Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. إعداد حلول وسحبت زجاج إبرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 25X الأسهم من تريكين (3-أمينو حمض البنزويك إيثيل استر، وتسمى أيضا إيثيل 3-أمينوبنزوات) في 4 ملغ / مل في 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.8 و تحقيق ذلك الحل هو في درجة الحموضة 7. قسامة من 4 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: تريكين مخدر يعمل بشكل تفضيلي على قنوات الصوديوم الجهد بوابات العصبية وبالتالي عرقلة ارتعاش العضلات وحركة 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل العاملة من تريكين بتركيز نهائي من 0.17 ملغ / مل في E3 الجنين المتوسطة. 7 ملاحظة: أجعل تريكين حل العمل بشكل إرتجالي مثل الرقم الهيدروجيني لهذا الحل الانجرافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل نقطة انصهار منخفضة agarose إلى تركيز النهائي من 1.5٪ في E3 المتوسطة الجنين في أنبوب 50 مل عن طريق تسخين الحل في الميكروويف. السماح لهذا الحل تتوازن إلى 42-45 درجة مئوية في أي حمام مائي أو مقعد بين كبار الحاضنة. إذا إعداد أطباق كبيرة لالرأسيضوء ورقة التصوير (الخطوة 4)، وجعل على 25 مل إضافية من ذوبان قياسي 1٪ الاغاروز في E3 الجنين المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج البورسليكات مع الشعيرات الدموية خيوط مع أبعاد OD 1.20 مم، الرقم 0.69 ملم، وطول 10 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم سحب الشعيرات الدموية على نوع من التدفئة خيوط إبرة مجتذب موضح في الجدول من المعدات والكواشف، واستخدام الإعدادات التالية: الحرارة 600، سحب 120، السرعة 50، الوقت 225، 500. الضغط مع زوج من الملقط حادة، وكسر الإبرة الماضي فقط النقطة التي تنثني لإنشاء إبرة نظيفة وحادة لويوجه الأجنة وإزالة الاغاروز الزائد. ويمكن أيضا مشرط الصغير أن تستخدم لإزالة الاغاروز الزائد. </li></ol> 2. تضمين الأجنة لمقلوب أو المجهر تستقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة تصل إلى مرحلة مناسبة في E3 الجنين المتوسطة. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المرحلة المطلوبة والأجنة dechorionate مع زوج من الملقط حادة تحتها dissec مجهرتينغ المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة dechorionated لمدة 5 دقائق على الأقل في العمل الحل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يبرد الحل الاغاروز ذاب إلى 45 درجة مئوية، واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل الأجنة dechorionated مباشرة في أنبوب 50 مل مع نقل الحد الأدنى من E3 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجنين جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 1 مل من تصاعد المتوسطة وإضافة تقريبا. 100 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة جنبا إلى جنب مع الجنين إلى دائرة مركزية من القاع الزجاج طبق بتري 35 ملم مع microwell 10 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو وضع والمتوسطة المتزايدة، نقل الجنين إلى حافة دائرة الاغاروز مع الذيل تواجه الخارج (الشكل 1A). استخدام إبرة الشعرية للحفاظ على الجنين في الاتجاه الأفقي المطلوب حتى يتم تعيين هلام تماما. لصورة الجسم تنمية الخلفي، ورعاية لتوجيه الجنين في مثل الجانبي التوجه وقت ممكن. لذلك، والحفاظ على الجنين في هذا الموقف الذي adjustmen دقيقةنهاية الخبر مع الإبرة الشعرية. ملاحظة: يمكن إضافة أجنة متعددة إلى طبق متزايدة في هذه النقطة، إذا لزم الأمر. إذا كان هذا هو الحال، ونقل المنخفضة للذوبان الاغاروز في طبق أولا وإضافة الأجنة إلى وسط انخفاض الاغاروز. ثم، ودفع الأجنة إلى حواف من الحلبة الزجاج وتوجيه في الموضع المطلوب. ما يصل الى ستة أجنة يمكن تركيبه على هذا النحو قبل الاغاروز يصبح طدت. </li></ol> 3. إزالة الزائدة الاغاروز في جميع أنحاء الجسم الخلفي ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء الذي يتم إزالة الاغاروز من المنطقة المحيطة مؤخرة الجسم. في حالة استطالة مؤخرة الجسم، فمن المهم التأكد من أن الذيل يمكن أن تنمو التدريجي بشكل طبيعي. عن طريق إزالة الاغاروز بعد الجنين قد أدرج تماما من الاغاروز، وتركت المغلقة الجنين من منطقة الرأس وما يقرب من نصف الكيس المحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وضعت قطرة الاغاروز، إغراق بتري ديSH مع الحل العمل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر مجهر تشريح مع ينتقل الضوء قاعدة، وضبط الموقف مرآة وزاوية الضوء الساقط بحيث تباين قوي يسمح للتخفيضات في الاغاروز أن نرى بوضوح من خلال العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء قطع 1 (الشكل 1)، استخدم إبرة الشعرية أو مشرط الصغيرة إلى قطع الأغاروس منتصف الطريق على طول صفار، من موقف الخلفي فقط إلى مجال القلب تشكيل لموقف الجسيدة 5 (الموافق 5 الجسيدة الأمامية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء خفض الأولي المجاور لقلب تشكيل كما هو مبين، والطريقة كاملة من خلال الاغاروز على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفاظ على شعري أو مشرط الدقيقة في أعماق الاغاروز، وببطء شهدت صعودا وهبوطا في حين بدأت اجراء خفض طويل على الجنين كما هو موضح الشكل 1. قطع أقرب إلى الجنين ممكن من دون ثقب الجنين أو صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، جعل التخفيضات 2 و 3 (الشكل 1 </strong&gt;)، بدءا من موقف ضد الجنين ومع قطع السير في هذا الطريق وصولا الى الزجاج قاع الطبق. جعل خفض 2 بحيث يكون عرضية إلى 5 القطع البدنية النمطية الأولى، والسماح لdorsalward كامل تتكشف من مؤخرة الجسم. جعل خفض 3 في زاوية 90 درجة مع سطح الصفار وبدءا من هارتفيلد. ملاحظة: قص الاغاروز حتى حافة الدائرة الزجاج (كما هو موضح في الشكل رقم 1) يساعد في إزالة الاغاروز ككتلة كاملة (الخطوة 3.6). ومع ذلك، هذا ليس ضروريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من تقاطع تخفيضات 1 و 3، وجعل قطع قطري البطيء نحو نهاية قطع 2 في حين رفع ببطء صعودا من أجل إزاحة مربع من الاغاروز المحيطة مؤخرة الجسم. ملاحظات: في بعض الحالات، سيصدر هذا في كتلة واحدة والانتهاء من عملية في آن واحد. وفي حالات أخرى، قد يستغرق عدة محاولات لتضليل تقديم كل الاغاروز التي تحيط بالجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من الملقط حادة، وإزالة ب فكهاخصلات الاغاروز من المتوسط ​​الجنين. للمساعدة في هذه العملية، تحريك القطع الاغاروز إلى جانب الطبق واستخدام جدار طبق بتري عن الدعم في حين رفع من القطع الأغاروس. </li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> الشكل 1: رسم تخطيطي لتركيب المنبثقة تعيين. (A) ويبين الرسم موقف الجنين شنت داخل الحلبة وسط الزجاج طبق بتري. على اليمين هو تقريب الجنين مع كل قطع على التوالي من خلال المحيطة يظهر الاغاروز مع خطوط حمراء dottted. وتخطيطي (ب) الأجنة التي شنت في النظر الجانبي عرض سهولة الوصول لكل الأهداف المقلوب وتستقيم. (ج) وحرفين متتاليين مماثلة تبين كيف يمكن تركيبه الأجنة لالرأسي ورقة الخفيفة التصوير مجموعة عمليات. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">يرجى CL</a>إك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لا يتم حظر ارتعاش العضلات تماما في هذه النقطة، إضافة قطرات من تريكين من محلول المخزون من 4 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 7. </li></ol> 4. تصاعد الأجنة لعمودي ضوء ورقة المجهر ملاحظة: هذا هو الاختلاف على طريقة المبينة أعلاه أن يسمح للوصول لأهداف متعددة للتصوير من العينات التي SPIM الموجه رأسيا. الفكرة من وراء هذا الاختلاف هو رفع عينة أعلى قليلا من أسفل الطبق، للسماح لسهولة الوصول هدفين التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أخذ عينات تصاعد، ومعطف 100 ملم البلاستيك طبق بتري مع 1٪ الاغاروز في E3 المتوسطة على ارتفاع 5 مم والسماح لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطرة من 1 مل-انصهار منخفضة نقطة الاغاروز إلى وسط الطبق والسماح لضبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة تضمينها في ذوبان منخفضة نقطة الاغاروز كما في القسم 2. ومع ذلك، هذه المرة، وإزالة الجنين من الأنبوب 50 ملمن الاغاروز مع انخفاض أصغر من حل (0.5 مل)، ووضع هذه قطرة صغيرة على الجزء العلوي من 1 مل قطرة في وسط الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة الشعرية لوضع الجنين في وسط قطرة صغيرة والحفاظ على التوجه الصحيح حتى يتم تعيين هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات الطبق مع الحل العمل تريكين وإزالة الاغاروز الزائدة كما هو الحال في القسم 3 ولكن من دون قطع طريق وسادة من الاغاروز معيار 1٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وتمكن هذه التقنية المتزايدة الأجنة أن تبقى تزال أثناء نقلها إلى المجهر وعلى المدى الطويل التجارب الوقت الفاصل بين التصوير تستهدف التالية الخلفية استطالة الجسم على مستويات طول متعددة. وعلاوة على ذلك، فمن تنوعا لأنه يتيح للتصوير على حد سواء وتستقيم المقلوب المجهر مج?...

