فهمنا لمورفوجينيسين العين يأتي من دراسات الأنسجة الثابتة السابقة. ومع ذلك، افتقرت هذه الدراسات إلى ديناميكيات الخلايا والأنسجة. باستخدام التصوير الفاصل الزمني ، نحن قادرون على التقاط هذه العملية بأكملها للتصور والتحليل.
طريقتنا التي تستفيد من التطور الخارجي في الوضوح البصري للأجنة حمار وحشي، والتي تسهل التصوير الحي، ويستخدم الليزر المسح المجهري confocal الذي يتوفر بسهولة في معظم الجامعات البحوث. يجب أن يتوقع الباحثون الجدد في هذه الطريقة بعض التجربة والخطأ قبل الحصول على مجموعة بيانات قابلة للاستخدام. العديد من الخطوات، وخاصة الحقن والتضمين، يجب أن تسير على ما يرام من أجل النجاح، لذلك التحلي بالصبر.
بمجرد أن تبدأ سمكة الحمار الوحشي في التكاثر ، أثناء الانتظار من 15 إلى 20 دقيقة لضمان أن تصبح البويضات مخصبة ، استخدم نصائح P10 pipette و P10 microliter لتحميل إبرة حقن صغيرة زجاجية مسلوة مع 2.5 إلى 5 ميكرولتر من تخفيف الفائدة من الحمض النووي الريبي. عندما يكون البيض جاهزا، استخدم ماصة نقل ومجهر تشريح لتحميل البويضات بعناية في قالب الحقن، وذلك باستخدام ملقط للفة الأجنة بحيث تكون الخلية الواحدة مرئية عند الضرورة. ثم حقن جميع الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة ، واستهداف الخلية وليس صفار لضمان وضع علامات موحدة للجنين النامي.
في حوالي 11 ساعة بعد الإخصاب، ضع a aliquot 1-5 ملليلتر من 1.6٪ منخفضة ذوبان agarose في E3 المتوسطة في كتلة الحرارة 42 درجة مئوية واستخدام المجهر الفلوري لفحص الأجنة حقن بنجاح مع سطوع الشاملة من فلوريسسينس. عد السخامات لمرحلة بشكل صحيح الأجنة. في 11 ساعة بعد الإخصاب، ينبغي ملاحظة ثلاث صواميات.
عينة مثالية سيكون لها إشارات EGFP و mCherry قوية وتكون في مرحلة النمو الصحيح. قبل التركيب، ضع الأجنة في طبق مغلف بالأجار واستخدم ملقط لإزالة الكورون من كل جنين. عندما يتم تلطيخ جميع الأجنة، استخدم ماصة بكرة زجاجية لتنشق جنين واحد.
إخراج أكبر قدر ممكن من E3 بحيث يجلس الجنين في غيض من ماصة باستور الزجاج وإسقاط الجنين في أنبوب الآغاروز من كتلة الحرارة. دع الأجنة تغرق في الآغروز لبضع ثوان قبل أن تقرصن كمية صغيرة من الآغروز جنبا إلى جنب مع الجنين ، مع الحرص على أن الجنين لا يزال في غيض من المصصة. إخراج الجنين وأغاروز في قطرة agarose في طبق أسفل الزجاج وبسرعة ولكن بعناية استخدام ملقط لتوجيه الجانب الظهري الجنين إلى أسفل قبل أن تصلب قطرة الآغاروز.
بعد تركيب 10 إلى 12 جنينا بنفس الطريقة ، أضف ما يكفي من الآغروز لتغطية الجزء السفلي تماما من الطبق الذي يغطي جميع القطرات في قرص agarose واحد. عندما تصلب agarose، طبقة E3 على الآغاروز للحفاظ على عينات رطب. بعد وضع المجهر confocal المسح بالليزر إلى المعلمات المناسبة للتصوير الفاصل الزمني، معطف بتحرر الجانب السفلي من طبق أسفل الزجاج مع متوسط الغمر مطابقة مؤشر الانكسار من الماء، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء، وتطبيق قطرة صغيرة من الغمر المتوسطة لهدف المياه 40X.
