Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. إعداد حلول وسحبت زجاج إبرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 25X الأسهم من تريكين (3-أمينو حمض البنزويك إيثيل استر، وتسمى أيضا إيثيل 3-أمينوبنزوات) في 4 ملغ / مل في 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.8 و تحقيق ذلك الحل هو في درجة الحموضة 7. قسامة من 4 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: تريكين مخدر يعمل بشكل تفضيلي على قنوات الصوديوم الجهد بوابات العصبية وبالتالي عرقلة ارتعاش العضلات وحركة 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل العاملة من تريكين بتركيز نهائي من 0.17 ملغ / مل في E3 الجنين المتوسطة. 7 ملاحظة: أجعل تريكين حل العمل بشكل إرتجالي مثل الرقم الهيدروجيني لهذا الحل الانجرافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل نقطة انصهار منخفضة agarose إلى تركيز النهائي من 1.5٪ في E3 المتوسطة الجنين في أنبوب 50 مل عن طريق تسخين الحل في الميكروويف. السماح لهذا الحل تتوازن إلى 42-45 درجة مئوية في أي حمام مائي أو مقعد بين كبار الحاضنة. إذا إعداد أطباق كبيرة لالرأسيضوء ورقة التصوير (الخطوة 4)، وجعل على 25 مل إضافية من ذوبان قياسي 1٪ الاغاروز في E3 الجنين المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج البورسليكات مع الشعيرات الدموية خيوط مع أبعاد OD 1.20 مم، الرقم 0.69 ملم، وطول 10 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم سحب الشعيرات الدموية على نوع من التدفئة خيوط إبرة مجتذب موضح في الجدول من المعدات والكواشف، واستخدام الإعدادات التالية: الحرارة 600، سحب 120، السرعة 50، الوقت 225، 500. الضغط مع زوج من الملقط حادة، وكسر الإبرة الماضي فقط النقطة التي تنثني لإنشاء إبرة نظيفة وحادة لويوجه الأجنة وإزالة الاغاروز الزائد. ويمكن أيضا مشرط الصغير أن تستخدم لإزالة الاغاروز الزائد. </li></ol> 2. تضمين الأجنة لمقلوب أو المجهر تستقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة تصل إلى مرحلة مناسبة في E3 الجنين المتوسطة. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المرحلة المطلوبة والأجنة dechorionate مع زوج من الملقط حادة تحتها dissec مجهرتينغ المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة dechorionated لمدة 5 دقائق على الأقل في العمل الحل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يبرد الحل الاغاروز ذاب إلى 45 درجة مئوية، واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل الأجنة dechorionated مباشرة في أنبوب 50 مل مع نقل الحد الأدنى من E3 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجنين جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 1 مل من تصاعد المتوسطة وإضافة تقريبا. 100 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة جنبا إلى جنب مع الجنين إلى دائرة مركزية من القاع الزجاج طبق بتري 35 ملم مع microwell 10 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو وضع والمتوسطة المتزايدة، نقل الجنين إلى حافة دائرة الاغاروز مع الذيل تواجه الخارج (الشكل 1A). استخدام إبرة الشعرية للحفاظ على الجنين في الاتجاه الأفقي المطلوب حتى يتم تعيين هلام تماما. لصورة الجسم تنمية الخلفي، ورعاية لتوجيه الجنين في مثل الجانبي التوجه وقت ممكن. لذلك، والحفاظ على الجنين في هذا الموقف الذي adjustmen دقيقةنهاية الخبر مع الإبرة الشعرية. ملاحظة: يمكن إضافة أجنة متعددة إلى طبق متزايدة في هذه النقطة، إذا لزم الأمر. إذا كان هذا هو الحال، ونقل المنخفضة للذوبان الاغاروز في طبق أولا وإضافة الأجنة إلى وسط انخفاض الاغاروز. ثم، ودفع الأجنة إلى حواف من الحلبة الزجاج وتوجيه في الموضع المطلوب. ما يصل الى ستة أجنة يمكن تركيبه على هذا النحو قبل الاغاروز يصبح طدت. </li></ol> 3. إزالة الزائدة الاغاروز في جميع أنحاء الجسم الخلفي ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء الذي يتم إزالة الاغاروز من المنطقة المحيطة مؤخرة الجسم. في حالة استطالة مؤخرة الجسم، فمن المهم التأكد من أن الذيل يمكن أن تنمو التدريجي بشكل طبيعي. عن طريق إزالة الاغاروز بعد الجنين قد أدرج تماما من الاغاروز، وتركت المغلقة الجنين من منطقة الرأس وما يقرب من نصف الكيس المحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وضعت قطرة الاغاروز، إغراق بتري ديSH مع الحل العمل تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر مجهر تشريح مع ينتقل الضوء قاعدة، وضبط الموقف مرآة وزاوية الضوء الساقط بحيث تباين قوي يسمح للتخفيضات في الاغاروز أن نرى بوضوح من خلال العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء قطع 1 (الشكل 1)، استخدم إبرة الشعرية أو مشرط الصغيرة إلى قطع الأغاروس منتصف الطريق على طول صفار، من موقف الخلفي فقط إلى مجال القلب تشكيل لموقف الجسيدة 5 (الموافق 5 الجسيدة الأمامية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء خفض الأولي المجاور لقلب تشكيل كما هو مبين، والطريقة كاملة من خلال الاغاروز على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفاظ على شعري أو مشرط الدقيقة في أعماق الاغاروز، وببطء شهدت صعودا وهبوطا في حين بدأت اجراء خفض طويل على الجنين كما هو موضح الشكل 1. قطع أقرب إلى الجنين ممكن من دون ثقب الجنين أو صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، جعل التخفيضات 2 و 3 (الشكل 1 </strong&gt;)، بدءا من موقف ضد الجنين ومع قطع السير في هذا الطريق وصولا الى الزجاج قاع الطبق. جعل خفض 2 بحيث يكون عرضية إلى 5 القطع البدنية النمطية الأولى، والسماح لdorsalward كامل تتكشف من مؤخرة الجسم. جعل خفض 3 في زاوية 90 درجة مع سطح الصفار وبدءا من هارتفيلد. ملاحظة: قص الاغاروز حتى حافة الدائرة الزجاج (كما هو موضح في الشكل رقم 1) يساعد في إزالة الاغاروز ككتلة كاملة (الخطوة 3.6). ومع ذلك، هذا ليس ضروريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من تقاطع تخفيضات 1 و 3، وجعل قطع قطري البطيء نحو نهاية قطع 2 في حين رفع ببطء صعودا من أجل إزاحة مربع من الاغاروز المحيطة مؤخرة الجسم. ملاحظات: في بعض الحالات، سيصدر هذا في كتلة واحدة والانتهاء من عملية في آن واحد. وفي حالات أخرى، قد يستغرق عدة محاولات لتضليل تقديم كل الاغاروز التي تحيط بالجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من الملقط حادة، وإزالة ب فكهاخصلات الاغاروز من المتوسط ​​الجنين. للمساعدة في هذه العملية، تحريك القطع الاغاروز إلى جانب الطبق واستخدام جدار طبق بتري عن الدعم في حين رفع من القطع الأغاروس. </li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> الشكل 1: رسم تخطيطي لتركيب المنبثقة تعيين. (A) ويبين الرسم موقف الجنين شنت داخل الحلبة وسط الزجاج طبق بتري. على اليمين هو تقريب الجنين مع كل قطع على التوالي من خلال المحيطة يظهر الاغاروز مع خطوط حمراء dottted. وتخطيطي (ب) الأجنة التي شنت في النظر الجانبي عرض سهولة الوصول لكل الأهداف المقلوب وتستقيم. (ج) وحرفين متتاليين مماثلة تبين كيف يمكن تركيبه الأجنة لالرأسي ورقة الخفيفة التصوير مجموعة عمليات. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">يرجى CL</a>إك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لا يتم حظر ارتعاش العضلات تماما في هذه النقطة، إضافة قطرات من تريكين من محلول المخزون من 4 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 7. </li></ol> 4. تصاعد الأجنة لعمودي ضوء ورقة المجهر ملاحظة: هذا هو الاختلاف على طريقة المبينة أعلاه أن يسمح للوصول لأهداف متعددة للتصوير من العينات التي SPIM الموجه رأسيا. الفكرة من وراء هذا الاختلاف هو رفع عينة أعلى قليلا من أسفل الطبق، للسماح لسهولة الوصول هدفين التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أخذ عينات تصاعد، ومعطف 100 ملم البلاستيك طبق بتري مع 1٪ الاغاروز في E3 المتوسطة على ارتفاع 5 مم والسماح لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطرة من 1 مل-انصهار منخفضة نقطة الاغاروز إلى وسط الطبق والسماح لضبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة تضمينها في ذوبان منخفضة نقطة الاغاروز كما في القسم 2. ومع ذلك، هذه المرة، وإزالة الجنين من الأنبوب 50 ملمن الاغاروز مع انخفاض أصغر من حل (0.5 مل)، ووضع هذه قطرة صغيرة على الجزء العلوي من 1 مل قطرة في وسط الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة الشعرية لوضع الجنين في وسط قطرة صغيرة والحفاظ على التوجه الصحيح حتى يتم تعيين هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات الطبق مع الحل العمل تريكين وإزالة الاغاروز الزائدة كما هو الحال في القسم 3 ولكن من دون قطع طريق وسادة من الاغاروز معيار 1٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وتمكن هذه التقنية المتزايدة الأجنة أن تبقى تزال أثناء نقلها إلى المجهر وعلى المدى الطويل التجارب الوقت الفاصل بين التصوير تستهدف التالية الخلفية استطالة الجسم على مستويات طول متعددة. وعلاوة على ذلك، فمن تنوعا لأنه يتيح للتصوير على حد سواء وتستقيم المقلوب المجهر مج?...

