نشكر ميليسا غريفين وجينا Rozacky لرعايتهم الأسماك الخبراء. الحركة الديمقراطية الشعبية وذلك بفضل EGN لكتابة المساعدة، والكرم، والصبر. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01DE020884 لJKE.

1. تربية الحيوان والمسخ جمع أليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع وتولد الزرد كما هو موضح 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت الأليلات الطافرة الزرد المستخدمة في هذه الدراسة pdgfra b1059 16، B1100 smad5 22، وSMO b577 23. مصادر لهذه السلالات الزرد تشمل ZIRC. </li></ol> 2. إعداد حلول وتطبيقات ملاحظة: جميع الحلول والأدوات يمكن أن يتم في وقت مبكر وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الإعلام الجنين (EM) كما هو موضح سابقا 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 4 ز / L MS-222 (تريكين). حل 4 غ فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4) في 450 مل من الماء المعقم. إضافة 2 غ MS-222 إلى الحل. ضبط درجة الحموضة إلى 7،0-7،2 داخل. إضافة الماء المعقم إلى وحدة تخزين ما مجموعه 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: جعل 4 جرام / لتر زيت القرنفل. تزن 0.2 غرام زيت القرنفل النقي في أنبوب 50 مل المخروطية. إضافة EM إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 3٪ methylcelluloحد ذاتها. جلب 50 مل من EM + 0.1 M HEPES ليغلي. إزالة من الحرارة. ضجة في 1.5 غرام ميثيل حتى الحل هو متجانس. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 0.2٪ الاغاروز. إضافة 0.1 غ الاغاروز إلى 50 مل EM. جلب EM ليغلي في الميكروويف أو على موقد والتحقق من أن الاغاروز قد حلت. قسامة في 500 مجلدات ميكرولتر في أنابيب microcentrifuge وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن تعديل وحدات التخزين حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المساعر الشعرية. ضع قطرة من الغراء عظمى داخل أنبوب شعري 0.9 ملم معرف. إدراج طول 4-5 سم من 6 £ اختبار حيدة خط الصيد داخل الأنبوب الشعرية مثل أن ما يقرب من 3-4 ملم من خط يمتد إلى أبعد من نهاية الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين coverslips سدها في العينة. سوبر الغراء 22 × 22-1 غطاء زجاجي على كل نهاية 24 × 60-1 غطاء زجاجي وترك الوسط المجانية. جعل الفردي (1 غطاء زجاجي صغير في النهاية) لأجنة أقل من يوم من العمر، يتضاعف (2 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة 03:59 دAYS القديمة، أو مثلثات (3 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة خمسة أيام أو أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ. ملاحظة: يقدم فراغ الشحوم كما تسرب لمنع الجفاف العينات على مدى فترات طويلة من الزمن، ولها قدرة منخفضة السمية مقارنة المواد المانعة للتسرب أكثر تقلبا. </li></ol> 3. تصاعد الأجنة الزرد لمتحد البؤر المجهري (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة مخدر. تذوب قسامة من 0.2٪ الاغاروز بواسطة الميكروويف في 20 ثانية فترات حتى السائل تماما. مزيج 8 ميكرولتر من MS-222 في 192 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز أو 5 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل في 195 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز. المحافظة في 42 ° C كتلة التدفئة. ملاحظة: التعرض الطويل لMS-222 يسبب تأخر النمو أقوى من زيت القرنفل يفعل في الزرد الجنينية 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر: dechorionate يدويا الأجنة وراثيا لم يفقس ليتم تحليلها فقط قبل التحليل. باستخدام ملقط، الشركة المصرية للاتصالات ببطءع المشيماء مفتوحة حتى يتم تحرير الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة الزرد. إضافة 1 مل من الأسهم 4 ز / L من MS-222-24 مل من وسائل الإعلام الجنين. بدلا من ذلك، إضافة 390 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل إلى 24 مل من الماء الأسماك 24. ملاحظة: الأفعال زيت القرنفل ببطء حتى تنفيذ هذه الخطوة لا يقل عن 15-20 دقيقة قبل الوقت الفاصل بين المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حبة من الشحوم فراغ حول مركز الفضاء من ساترة تواجه التصاعدي سدها. دفع ببطء الشحوم فراغ من حقنة، مما يجعل على نحو سلس، وحبة مستمرة المجاور لوالداخل من الجسور وحافة ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنتشر دائرة من 4٪ ميثيل في منتصف ساترة سدها باستخدام قضيب خشبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين المراد تصويره. عندما يتم تخدير الجنين استدراجه حتى في ماصة الزجاج. عقد ماصة صعودا عموديا للسماح للجنين أن تنزل الى القاع من السائل في ماصة. نقل ماصة في الحل الاغاروز والسماح لإسقاط الجنينفي الاغاروز. لا طرد السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة. رسم بعض الحلول الاغاروز والجنين في ماصة. طرد الجنين في قطرة من حل الاغاروز على أعلى من ميثيل. استخدام لعبة البوكر الشعرية لدفع الجنين نحو الانخفاض على ميثيل وتوجيه الجنين كما تريد للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد ساترة سد على رأس شنت واحد، أسفل. تنطبق حتى الضغط على كلا الجانبين لل coverslips محصورة حتى الجسور إجراء اتصال مباشر والأختام قطرة الاغاروز لكلا coverslips. تحقق من أن الجنين هو المنحى بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرك قضيب خشبي على طول الزجاج للتخفيف من الشقوق والفجوات في حبة الشحوم فراغ. يمحو الشحوم الزائدة من الحواف. </li></ol></li></ol> 4. الوقت الفاصل بين متحد البؤر التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا الأجنة (وقد تم تحسين هذا البروتوكول لزايس LSM 710 المجهر متحد البؤر بنايمكن تعديلها للاستخدام مع أنظمة أخرى جي برامج التصوير ZEN، و.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل المعدات. بدوره على المجهر متحد البؤر وأية أجهزة ليزر الخارجية. بدوره على جهاز كمبيوتر متصل المجهر متحد البؤر. برامج التصوير المفتوحة متحد البؤر وحدد &quot;نظام تشغيل&quot; لتفعيل ضوابط الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرحلة ساخنة. خفض منصة انطلاق المجهر متحد البؤر ونقل العدسات الهدف للخروج من الموقف. استبدال الافتراضي مع المرحلة مرحلة ساخنة الإلكترونية. تشغيل وحدة تحكم للمرحلة ساخنة وضبط درجة الحرارة ل29.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة في مجال الرؤية. وضع العينة التي شنت على خشبة المسرح. تحريك عدسة الهدف 20X في الموقف ورفع منصة انطلاق. تنشيط باعث الضوء المرئي وننظر من خلال العدسات. توسيط رأس الجنين في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إعدادات التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل قنوات مضان من خلال تحديدالطول الموجي الفلورسنت ليتم الكشف عن واختيار لون الجداول البحث (طرفية) لكل قناة. إذا لزم الأمر، استخدام عناصر التحكم اليدوي في البرنامج لتشغيل الليزر المطلوبة (على سبيل المثال 561 نانومتر لRFP). لكل قناة مضان، تعيين كثافة الليزر إلى 10.0 والجهد مضخم (HV أو مكسب) بين 600-700. تعيين المتوسط ​​إلى 4 وعمق بت إلى 16 بت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل Z-مكدس والوقت وحدات السلسلة. تعيين الثقب لقرار Z-5 ميكرون أو أصغر، وتعيين Z-الفاصل إلى مسافة الأمثل المقترحة. ملاحظة: بشكل عام، 5 ميكرون Z-قرار يسمح كل صورة Z-مكدس التي سيتم جمعها بسرعة كافية ل&quot;لقطة&quot; من الجنين عند نقطة زمنية معينة بينما حل أيضا الخلايا الفردية. تخفيض المتوسط ​​أيضا يقلل من مقدار الوقت لكل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الفاصل الزمني المطلوب الوقت بين الصور (عادة 10-20 دقيقة) ويبلغ طول التجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الموضعيةالمعلومات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحول الكاميرا إلى وضع الحية. ضبط التركيز وزيادة كثافة الليزر إذا لزم الأمر لمعرفة مضان. ضبط الزوم الرقمي إلى 0.6 للحصول على عرض أوسع، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع المرحلة بحيث كل الهياكل التي تهم واضحة، وهناك غرفة في مجال الرؤية لظهريا ثمرة والأمامية. التركيز من خلال الجنين الى الحدود العليا والدنيا من مضان. تعيين المناصب شريحة Z-كومة الأول والأخير لا يقل عن 100 ميكرون أو أكثر وراء هذه الحدود. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين كثافة مضان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين طرفية عرض يتراوح المؤشر. يجب أن تظهر الآن الهياكل الفلورسنت الأبيض، وينبغي أن تكون بقية مجال الرؤية الأزرق (أي الكشف عن) أو أسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة HV / أرباح إلى مستوى أقل بقليل حيث المشبعة (الأحمر) بكسل تظهر. إذا لزم الأمر، وضبط تعويض ذلك لم يتم الكشف عن أغلبية الخلفية (الأزرق). ملاحظة: أصغر قطر الثقب وزيادة كثافة الليزر على حد سواء تحسين صورة مواطنهيجب أن تبقى inition، ولكن كثافة الليزر منخفض للحفاظ على الأنسجة الحية. زيادة HV / ربح وقطر الثقب (&lt;5 ميكرومتر) أفضل بشكل عام إلى زيادة كثافة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على قطر الثقب واسعة بما يكفي لجمع الصور في الوقت المناسب، حيث بلغ متوسطها إلى 4 مجموعات. وينبغي دائما أن يتم تعيين الفاصل الزمني Z لبعد المسافة المثلى المقترحة لقطر الثقب. القيام بمسح قصيرة (المتوسط ​​= 1) مع إعدادات مختلفة، واستخدام الحد الأدنى من كثافة الليزر الذي يحقق الدقة المطلوبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل التجربة لمدة من الوقت المطلوب. بعد ذلك، وإزالة الجنين من مرحلة ساخنة وفصل ببطء لل coverslips. يغرق ساترة والجنين في EM في 30 ملم طبق بيتري. باستخدام ماصة الزجاج غسل بلطف الجنين الخروج من ساترة وإزالة ساترة من طبق بيتري. وضع الجنين في الحاضنة 28.5 درجة مئوية إلى مواصلة تطوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن النمو. في نهاية التجربة، واتخاذ الفردية زينب صالحوأثيرت الصور تك الأجنة الأخوة محمولة الاغاروز التي نظمت على غرار العينة في بداية التجربة، ولكن في EM في حاضنة 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الأقواس البلعومية، حسب الحاجة. قياسات لا يمكن أن يؤديها في بعض الأجنحة البرمجيات متحد البؤر. أجريت القياسات وجدت هنا باستخدام Fiji25 عن طريق استيراد وZ-إسقاط الملفات. LSM من الأطر الفردية. </li></ol>

