجية من علاج خلايا هيلا مع تصاميم مختلفة في الجهاز وجود fluorescently مترافق 3 كيلو دالتون ديكستران 20. إذا تم اتباع الإجراء بشكل صحيح، سوف أداء النظام تكون حساسة لنوع ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform at JoVE.com

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية حول كيفية استخدام النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  وقد برزت تشوه الميكانيكية السريع للخلايا باعتبارها، طريقة خالية من ناقلات واعدة للتسليم داخل الخلايا والجزيئات النانوية. يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية حول كيفية استخدام النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات. 

Video: Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...