الخلفي الجسم استطالة عملية أساسية في التطور الجنيني الذي الجنين يمتد لتشكيل جزء كبير من محور الجسم. إنه مثال لعملية التخلق المعقدة التي السلوكيات خلايا متعددة تعمل coordinately لتوليد التشكل على مستوى الأنسجة الفردية. هذه التشوهات الأنسجة التفاضلية ثم تعمل معا لتوليد استطالة من مؤخرة الجسم على مستوى الهيكل كله. ولكي نفهم كيف يتم التحكم في هذه العمليات وتنسيقها خلال التنمية، يجب أن تكون قادرة على متابعة هذه العمليات على مستويات متعددة (أي على مستوى الجزيئات والخلايا والسكان والأنسجة الخلية) وربط هذا مباشرة إلى التشكل من هيكل كامل . الأجنة الزرد مثالية للتصوير الخلفي الجسم استطالة كما شفافيتها البصرية وحجم صغير يسمح لتطبيق التصوير ضوء مينيملي نهج مناسبة تماما لليفالبريد التصوير. (1) وقد تجلى ذلك من خلال سلسلة من المنشورات الحديثة التي تسلط الضوء على تطور الجسم الخلفية على مستوى الجزيئات، 2 الخلايا واحد و 3 و بين الأنسجة السلوكيات، 4 وكذلك على مستوى السكان الخلايا والجهاز كله. 5 تقنيات التصوير المتقدمة مثل متحد البؤر، المجهري متعددة الفوتون وطائرة انتقائية إضاءة المجهر (SPIM) وتمكن من التصوير على المدى الطويل من العمليات التنموية مع انخفاض تأثير سمية الخفيفة والصور وتبييض. مطلوبة تقنيات قوية لاقامة عينات حية لتحقيق ثلاثة أهداف: 1) الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر وخلال الاستحواذ، 2) حرية كافية للحركة من العينة للسماح ثمرة المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على جمعة العادياإلمنائية، وأخيرا 3) درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هذا البروتوكول يدخل تقنية متزايدة لتصوير تطوير الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، في حين ترك المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. على هذا النحو، بل هو أيضا وسيلة مناسبة للتصوير على المدى الطويل من مناطق أخرى من الجسم النامية في الاغاروز يمكن التصوير من خلال تقنيات ضوء التصوير القياسية. هذا البروتوكول يوضح تصاعد الأجنة في اتجاه جانبي، على الرغم من أنه من الممكن أيضا إلى جبل الأجنة في توجهاتها بديل. وسوف تظهر كذلك كيف للتكيف مع أسلوب الاجهزة المجهر الخفيفة ورقة تستقيم، مقلوب والرأسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35-1.5-10-C</td>
			<td>35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td>&#160;Sutter&#160;</td>
			<td>BF 120-94-10</td>
			<td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>P-715</td>
			<td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps&#160;</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&#160;</td>
			<td>11252-30&#160;</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller&#160;</td>
			<td>Sutter&#160;</td>
			<td>P97</td>
			<td>Heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 Apo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