<ol>
	<li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution.">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly.">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li><li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia.">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm.">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li><li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes.">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li><li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function.">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3 (1996).</li><li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs.">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li><li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton.">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li><li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors.">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li><li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signalling+in+craniofacial+development.">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li><li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton.">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li><li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton.">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li><li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis.">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites.">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li><li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells.">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li><li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells.">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li><li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+A+(pdgf-a)+expression+during+zebrafish+embryonic+development.">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches.">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533 (2013).</li><li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation.">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li><li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning.">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر هو أداة قوية لتحليل التنمية. هنا، علينا أن نظهر فائدة الأسلوب في دراسة البلعوم القوس التشكل في الزرد التي هي متحولة لمسارات الإشارات الهامة باستخدام الخلايا المعدلة وراثيا التي تصف قمة العصبية. بالإضافة إلى مستوى الأنسجة التحليل?...

التشكل القحفي معقدة عملية متعددة الخطوات التي تتطلب التفاعلات المنسقة بين أنواع خلايا متعددة. مشتق غالبية الهيكل العظمي القحفي من الخلايا العصبية قمة، وكثير منها يجب أن يهاجر من الظهرية الأنبوب العصبي في الهياكل عابرة يسمى الأقواس البلعومية 1. كما هو الحال مع العديد من الأنسجة، التشكل من الهيكل العظمي القحفي هو أكثر تعقيدا مما يمكن أن يكون مفهوما من قبل صور ثابتة الأجنة في نقاط محددة الوقت التنموية. على الرغم من أنها لأداء تستغرق وقتا طويلا، ويوفر في الجسم الحي الوقت الفاصل بين المجهري نظرة المستمر في الخلايا والأنسجة الجنين النامي. كل صورة في سلسلة الوقت الفاصل بين يقرض السياق إلى الآخرين، ويساعد تحرك المحقق نحو استنتاج سبب حدوث ظاهرة بدلا من استنتاج ما يحدث في ذلك الوقت. في الجسم الحي التصوير هو بالتالي أداة قوية لنهج وصفي التجريبية لتفكيك مسارات التي توجه التشكل. ودانيو rerio الزرد هو نموذج الجيني شعبية من التطور الجنيني الفقاريات، وبشكل خاص مناسبة تماما لفي الجسم الحي التصوير من التشكل. الحديثة، وأساليب مريحة لنقل الجينات والتعديل الجيني تتقدم بسرعة عدد الأدوات المتاحة للباحثين الزرد. هذه الأدوات تحسين أساليب قوية بالفعل للتلاعب الجيني والمجهري. في الجسم الحي التصوير من النسيج تقريبا أي في أي سياق الوراثية المطلوب تقريبا هو اقرب الى الواقع من الخيال. وتسترشد الحركات التخلق من الأقواس البلعومية بواسطة إشارات التفاعلات بين قمة العصبية وظهائر المجاورة، سواء الأديم الظاهر الأديم الباطن و. هناك العديد من الجزيئات يشير أعرب عنها ظهائر والتي هي ضرورية لدفع التشكل من عناصر الهيكل العظمي القحفي. بين هذه الجزيئات يشير، سونيك القنفذ (شش) هو و أهمية حاسمةأو تطوير القحفي 2-8. وأعرب عن شش كل من الأديم الظاهر الأديم الباطن الفم والبلعوم 2،6،9،10. التعبير عن شش في الأديم الباطن ينظم الحركات التخلق من الأقواس 10، الزخرفة من قمة العصبية داخل الأقواس 10، ونمو الهيكل العظمي القحفي 11. BMP يشير أيضا أهمية حاسمة للتنمية القحفي 12، ويمكن تغيير التشكل من الأقواس البلعومية. BMP إشارات ينظم ظهري / بطني الزخرفة من قمة داخل الأقواس البلعومية 13،14. تعطل smad5 في الزرد يسبب تشوهات الحنك الشديد وفشل الغضاريف وميكل لتندمج بشكل مناسب في خط الوسط 15. بالإضافة إلى ذلك، عرض المسوخ أيضا تخفيضات والانصهار في العناصر الغضروف بطني، مع الثانية 2، 3 الثالثة، وأحيانا عناصر ال 4 البلعوم القوس تنصهر في خط الوسط 15. هذه اندماج توحي بقوة تلك BMP إشارات يوجه التشكل من هذه العناصر البلعوم. PDGF إشارات ضرورية للتنمية القحفي، ولكن لديها أدوار معروفة في البلعوم القوس التشكل. كلا الماوس والمسوخ Pdgfra الزرد ديك عميقة clefting midfacial 16-18. على الأقل في الزرد ويرجع ذلك إلى فشل السليم الهجرة الخلية قمة العصبية 16 هذا clefting midfacial. تستمر الخلايا العصبية للتعبير عن قمة pdgfra بعد أن تكون قد دخلت الأقواس البلعومية. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير بروابط PDGF بواسطة ظهائر الوجه وداخل الأقواس البلعومية 16،19،20، وبالتالي PDGF الإشارات ويمكن أيضا أن تلعب دورا في التشكل من الأقواس البلعومية التالية الهجرة. ومع ذلك، يحلل من التشكل من الأقواس البلعومية في المسوخ pdgfra لم يتم تنفيذها. هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي المجهري متحد البؤر من pharyngulمرحلة-الزرد المعدلة وراثيا ووصف التشكل من الأقواس البلعومية خلال هذه الفترة. نحن كذلك إظهار السلوكيات الأنسجة التي تتأثر الطفرات التي تعطل BMP و PDGF، وشش مسارات الإشارات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

الوقت الفاصل بين التصوير هو الاسلوب الذي يسمح لمراقبة مباشرة لعملية التشكل، أو جيل من الشكل. بسبب درجة وضوحها البصرية وقابليته للتلاعب الجيني، أصبح الجنين الزرد كائن نموذج شعبية مع الذي لإجراء تحليل الوقت الفاصل بين التشكل في الأجنة الحية. التصوير متحد البؤر من جنين الزرد الحية يتطلب أن الأنسجة من الاهتمام هو المسمى باستمرار مع علامة فلوري، مثل التحوير أو صبغ حقن. يطالب العملية أن الجنين هو تخدير والذي عقد في مكان في مثل هذه الطريقة التي التنمية الصحية العائدات بشكل طبيعي. يجب أن يتم تعيين المعلمات من أجل التصوير لحساب نمو ثلاثي الأبعاد، وتحقيق التوازن بين مطالب حل الخلايا الفردية حين الحصول على لقطات سريعة من التنمية. نتائجنا تثبت القدرة على أداء على المدى الطويل في مجال التصوير المجراة من الأجنة الزرد المسمى مضان وللكشف عن السلوكيات الأنسجة المتنوعة فيقمة الجمجمة العصبية التي تسبب تشوهات القحفي. تأخر في النمو الناجمة عن التخدير وتركيب هي الحد الأدنى، والأجنة دون أن يمسهم سوء من قبل العملية. يمكن إرجاع الأجنة الوقت الفاصل بين تصوير والمتوسطة السائل وبعد ذلك تصويرها أو ثابتة في نقطة لاحقة في عملية التنمية. مع وفرة متزايدة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا ورسم الخرائط مصير تتميز جيدا وتقنيات زرع، والتصوير أي نوع من الأنسجة المطلوب هو ممكن. على هذا النحو، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي يجمع بقوة مع الأساليب الوراثية الزرد، بما في ذلك تحليل الأجنة متحولة وmicroinjected.

في البرية من نوع الأجنة بعد السكان قمة العصبية، الأقواس البلعومية استطال على طول الأمامي / الخلفي وظهري / بطني محاور بينما تتحرك في اتجاه منقاري (فيلم 1). في 30 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، وطول الأمامي / الخلفي من أول القوس البلعومية ما بين 1،8-1،9 مرات ظهري / بطني ذروته. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy at JoVE.com

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  The University of Texas at Austin.  الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة. 

Video: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

تصور بنية العقدة الليمفاوية وتوطين الخلايا باستخدام الفحص المجهري السابق فيفيفو

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...