الخلفي الجسم استطالة عملية أساسية في التطور الجنيني الذي الجنين يمتد لتشكيل جزء كبير من محور الجسم. إنه مثال لعملية التخلق المعقدة التي السلوكيات خلايا متعددة تعمل coordinately لتوليد التشكل على مستوى الأنسجة الفردية. هذه التشوهات الأنسجة التفاضلية ثم تعمل معا لتوليد استطالة من مؤخرة الجسم على مستوى الهيكل كله. ولكي نفهم كيف يتم التحكم في هذه العمليات وتنسيقها خلال التنمية، يجب أن تكون قادرة على متابعة هذه العمليات على مستويات متعددة (أي على مستوى الجزيئات والخلايا والسكان والأنسجة الخلية) وربط هذا مباشرة إلى التشكل من هيكل كامل . الأجنة الزرد مثالية للتصوير الخلفي الجسم استطالة كما شفافيتها البصرية وحجم صغير يسمح لتطبيق التصوير ضوء مينيملي نهج مناسبة تماما لليفالبريد التصوير. (1) وقد تجلى ذلك من خلال سلسلة من المنشورات الحديثة التي تسلط الضوء على تطور الجسم الخلفية على مستوى الجزيئات، 2 الخلايا واحد و 3 و بين الأنسجة السلوكيات، 4 وكذلك على مستوى السكان الخلايا والجهاز كله. 5 تقنيات التصوير المتقدمة مثل متحد البؤر، المجهري متعددة الفوتون وطائرة انتقائية إضاءة المجهر (SPIM) وتمكن من التصوير على المدى الطويل من العمليات التنموية مع انخفاض تأثير سمية الخفيفة والصور وتبييض. مطلوبة تقنيات قوية لاقامة عينات حية لتحقيق ثلاثة أهداف: 1) الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر وخلال الاستحواذ، 2) حرية كافية للحركة من العينة للسماح ثمرة المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على جمعة العادياإلمنائية، وأخيرا 3) درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هذا البروتوكول يدخل تقنية متزايدة لتصوير تطوير الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، في حين ترك المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. على هذا النحو، بل هو أيضا وسيلة مناسبة للتصوير على المدى الطويل من مناطق أخرى من الجسم النامية في الاغاروز يمكن التصوير من خلال تقنيات ضوء التصوير القياسية. هذا البروتوكول يوضح تصاعد الأجنة في اتجاه جانبي، على الرغم من أنه من الممكن أيضا إلى جبل الأجنة في توجهاتها بديل. وسوف تظهر كذلك كيف للتكيف مع أسلوب الاجهزة المجهر الخفيفة ورقة تستقيم، مقلوب والرأسية.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

