Wir danken T. Shatova für hilfreiche Diskussion über Versuchsplanung und Datenanalyse. Die Unterstützung und Know-how von G. Paradis, werden die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie Kern an der Koch-Institut und das Personal der Mikrosystemtechnik-Labor am Massachusetts Institute of Technology dankbar anerkannt. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 unterstützt und teilweise von der National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Gewährt P30 CA14051-und MPP-09Call-Langer-60.

1. Lagerung <ol><li> Lagern Sie die Behälter, Halter, O-Ringe und mikrofluidischen Systemen in 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Behälter (zB Glas oder Becher), die einen Deckel, um Verdunstung und Kontamination durch Staub oder Partikel zu verhindern außen hat. Zeigen die Geräte in einem Behälter (1), Vorratsbehälter und O-Ringe in einem zweiten Behälter (2), in dem dritten Halter (3). </li></ol> Anmerkung: Die Verwendung von 70% Ethanol für die Lagerung ist, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Wenn die einzigen Komponenten der Lösung sind Ethanol und Wasser (dh keine Denaturierung Agenten), sollten alle System-Komponenten kompatibel sein und wird nicht im Laufe der Zeit verschlechtern. <ol start="2"><li> (3) vor jedem Gebrauch, um eine Kreuzkontamination zu verhindern und über Experimente minimieren die Anwesenheit von unerwünschten Partikeln, die dazu führen können verstopfen ändern Ethanol-Lösung in Behältern (2) und. </li></ol> 2. Experiment Vorbereitung <ol><li> Ort Behälter (2) und (3) im Ultraschallbad for 5-10 Minuten vor jedem Gebrauch. Dies hilft, entfernen Sie alle Schmutzpartikel aus früheren Experimenten. </li><li> Saubere Arbeitsbereich in Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol-Lösung. </li><li> Spray alle Materialien (3 Behälter und Pinzette) mit einer 70% igen Ethanollösung, bevor Sie sie in der biologischen Sicherheitsschrank. </li></ol> 3. Montage <ol><li> Stellen Sie nach unten 2-3 fusselarm Tücher in den Arbeitsbereich. </li><li> Entfernen Sie die Plastikbehältern aus ihrem Behälter mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Tüchern um die Verdunstung von Ethanol-Lösung von inneren Oberflächen erleichtern. Klopfen Sie die Behälter auf der Oberfläche oder blasen Luft durch sie hindurch, um das Entfernen der Ethanollösung zu erleichtern. </li><li> Legen Sie die O-Ringe in ihre entsprechenden Steckplatz auf der Reservoirs. </li><li> Entfernen Sie den Halter und Chips von den jeweiligen Behältern werden und Ethanol verdampfen (~ 1-2 min). </li><li> Pinzette, um die gewünschte Spanfläche-up (dh Zugangslöcher oben) in den Halter zu platzieren. Heben Sie den Haltermit der Chip auf Augenhöhe, um sicherzustellen, dass der Chip flach liegt in der Halterung und stellen Sie gegebenenfalls mit der Pinzette. WICHTIG: Wenn das Gerät nicht korrekt in der Halterung passen, besteht die Gefahr, dass es während der nachfolgenden Schritte zu brechen. </li><li> Weiter ist, setzen die Stauseen auf der Halterung und richten Sie sie mit den Clips. Achten Sie darauf, dass die O-Ringe nicht aus ihren Schlitzen während dieses Prozesses fallen. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf den Reservoirs, bis sie einrastet. Damit beide Seiten der Behälter sicher sind und dass der Chip wird in der richtigen Position befinden. </li></ol> 4. Zellpräparation <ol><li> Für adhärente Zellen (primäre oder etablierte Linien): Platte-Zellen 1-2 Tage vor dem Experiment, dass sie nicht mehr als 80% konfluent auf dem Tag des Experiments sind. </li><li> Platzieren Zellen in Suspension (in PBS oder relevanten Medien) und Ziel für eine Betriebskonzentration von 1,0 x 10 6 Zellen / ml bis 1,0 x 10 7 cells / ml. HINWEIS: Wir haben keine signifikanten Änderungen in der Lieferleistung durch Zellkonzentration beobachtet. </li><li> Mischen Zellen und die gewünschte Freisetzungsmaterial in einem separaten Röhrchen, um die gewünschte Stoffkonzentration für den Versuch zu erhalten. WICHTIG: Durch die beschriebene Lieferung Methode beruht auf Diffusion, die Lieferung zu erleichtern, wird eine höhere Materialkonzentration höhere Liefer ergeben. Wenn möglich, empfiehlt es sich, eine 1 uM Lösung des gewünschten Material für erste Versuche zu verwenden. Diese Konzentration kann dann nach unten in zukünftigen Experimenten nach Bedarf titriert werden. Die niedrigste Konzentration berichtet, mit diesem Gerät verwendet wird, ist 10 nM 21. </li></ol> 5. Betrieb <ol><li> Pipette Mischung von Zellen und Lieferung Material in einem Behälter (aktuelle Design hat eine maximale Kapazität 150 ul). HINWEIS: Die meisten Gerät Entwürfe sind vollständig reversibel daher Strömungsrichtung durch die Kanäle spielt keine Rolle. Proben können in einem der beiden Behälter geladen werden. </li&gt; <li> Bringen Druckschlauch auf die gefüllte Behälter und ziehen Sie die Mutter um die richtige Dichtung (handfest ist oft ausreichend) zu gewährleisten. </li><li> Stellen Sie den Druck auf das gewünschte Niveau auf dem Regler. Dies steuert die Geschwindigkeit, mit der Zellen durch die Vorrichtung zu reisen. Beachten Sie, dass Zellstrom nicht beginnen, bis die Taste gedrückt wird. </li></ol> HINWEIS: In früheren Arbeiten wurden Stickstoff oder Druckluft ebenso gut als Trägergas gearbeitet. <ol start="4"><li> Heben Gerät auf Augenhöhe und so ausrichten, dass die Flüssigkeit in dem Behälter gut sichtbar ist. HINWEIS: Verfolgen Sie die Flüssigkeitssäule zum Abschalten des Systems, bevor der Behälter geleert. </li><li> Drücken Sie die Taste, um das Reservoir unter Druck und beginnen Zelle fließen. </li><li> Wenn der Flüssigkeitspegel beträgt ca. 2 mm vom Boden des Behälters, schnell drehen den Regler auf 0 psi to Fluss zu stoppen. WICHTIG: Wenn einer ausfällt, um den Fluss zu stoppen, bevor der Behälter geleert wird, riskiert ein Auswerfen der Probe aus dem collection-Reservoir. Beachten Sie auch, dass, wenn die Flüssigkeitssäule bewegt sich nicht in einer nennenswerten Geschwindigkeit oder im Wesentlichen gegenüber ihrer Ausgangsstrom (Beispiel 3x langsamer) verlangsamt wird, wird das montierte Gerät wahrscheinlich verstopft und muss ausgetauscht werden. Der Betrieb eines verstopften Gerät kann zu höheren Zelltod führen. </li><li> Sammeln Sie die behandelten Zellen aus dem entsprechenden Behälter und legen Sie sie in der gewünschten Sammelrohr / Platte. WICHTIG: die gesammelten Zellen in beliebigen Puffern verdünnen zu diesem Zeitpunkt nicht, wie die porated Zellen wird weiterhin Material für bis zu 10 min 20 Aufnahme. Nachdem dieses Fenster verstrichen ist, verdünnt, die Zellen in dem gewünschten Medium / Puffer. </li><li> Um mehr behandelten Zellen sammeln oder versuchen alternative Versuchsbedingungen, wiederholen Sie die Schritte von 5,1 bis 5,7, wie gebraucht. Erinnern, dass die Chips reversibel sind, kann daher Proben entweder Behälter montiert werden. Achten Sie darauf, Chips austauschen, wie gebraucht, wenn sie verstopfen. Entsorgen verstopft Geräte. </li></ol> 6. Demontage <ol><li&gt; Die Behälter von der Haupthalter vorsichtig trennen, indem neben die Clip-Arme. </li><li> Legen Sie jedes Teil in der entsprechenden Vorratsbehälter (in Abschnitt 1 dargestellt). </li><li> Zeigen verwendeten Chips in einem separaten Behälter zur Entsorgung bringen. </li></ol>

