אנו מודים לט Shatova לדיון מועיל על עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. הסיוע והמומחיות של ג Paradis, כוח האדם של cytometry זרימת הליבה במכון קוך, ואת צוות של המעבדה לטכנולוגית מיקרוסיסטמס במכון טכנולוגית של מסצ&#39;וסטס הכירו בהכרת תודה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, וחלקית על ידי מכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה (Core) מענקי P30-CA14051 וMPP-09Call-לנגר-60.

1. אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את מאגרי המים, בעלים, O-טבעות ומכשירי microfluidic ב70% אתנול. השתמש במכל (לדוגמא צנצנת או כוס) שיש לו מכסה כדי למנוע אידוי וזיהום על ידי חלקיקי אבק או בחוץ. הנח את המכשירים במכולה אחת (1), מאגרים וטבעות אטימות במכל שני (2), והמחזיקים בשלישי (3). </li></ol> שים לב: השימוש באתנול 70% לאחסון הוא לשמור על סטריליות. אם המרכיבים היחידים של הפתרון הם אתנול ומים (כלומר אין סוכני denaturing), כל רכיבי המערכת צריכים להיות תואמים באופן מלא ולא לבזות לאורך זמן. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פתרון אתנול במכולות (2) ו (3) לפני כל שימוש כדי למנוע זיהום צולב פני ניסויים ולמזער את הנוכחות של חלקיקים לא רצויים שיכול לגרום לסתימה. </li></ol> 2. ניסוי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכלי מקום (2) ו (3) באמבטית אולטרסאונד עבורr דקות 5-10 לפני כל שימוש. מסייע בהסרה כל חלקיקים מזהמים מניסויים קודמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבת עבודה נקייה בארון בטיחות ביולוגי עם 70% פתרון אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את כל החומרים (3 מכולות, ופינצטה) עם פתרון אתנול 70% לפני הצבתם בתוך ארון הבטיחות הביולוגי. </li></ol> 3. עצרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבע 2-3 מגבונים נמוך מוך באזור העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגרי פלסטיק מהמכל שלהם עם פינצטה והעלית אותם במגבונים כדי להקל על אידוי של פתרון אתנול ממשטחים פנימיים. לטפוח בעדינות את המאגרים על פני השטח או לפוצץ באוויר דרך אותם כדי להקל על ההסרה של תמיסת אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס O-טבעות לתוך החריץ המתאים שלהם במאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעל ושבבים ממכולות בהתאמה ולאפשר אתנול להתאדות (~ 1-2 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי למקם את הפנים כלפי מעלה הרצוי שבב (כלומר חורים את גישה) במחזיק. הרם את בעלעם השבב לeyelevel לוודא השבב שוכב בבעל ולהתאים במידת צורך עם פינצטה. חשוב: אם המכשיר אינו מתאים כראוי במחזיק בה, קיים סיכון שהיא תישבר במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, מניחים בעדינות את המאגרים על בעל וליישר אותם עם הסרטונים. היזהר שO-טבעות לא נופלים מהחריצים שלהם במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות ללחוץ כלפי מטה על המאגרים, עד שהם לוחצים למקומו. ודא ששני הצדדים של המאגרים מאובטחים, וכי השבב נראה בתנוחה הנכונה. </li></ol> 4. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חסיד (קווים ראשוניים או שהוקמו): תאי פלייט 1-2 ימים לפני הניסוי כזה שהם לא מחוברים יותר מ -80% ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאים בתרחיף (ב PBS או מדיה רלוונטית) ולשאוף לריכוז פעילות של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר x ל1.0 10 7 cells / מיליליטר. הערה: לא נצפה בשל ריכוז תא שינויים משמעותיים בביצועי מסירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תאים ואת חומר המשלוח הרצוי בצינור נפרד כדי להשיג את ריכוז חומר המבוקש לצורך הניסוי. חשוב: בגלל שיטת ההצגה המתוארת מסתמכת על דיפוזיה כדי להקל על הגשה, ריכוז חומר גבוה יותר יניבו משלוח גבוה יותר. במידת האפשר, מומלץ להשתמש בפתרון 1 מיקרומטר של החומר הרצוי לניסויים ראשוניים. ריכוז זה אז יכול להיות טיטרציה למטה בניסויים עתידיים במידת צורך. הריכוז הנמוך ביותר שדווח בשימוש עם מכשיר זה הוא 10 ננומטר 21. </li></ol> 5. מבצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת פיפטה של ​​תאים וחומרי אספקה ​​למאגר (יש עיצוב הנוכחי קיבולת μl מקסימום 150). הערה: רוב עיצובי המכשיר הם הפיכים לחלוטין ולכן כיוון הזרימה בצינורות לא משנה. עשויות להיות עמוסות דוגמאות לכל אחד משני המאגרים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות לחץ למאגר המלא ולהדק את האום כדי להבטיח אטימה נאותה (הדוק אצבע הוא לעתים קרובות מספיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את לחץ לרמה הרצויה על הרגולטור. זה מקובע את המהירות שבה התאים לנסוע דרך המכשיר. שים לב שתא הזרימה אינה מתחילה עד שהכפתור נלחץ. </li></ol> הערה: בעבודה קודמת, חנקן או אוויר דחוס שעבד באותה מידה כמו הגז המוביל. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את המכשיר לגובה עיניים ולכוון אותו כך שהנוזל במאגר הוא לעין בקלות. הערה: עקוב אחר עמודת הנוזל לכבות את המערכת לפני שהמאגר מתרוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן לחצים על המאגר ויתחיל תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשרמת הנוזל היא כ 2 מ&quot;מ מהחלק התחתון של המאגר, להפוך במהירות לרגולטור 0 psi כדי לעצור את הזרימה. חשוב: אם אחד לא מצליח לעצור את הזרימה לפני המאגר מתרוקן, אחד סיכונים ולהוציא המדגם מcollectioמאגר n. כמו כן שימו לב שאם עמודת הנוזל לא נעה בקצב ניכר, או הואטה באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני שלה (למשל 3x איטי יותר), המכשיר המותקן הוא כנראה סתום וצריך להיות מוחלף. הפעלת מכשיר סתום יכולה לגרום למוות של תאים גבוהים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים שטופלו מהמאגר המתאים ולמקם אותם בצינור איסוף / הצלחת הרצויה. חשוב: אל לדלל את התאים שנאספו בכל מאגרים בשלב זה כתאי porated ימשיכו ספיגי חומר לעד 10 דקות 20. לאחר חלון זה חלף, לדלל את התאים בתקשורת / החיץ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף תאים שטופלו יותר או לנסות תנאי ניסוי חלופיים, חזור על שלבים 5.1-5.7 לפי צורך. נזכיר כי השבבים הם הפיכים, יכולה להיות מותקנת ולכן דגימות בכל מאגר. הקפד להחליף שבבים במידת צורך אם הם סותמים. בטל מכשירים סתומים. </li></ol> 6. פירוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; בעדינות לנתק את המאגרים מהמחזיק העיקרי על ידי לחיצה בצד את זרועות קליפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל חלק במכל המתאים האחסון (המפורטים בסעיף 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שבבים המשמשים במכל נפרד לסילוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Schaffert, D., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+synthetic+polymer-based+systems.">Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems.</a> Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).</li><li>Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+barriers:+advances+in+siRNA+delivery.">Knocking down barriers: advances in siRNA delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).</li><li>Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+therapeutics:+a+summary+and+pharmacological+classification.">Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+by+Direct+Delivery+of+Reprogramming+Proteins.">Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvalent+Oligonucleotide+Gold+Nanoparticle+Conjugates+as+Delivery+Vehicles+for+Platinum(IV)+Warheads.">Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).</li><li>Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+PTPs+with+small+molecule+inhibitors+in+cancer+treatment.">Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).</li><li>Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Delivery+of+Quantum+Dots+for+Live+Cell+Labeling+and+Organelle+Tracking.">Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking.</a> Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).</li><li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dots+for+Live+Cells+in+Vivo+Imaging,+and+Diagnostics.">Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li><li>Dahan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+Dynamics+of+Glycine+Receptors+Revealed+by+Single-Quantum+Dot+Tracking.">Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li><li>Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+Silica+Nanoparticles+for+Intracellular+Delivery+of+Membrane-Impermeable+Proteins.">Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).</li><li>Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+gene+transfer.">Cationic lipids used in gene transfer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-structure-regulated+cell-membrane+penetration+by+monolayer-protected+nanoparticles.">Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles.</a> Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+protein+delivery+platform+based+on+single-protein+nanocapsules.">A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules.</a> Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).</li><li>Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotube+Molecular+Transporters:+Internalization+of+Carbon+Nanotube-Protein+Conjugates+into+Mammalian+Cells.">Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li><li>li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Gene+Therapy:+New+Developments+In+Vivo+and+In+Vitro.">Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro.</a> Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).</li><li>Fox, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices:+a+review.">Electroporation of cells in microfluidic devices: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).</li><li>Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation:+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation.">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel,+High-Throughput+Microfluidic+Device.">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li></ol>

המחברים ארמון שערי, רוברט לנגר, וKlavs פ ג&#39;נסן הם בעלי מניות של SQZ יוטכנולוגיות חברה שמייצרת את מכשירי microfluidic שימוש במאמר זה.

היבטים מסוימים של ההליך המתואר ניסוי (כלומר גורמים אחרים מאשר תכנון שבבים ומהירות הפעלה) ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בהתאם לסוג התא וחומר מסירת המערכת מוחל. הדיון שלהלן כתובות חלק מהגורמים הנפוצים ביותר שיש לשקול בעת תכנון ניסויים. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

משלוח של מקרומולקולות להציטופלסמה התא הוא שלב קריטי ביישומים טיפוליים ומחקר. משלוח nanoparticle בתיווך, למשל, הראה פוטנציאל בטיפול גנטי 1,2, תוך מסירת החלבון היא אמצעי מבטיח של משפיע על תפקוד תאי בשני 3 ומעבדה קליניות 4 הגדרות. חומרים אחרים, כגון תרופות מולקולה קטנות, נקודות קוונטיות, או חלקיקי זהב, הם בעלי עניין ביישומים החל תרופות לסרטן 5,6 לתיוג תאיים 7,8, ומולקולה בודדת מעקב 9. קרום התא הוא במידה רבה בלתי חדיר למקרומולקולות. קיימות טכניקות רבות משתמשות בחלקיקים פולימריים 10,11, ליפוזומים 12, או שינויים כימיים 13 כדי להקל על שיבוש קרום או מסירת endocytotic. בשיטות אלה, את כדאיות יעילות משלוח והתא הן בדרך כלל תלויה במבנה של המולקולת דואר יעד וסוג התא. שיטות אלו יכולות להיות יעילים באספקה ​​של חומרים אחידים מבחינה מבנית, כגון חומצות גרעין, אך לעתים קרובות אינו מתאימות עבור המשלוח של יותר מבחינה מבנית מגוונת חומרים, כגון חלבונים 14,15 וננו 7. יתר על כן, מנגנון שיבוש endosome שרוב השיטות אלה מסתמכים על הוא לעתים קרובות לא יעיל, ולכן משאיר את חומר רב לכוד במבני שלפוחית ​​16. לבסוף, שיטות שלעתים קרובות פותחו לשימוש עם שורות תאים הוקמו לא לתרגם גם לתאים ראשוניים. שיטות poration ממברנה, כגון electroporation 17,18 וsonoporation 19, הם חלופה אטרקטיבית ביישומים מסוימים, אך הם ידועים כגורמים לכדאיויות תא נמוכות ויכולים להיות מוגבל על ידי המטען של החומר המסירה היעד. עיוות מכאנית מהירה של תאים, גישת microfluidic למשלוח, יש לאחרונה demonstrated היתרונות שלה על פני שיטות הנוכחיות בהקשר של תא תכנות מחדש 20 ומשלוח nanomaterial 21. שיטה זו מסתמכת על הפרעה מכאנית o קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומרים הנמצאים בחיץ שמסביב. המערכת הוכיחה מאפשרת פוטנציאלי במאתגר בעבר סוגי תאים (למשל תאים חיסוניים ראשוניים ותאי גזע) וחומרים (למשל נוגדנים וצינורות פחמן). בזאת, ההליך הכללי להשתמש במכשירים אלה למסירה תאית של מקרומולקולות היעד מתואר. ההליך הוא להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי משלוח, עם זאת, מומלץ שאחד לערוך אופטימיזציה קצרה של תנאים, כמפורט בהנחיות תכנון 20 שדווחו בעבר שלנו, עבור כל יישומים שלא דווחו בעבר. נכון להיום, המערכת כבר שימשה בהצלחה עבור המשלוח של RNA, DNA, חלקיקי זהב, נקודות קוונטיות, צינורות פחמן, חלבוןים, ופולימרים dextran 20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:375px;">Device Holder &#38; Plastic reservoir</td>
			<td style="width:136px;">SQZ Biotechnologies</td>
			<td style="width:149px;">Holder</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSRFortessa Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Cell Squeeze</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">O-Rings</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>9452K311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressure system to operate device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Pressure System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell squeezing as a robust, microfluidic intracellular delivery platform

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. טכנולוגיה זו הראתה פוטנציאל בטיפול ביישומים מאתגרים בעבר, כולל, משלוח לתאים ראשוניים חיסוניים, תכנות מחדש של תאים, פחמן Nanotube, ומשלוח נקודה קוונטית. פלטפורמת microfluidic ללא וקטור זה מסתמכת על הפרעה מכאנית של קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומר היעד. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה מפורטת של שימוש למכשירי microfluidic אלה כוללים, הרכבה מכשיר, הכנת תא, ותפעול מערכת. משלוח גישה זו מחייבת אופטימיזציה קצר של סוג המכשיר ותנאי הפעלה ליישומים לא פורסם בעבר. ההוראות שסופקו הן להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי אספקה ​​כמערכת זו אינה דורשת מאגרים מיוחדים או צעדי שינוי כימי / הצמידה. עבודה זו מספקת גםשל המלצות על איך לשפר את ביצועי מכשיר וצרות-לירות בעיות פוטנציאליות הקשורות לסתימה, יעילות משלוח נמוכה, וכדאיויות תא.

איור 1 מכיל תיאורים סכמטי של מערכת מסירת microfluidic. איורים 2a-b להמחיש תוצאות טיפוסיות מטיפול בתאי הלה עם עיצובים שונים במכשיר בנוכחות dextran fluorescently מצומדות 3 kDa 20. אם ההליך ואחריו בצורה נכונה, ביצועי מערכת יהיו רגישים לסוג מכשיר ואת מהירות הפעלה. לכן,...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform at JoVE.com

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים. 

Video: Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...