الأجنة الزرد توفر نظام تجريبي مثالي لدراسة عمليات التخلق معقدة نظرا لسهولة الوصول من والشفافية البصرية. على وجه الخصوص، واستطالة مؤخرة الجسم هي عملية أساسية في التطور الجنيني الذي تشوهات الأنسجة متعددة تعمل معا لتوجيه تشكيل جزء كبير من محور الجسم. من أجل مراقبة هذه العملية على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الضروري الاستفادة من تقنية متزايدة على أن يسمح الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر والاستحواذ. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصاعد أيضا توفير حرية كافية الحركة للنمو في المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على تطورها الطبيعي. وأخيرا، يجب أن يكون هناك درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هنا، نقدم تقنية متزايدة لتصوير تطوير الخلفي الجسم elongatioن في الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، بينما تترك خارج المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. سوف نظهر كيف يمكن تكييفها لتستقيم، مقلوب والرأسي للضوء ورقة المجهر مجموعة عمليات. في حين يركز هذا البروتوكول على تصاعد الأجنة للتصوير لمؤخرة الجسم، ويمكن بسهولة أن تتكيف لتصوير حي من جوانب متعددة للتنمية الزرد.

بروتوكول المبينة أعلاه تفاصيل تقنية تنوعا لاقامة الأجنة الزرد على المدى الطويل التصوير الفاصل الزمني. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2A وفي الرسوم المتحركة / فيديو الشكل 1. تم حقن الأجنة في مرحلة 1 خلية مع مرنا ترميز بروتين فلوري photoconvertib...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development at JoVE.com

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

والمغمورة ساندويتش ورقة مرشح للالمدى الطويل<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; الوقت الفاصل بين التصوير من وقت مبكر الفرخ الأجنة

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

تطوير نموذج عدوى حمار وحشي لـ Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video