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Mater. 7, 588-595 (2008).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules.">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li><li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotube+Molecular+Transporters:+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells.">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. 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L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation:+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation.">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Die Autoren Armon Aktiei, Robert Langer, und Klavs F. Jensen sind Aktionäre der Gesellschaft SQZ Biotechnologies, die die Mikrofluidik-Geräte in diesem Artikel verwendet produziert.

Bestimmte Aspekte der beschriebenen experimentellen Verfahren (dh andere als Chip-Design-und Betriebsgeschwindigkeit Faktoren) müssen je nach Zellentyp und Freisetzungsmaterial das System angewendet wird, um optimiert werden. Die Adressen, die folgt einige der häufigsten Faktoren, die bei der Gestaltung Experimente Diskussion. Um die Liefersignal für fluoreszenzmarkierten Verbindungen zu verbessern, muss man zu den Quellen der Hintergrundfluoreszenz zu adressieren. Oberflächenbi...

Freisetzung von Makromolekülen in die Zelle Zytoplasma ist ein kritischer Schritt in der therapeutischen und Forschungsanwendungen. Nanopartikel-vermittelte Abgabe, zum Beispiel, hat Potenzial in der Gentherapie 1,2 gezeigt, während Protein-Lieferung ist ein vielversprechendes Mittel beeinflussen die Zellfunktion sowohl in klinischen und Labor 3 4 Einstellungen. Andere Materialien, wie zum Beispiel Medikamente aus kleinen Molekülen, Quantenpunkte oder Gold-Nanopartikel, sind von Interesse in Anwendungen von Krebstherapeutika 5,6 bis 7,8 intrazelluläre Markierung und Einzelmolekül-Tracking-9. Die Zellmembran weitgehend undurchlässig für Makromoleküle. Viele existierende Techniken verwenden, polymere Nanopartikel 10,11, Liposomen 12 oder chemische Modifikationen 13 bis Membran Störung oder endozytotische Lieferung zu erleichtern. Bei diesen Verfahren sind die Abgabeeffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen oft abhängig von der Struktur der the Zielmolekül und der Zelltyp. Diese Verfahren können bei der Lieferung von strukturell einheitlichen Materialien wie Nukleinsäuren effizient sein, aber für die Lieferung von mehr strukturell unterschiedlichen Materialien, wie Proteinen und 14,15 Nano 7 sind oft ungeeignet. Darüber hinaus ist der Mechanismus, der Endosomen Störung meisten dieser Verfahren beruhen auf häufig ineffizient vor, sodass viel Material in Vesikel-Strukturen 16 gefangen. Schließlich, Methoden, die oft für die Verwendung mit etablierten Zelllinien entwickelt, sind nicht gut zu übersetzen, um Primärzellen. Membranporenbildung Methoden wie Elektroporation 17,18 Sonoporation und 19, sind eine attraktive Alternative in einigen Anwendungen, jedoch sind sie bekannt, die Lebensfähigkeit der Zellen gering verursachen und kann durch die Ladung der Ziel Lieferung Material begrenzt werden. Schnelle mechanische Verformung von Zellen, einer mikrofluidischen Ansatz zur Lieferung, hat vor kurzem, EinzelhandelATED seine Vorteile gegenüber aktuellen Techniken im Rahmen der Neuprogrammierung Zelle 20 und 21 Nanomaterial Lieferung. Dieses Verfahren beruht auf mechanischen Störung o der Zellmembran zu cytosolische Abgabe von in der Umgebung vorhandenen Materialien Puffer erleichtern. Das System hat gezeigt, wodurch Potenzial in zuvor Herausforderung Zelltypen (zB primäre Immunzellen und Stammzellen) und Materialien (zB Antikörper und Kohlenstoffnanoröhren). Hierbei wird die allgemeine Vorgehensweise, um diese Geräte für intrazellulären Transport von Makromolekülen Ziel verwenden beschrieben. Das Verfahren ist verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien, jedoch ist es empfehlenswert, dass man führen eine kurze Optimierung der Bedingungen, wie in unserem zuvor berichtet, Design-Richtlinien 20 beschrieben, für alle bisher nicht gemeldet Anwendungen. Bisher hat das System erfolgreich für die Lieferung von RNA-, DNA-, Gold-Nanopartikel, Quantenpunkte, Kohlenstoff-Nanoröhren, Protein verwendets und Dextran-Polymere 20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:375px;">Device Holder &#38; Plastic reservoir</td>
			<td style="width:136px;">SQZ Biotechnologies</td>
			<td style="width:149px;">Holder</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSRFortessa Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Cell Squeeze</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">O-Rings</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>9452K311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressure system to operate device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Pressure System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell squeezing as a robust, microfluidic intracellular delivery platform

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Diese Technologie hat bei der Bewältigung zuvor anspruchsvolle Anwendungen Potenzial gezeigt, einschließlich der Lieferung in primären Immunzellen, Zell Umprogrammierung, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Quantenpunkt-Lieferung. Dieser vektorfreien mikrofluidischen Plattform stützt sich auf mechanische Zerstörung der Zellmembran zu cytosolische Abgabe des Zielmaterials zu erleichtern. Hier beschreiben wir die detaillierte Verfahren für die Verwendung dieser Mikrofluidvorrichtungen einschließlich Vorrichtungsanordnung, Zellpräparation und den Systembetrieb. Dieser Liefer Ansatz erfordert eine kurze Optimierung von Gerätetyp und Betriebsbedingungen für die zuvor gemeldet Anwendungen. Die Anweisungen gelten verallgemeinerbar zu den meisten Zelltypen und Liefer Materialien wie dieses System nicht spezialisierten Puffer oder chemische Modifikation / Konjugation Schritte erfordern. Diese Arbeiten stellen auchs Empfehlungen, wie die Geräteleistung zu verbessern und störungs schießen mögliche Probleme zu Verstopfung, geringe Liefer Effizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zusammen.

Fig. 1 enthält eine schematische beschreibende des mikrofluidischen Zufuhrsystem. Figuren 2a-b veranschaulichen typische Ergebnisse der Behandlung von HeLa-Zellen mit unterschiedlichen Geräteausführungen in Gegenwart von fluoreszenz konjugierten 3 kDa-Dextran-20. Wenn das Verfahren korrekt befolgt, wird die Systemleistung empfindlich auf Gerätetyp und Betriebsgeschwindigkeit. Daher sollte man diese Bedingungen für eine bestimmte Anwendung, bevor zu anspruchsvollen Versuc...

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Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology.  Schnelle mechanische Verformung von Zellen als vielversprechender, Vektor-freie Methode für intrazellulären Transport von Makromolekülen und Nanomaterialien entstanden. Dieses Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie das System für eine breite Palette von Anwendungen. 

Serie: Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...