تأمين طبق أسفل الزجاج في مرحلة إدراج وإضافة إضافية E3 المتوسطة للحفاظ على الأجنة رطبة بين عشية وضحاها. استخدام الطين النمذجة لختم الغطاء البلاستيكي على الطبق ورفع الهدف لإجراء اتصال مع الطبق. تحت عنوان المواضع لبرنامج المجهر، انقر فوق إضافة لحفظ معلومات XYZ للعينة الأولى التي انقضت من الزمن وحدد عينة مزودة بفلورة قوية وتركيب أمثل.
ضمن علامة التبويب تحديد موقع البحث عن العينة التالية ثم انقر فوق موضع وإضافة لتحديد العينة كما هو موضح. عند تحديد كافة العينات، قم بتمييز الموضع الأول وانقر فوق الانتقال إلى. أثناء المسح الضوئي باستمرار ، اصطف الحويكل البصري داخل الإطار ، تاركا مساحة واسعة في المناطق الأمامية وال البعيدة بالنسبة للحواس البصري والدماغ.
لتعيين شرائح Z الأولى والأخيرة، حدد المجموعة الأولى والمجموعة الأخيرة أثناء التحرك عبر اتجاه Z مع مقبض التركيز الدقيق، مع الحفاظ على إجمالي عدد الشرائح من حوالي 63 لاستيعاب نمو الكأس البصري. وتشمل مساحة إضافية على الجانب البطني من الحويصرة البصرية للسماح مجالا للنمو. بمجرد تعيين شرائح Z الأولى والأخيرة، انقر فوق C للانتقال إلى مركز المكدس Z وضبط قوة الليزر وكسب لكل من أشعة الليزر.
عند تعيين طاقة الليزر وكسبه، أوقف المسح الضوئي وانقر فوق التحديث لتحديث معلومات الموضع. للانتقال إلى الموضع التالي، انقر فوق الموضع الثاني. بمجرد أن يتم تعريف كل من شرائح Z الأولى والأخيرة كما هو موضح، افتح عنوان السلسلة الزمنية وحدد عدد الدورات إلى 300 والفاصل الزمني إلى 2.5 دقيقة.
بعد مراجعة الإعدادات للتأكد من الانتهاء من كل شيء، انقر فوق البدء لبدء الفاصل الزمني وتأكد من أن الجولة الأولى من التصوير يتم التقاطها بشكل صحيح قبل السماح بانتهاء الوقت بين عشية وضحاها. الحقن المباشر في خلية واحدة ضروري لوسم موحدة وفلورسينس قوية. عند غمرها في الآجروز ، يجب أن تكون الأجنة متباعدة بالتساوي في جميع أنحاء الطبق.
إذا تم تنظيم الأجنة بشكل صحيح ، فلورية بما فيه الكفاية ومثبتة بشكل كاف ، فإنها ستبقى في إطار التصوير خلال الفاصل الزمني ، مما يسمح بتصوير العضو بأكمله. العينات التي لا توجه على طول المحور الظهري، مثل تلك التي هي أفقية أو قطرية، سوف تنمو من إطار التصوير مع تقدم الفاصل الزمني ولا يمكن استخدامها لمزيد من التحليل. الجنين الذي يتم الإفراط في تدويره سيؤدي إلى مزيد من الفاصل الزمني الخلفي.
الجنين الذي هو تحت الدورية سوف تسمح فقط الأنسجة الأمامية الأكثر أن يلاحظ. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العينات التي يتم تركيبها فيما يتعلق بتوجه الإطار من المرجح أن تسفر عن مرور زمني ناجح. يوفر هذا التحيز نحو الجانب البطني مساحة إضافية لنمو الأنسجة في الاتجاه البطني مما يؤدي إلى مرور الوقت الأمثل.
وعندما لا يتم استيفاء هذه المعايير، لن يلتقط الفاصل الزمني الحجم ثلاثي الأبعاد للأنسجة بالكامل أثناء تطوره ولا يمكن استخدامه لإجراء مزيد من التحليل. يمكن تحليل مجموعات البيانات الغنية بالمعلومات هذه بطرق عديدة، بما في ذلك تتبع الخلايا رباعية الأبعاد مع سرعة الخلية وقياسات حجم المسار، وقياسات حجم الخلايا والأنسجة، والتصورات ثلاثية و4D.