الأجنة الزرد توفر نظام تجريبي مثالي لدراسة عمليات التخلق معقدة نظرا لسهولة الوصول من والشفافية البصرية. على وجه الخصوص، واستطالة مؤخرة الجسم هي عملية أساسية في التطور الجنيني الذي تشوهات الأنسجة متعددة تعمل معا لتوجيه تشكيل جزء كبير من محور الجسم. من أجل مراقبة هذه العملية على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الضروري الاستفادة من تقنية متزايدة على أن يسمح الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر والاستحواذ. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصاعد أيضا توفير حرية كافية الحركة للنمو في المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على تطورها الطبيعي. وأخيرا، يجب أن يكون هناك درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هنا، نقدم تقنية متزايدة لتصوير تطوير الخلفي الجسم elongatioن في الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، بينما تترك خارج المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. سوف نظهر كيف يمكن تكييفها لتستقيم، مقلوب والرأسي للضوء ورقة المجهر مجموعة عمليات. في حين يركز هذا البروتوكول على تصاعد الأجنة للتصوير لمؤخرة الجسم، ويمكن بسهولة أن تتكيف لتصوير حي من جوانب متعددة للتنمية الزرد.

بروتوكول المبينة أعلاه تفاصيل تقنية تنوعا لاقامة الأجنة الزرد على المدى الطويل التصوير الفاصل الزمني. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2A وفي الرسوم المتحركة / فيديو الشكل 1. تم حقن الأجنة في مرحلة 1 خلية مع مرنا ترميز بروتين فلوري photoconvertib...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biology

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

تحليل انقباض قلب الزرد مع تفاعل الواقع الافتراضي

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

تسليط الضوء على المؤلف: عالية الدقة 4D ضوء ورقة التصوير والواقع الافتراضي في الزرد لتحليل خلية واحدة من وظائف القلب

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Bioengineering

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد