نشكر Weixan لو لتقديم المساعدة التقنية في الثقافة والمحافظة على مخزون الخلية Sf9. وأيد LAY من قبل مجلس البحوث الطبية (MRC) studentship الدراسات العليا. كان RJCG زميل أبحاث جامعة الجمعية الملكية. شعبة أكسفورد لعلم الأحياء الهيكلي هو جزء من مركز ويلكوم ترست لعلم الوراثة البشرية، ويلكوم ترست كور جائزة جرانت عدد 090532/Z/09/Z.

<ol>
	<li>Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+of+integrins,+talin,+and+kindlins.">The tail of integrins, talin, and kindlins.</a> Science. 895, 899 (2009).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin+2+forms+a+transcriptional+complex+with+&#946;-catenin+and+TCF4+to+enhance+Wnt+signalling.">Kindlin 2 forms a transcriptional complex with &#946;-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling.</a> EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin+2+promotes+breast+cancer+invasion+via+epigenetic+silencing+of+the+microRNA200+gene+family.">Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.</a> Int J Cancer. , (2013).</li><li>Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kindlin+protein+family:+new+members+to+the+club+of+focal+adhesion+proteins.">The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins.</a> Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).</li><li>Siegel, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+kindlin-1,+a+human+homolog+of+the+Caenorhabditis+elegans+actin-extracellular-matrix+linker+protein+UNC-112,+causes+Kindler+syndrome.">Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).</li><li>Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kindlin+3+PH+domain+has+an+essential+role+in+integrin+LFA-1-mediated+B+cell+adhesion+and+migration.">The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+Kindlin-2+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation.">Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-2+regulates+podocyte+adhesion+and+fibronectin+matrix+deposition+through+interactions+with+phosphoinositides+and+integrins.">Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins.</a> J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).</li><li>Yates, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Characterisation+of+the+Kindlin-1+Pleckstrin+Homology+Domain.">Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).</li><li>Bouaouina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+lipid-binding+loop+in+the+kindlin+FERM+F1+domain+is+required+for+kindlin-mediated+&#945;IIb&#946;3+integrin+coactivation.">A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated &#945;IIb&#946;3 integrin coactivation.</a> J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).</li><li>Goult, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+N-terminus+of+kindlin-1:+a+domain+important+for+AlphaIIbBeta3+integrin+activation.">The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation.</a> J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).</li><li>Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Analysis+of+Kindlin-3+Reveals+an+Elongated+Conformation+and+Maps+Integrin+Binding+to+the+Membrane-Distal+&#946;-Subunit+NPXY+motif.">Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal &#946;-Subunit NPXY motif.</a> J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Campbell, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+of+integrin+activation.">The tail of integrin activation.</a> Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).</li><li>Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-1+and+-2+directly+bind+the+C-terminal+region+of+beta+integrin+cytoplasmic+tails+and+exert+integrin-specific+activation+effects.">Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects.</a> J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).</li><li>Tadokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+binding+to+integrin+beta+tails:+a+final+common+step+in+integrin+activation.">Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation.</a> Science. 302, 103-106 (2003).</li><li>Garcia-Alvarez, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+integrin+recognition+by+talin.">Structural determinants of integrin recognition by talin.</a> Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).</li><li>Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+of+the+N-terminal+ubiquitin-like+domain+of+kindlin-2+is+crucial+for+its+regulation+of+integrin+activation.">Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation.</a> Structure. 19, 1664-1671 (2011).</li><li>Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kindlins:+subcellular+localization+and+expression+during+murine+development.">The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development.</a> Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).</li><li>Bialkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+co-activator+Kindlin-3+is+expressed+and+functional+in+a+non-hematopoietic+cell,+the+endothelial+cell.">The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell.</a> J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).</li><li>Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3+is+essential+for+integrin+activation+and+platelet+aggregation.">Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation.</a> Nat. Med. 14, 325-330 (2008).</li><li>Lefort, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+talin-1+and+kindlin-3+in+LFA-1+extension+and+affinity+regulation.">Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation.</a> Blood. 119, 4275-4282 (2012).</li><li>Moser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3+is+required+for+beta2+integrin-mediated+leukocyte+adhesion+to+endothelial+cells.">Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells.</a> Nat. Med. 15, 300-305 (2009).</li><li>Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption.">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li><li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans.">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. Med. 15, 313-318 (2009).</li><li>Svensson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiency-III+is+caused+by+mutations+in+KINDLIN3+affecting+integrin+activation.">Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation.</a> Nat. Med. 15, 306-312 (2009).</li><li>Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+kindlin-2+PH+domain+reveals+a+conformational+transition+for+its+membrane+anchoring+and+regulation+of+integrin+activation.">Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation.</a> Protein Cell. 3, 434-440 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+kindlin-2+protein+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation.">Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+baculovirus+recombination.">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications.">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J Struct. Biol. 172, 55-65 .</li><li>Wasilko, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).</li><li>Yates, L. A., Fleurd&#233;pine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+activity+of+a+cytoplasmic+RNA+terminal+uridylyl+transferase.">Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).</li><li>Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA,+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain.">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 .</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نظم التعبير الفيروسة العصوية تزداد شعبية وأداة مهمة لإنتاج كميات مليغرام من البروتين المؤتلف لتوصيف البروتين باستخدام الدراسات الفيزيائية الحيوية، بما في ذلك البلورات بالأشعة السينية. على الرغم من كونه تجريبيا تطالب بالمزيد من نظم التعبير الفيروسة العصوية تقدم العديد من المزايا أكثر من E. القولونية واحدة منها هي بيئة شبه الأصلي للبروتينات من أصل حقيقية النواة مثل وجود مرافقين وفرصة للتعديل بعد متعدية المناسبة. في جهودنا للتعبير عن kindlin-3، واستخدمت المضيفين التعبير البديلة بما في ذلك الثدييات خلية خطوط وسلالات بكتيرية التعبير (الملاحظات غير منشورة). عموما، فإن العديد من E. القولونية سلالات اختبار إنتاج كميات صغيرة جدا من المؤتلف kindlin-3 (~ 0.5 ملغ / لتر من الثقافة؛ الملاحظات غير منشورة). ومع ذلك، كان التعبير يحركها الفيروسة العصوية في خلايا الحشرات وفعالة بشكل خاص، بالتعاونmparison في التعبير عابرة في خلايا الثدييات، وأكثر قابلية لتوليد الكتلة الحيوية الكبيرة المطلوبة لعزل ملليغرام من البروتينات المؤتلف هيولي (الملاحظات غير منشورة). نحن التكهن بأن وجود مرافقين حقيقية النواة قد تسمح للكفاءة الإنتاج من kindlin-3. وbaculoviridae تصيب خلايا الحشرات والمؤتلف للتعبير البروتين يستند الفيروسة العصوية المستخدمة في هذا العمل على Autographa californica فيروس polyhedrosis النووية (AcNPV). في طبيعة AcNPV، الذي يصيب Autographa californica (البرسيم lopper) يرقات الحشرات، يتطلب البروتين polyhedrin لتشكيل انسداد حيث يتم تغليف virons في مصفوفة البروتين البلورية وبالتالي توفير الحماية اللازمة للإفراج عنهم. في الخلايا المستزرعة غير مطلوب تشكيل الهيئات انسداد للنسخ المتماثل، وبالتالي يمكن الاستغناء عنها. في حالة التعبير عن البروتينات الأجنبية يمكن أن يكون هذا الجين البروتين polyhedrin صeplaced في AcNPV المؤتلف مع الجين للبروتين من الفائدة. AcNPV يمكن أن تصيب الأنواع الأخرى وLepidopteron لأغراض المؤتلف دودة ورق القطن التعبير البروتين الجيش frugiperda تستخدم خلايا المبيض العذراء. في النهج المذكورة هنا، تم تصميم وbacmid AcNPV (BAC10) بحيث يتم المعطل الجينات الفيروسية الأساسية، ORF1629، من قبل الإدراج من الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز مما أدى إلى bacmid خروج المغلوب (BAC10: KO 1629)، من النوع الذي هو غير قادر على تشكيل baculovirions المعدية 28. Cotransfection خلايا Sf9 مع BAC10 خطي: KO 1629 وFERMT3 المحتوية على نقل متجه للإصلاح ORF1629 غير نشط، من خلال تبديل، مما أدى إلى الجينوم قابلة للحياة التي أدرجت أيضا الجين FERMT3 تحت سيطرة المروج polyhedrin 28. نحن تصف بروتوكول تنقية لعزل الماوس المؤتلف نقية للغاية kindlin-3 عن طريق ثلاث،الخطوة e نهج الكروماتوغرافي. يمكن بسهولة أن تطبق الأساليب المستخدمة هنا إلى غيرها من البروتينات صاحب الموسومة. استخدمناها خطوة التبادل الأيوني لمزيد من تنقية kindlin-3 ولكننا نعتقد أن هذه خطوة أخرى شبه تقارب كما kindlin-3 تمتلك عددا كبيرا من بقايا الأساسية، بما في ذلك امتداد بولي يسين داخل نطاق F1 لها. بالإضافة إلى ذلك، يعتبر kindlin-3 لربط والتفاعل مع مواجهة حشوية من غشاء البلازما، حيث يعمل، وبالتالي نتوقع أن تجميع المخلفات الأساسية سيسمح البروتين لمواجهة غشاء سالبة الشحنة. تعتبر مخازن موضح في البروتوكولات القياسية تنقية وكثيرا ما تستخدم في علم الأحياء الهيكلي. مقايسة thermofluor (الشكل 5) يدل على أن kindlin-3 هو مستقر في معظم الظروف العازلة أعلاه الرقم الهيدروجيني 6.0. وكان هذا مفيدا بشكل خاص ومهم لإعلام تجاربنا عند دراسة kinldin-3: β1وهناك تفاعل الذيل بواسطة الرنين المغناطيسي، والذي أثمر أطياف ممتازة في درجة الحموضة 6.1 مع تركيزات منخفضة من كلوريد الصوديوم 12. قبل أن تتمكن من إجراء أي دراسة الفيزياء الحيوية، فمن المهم لإثبات أن البروتين المنقى من الفائدة هو في الواقع مطوية بشكل صحيح ونشطة وظيفيا. في منشور سابق أثبتنا أن kindlin-3 المؤتلف وأعرب وتنقيته باستخدام هذا الأسلوب كان مونومر وmonodispersed في الحل، وفقا لتقييم اللوني الحجم الاستبعاد، وتشتت الضوء الحيوي، تنبيذ فائق التحليلية والصغيرة زاوية تشتت الأشعة السينية، وكان أيضا قادرة على ربط والاعتراف NPxY غشاء القاصي والمنبع العنقودية سيرين / ثريونين من β 1A ذيول حشوية 14، مما يؤكد أنه يتصرف مثل البروتين الأم، وهو ما يتماشى مع الدراسات الخلوية والفسيولوجية السابقة 14،20،22. استخدام فحص الاستقرار الحراري هو وسيلة إضافية ليوحي عشرسوف البريد لطي السليم للبروتين من الفائدة، والبروتين مطوية بشكل غير صحيح يؤدي إلى خلفية مضان عالية بسبب مخلفات مسعور عرضة للخطر. وكانت عائلة من البروتينات kindlin محط اهتمام الكثير منذ اكتشاف دور غير متوقع على النحو coactivators أساسيا من لل integrins في الجسم الحي. وقد أثار هذا الكثير من الجهد للتعبير عنها recombinantly وحل هياكلها. حتى الآن تم الإبلاغ عن نجاح محدود في التعبير عن كميات مليغرام من كامل طول البروتين المؤتلف ولكن لدينا هنا وصف استخدام نظام الفيروسة العصوية التي تسمح التعبير على نطاق واسع على المستويات حيث أصبحت الدراسات البنيوية الممكنة. عن طريق توليد كميات كبيرة من المؤتلف kindlin-3 ونحن نتوقع أن هذا سوف يساعد المزيد من الدراسات من هذا البروتين. ويمكن أيضا أن طريقة سير العمل وتنقية يحركها الفيروسة العصوية وصفها هنا لالمؤتلف الفئران kindlin-3 يمكن استخدامها للتعبير عن وتنقية الأشكال الإسوية kindlin أخرى، والتي هي أيضا من الصعب للتعبير عن وتمتلك بولي يسين تمتد أيضا، ويمكن تكييفها لمزيد من البروتينات السيتوبلازمية الأخرى، مثل البروتينات ملزمة الحمض النووي، التي تفشل في التعبير عن سلالات بكتيرية.

البروتينات للأسرة kindlin هي عنصر حاسم في التجمع التصاق التنسيق، وبالتالي ضروري للحياة معقدة. Kindlins، التي يوجد منها 3 الإسوية في الثدييات (kindlin-1، kindlin-2، وkindlin-3)، وتعتبر coactivators من المستقبلات لل integrins خارج الخلية إلى جانب تالين 1. إنتغرين بوساطة خلية التصاق يربط سطح الخلية إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) في حقيقيات النوى أعلى. بل هو عملية حاسمة ومشتركة في عدد كبير من الظواهر الفسيولوجية، والتي تشمل سلامة الأنسجة، مرحلة التطور الجنيني، والتمثيل الغذائي العظام، والارقاء، والحصانة. يتم تنشيط بوساطة إنتغرين خلية التصاق من الداخل إلى الخارج عن طريق نقل الإشارة عن طريق الربط من تالين وkindlin إلى إنتغرين β-الوحيدات ذيول هيولي (CTS) في الزخارف NPxY الحفظ الخاصة بهم. أهمية الطب الحيوي للبروتينات kindlin يمتد إلا بقدر النواة، حيث ثبت kindlin-2 في عدة تقارير مؤخرا أن تشارك في النسخآل السيطرة 2،3. Kindlins هي بروتينات متعددة المجالات من ما يقرب من 75 كيلو دالتون، مدموغ من امتلاك آلية سعر الصرف الثابت ثنائية C-محطة (4.1 الفرقة، ezrin، radixin، moesin) المجال الذي يتم مقاطعة من قبل التماثل pleckstrin (PH) النطاق في مركز فرعي F2 ل 4،5. وأظهرت الدراسات من المجالات kindlin-2-3 وkindlin PH أنه يربط رسل الثانية فوسفتيدلينوستول الدهون (3،4،5) trisphosphate وفوسفتيدلينوستول (4،5) bisphosphate 6-8. ومع ذلك، والدراسات في مجال PH kindlin-1 تبين أنه يربط PtdIns (3،4،5) P 3 مع تقارب أقل من ذلك بكثير، والتي يمكن تفسيرها في kindlin-1 عن طريق جسر الملح الإسوي محددة منع الدهون من الربط 9. بالإضافة إلى ذلك، هناك حلقة ~ 100 حمض أميني إدراجها في المجال F1 من kindlins الذي يتوقع أن يتم كشف ولكن بربط فسفاتيديل في النشرة الداخلية للغشاء البلازما 10،11. آلية سعر الصرف الثابت kindlinويعتبر المجال مثلي إلى المجال تالين سعر الصرف الثابت، على الرغم من أن مجال تالين سعر الصرف الثابت لا تملك مجال pleckstrin التماثل. كلا kindlins وتالين التفاعل مع زخارف NPxY على إنتغرين β-ذيول عبر المنطقة F3 المجال سعر الصرف الثابت، ولكن kindlin بربط غشاء عزر البعيدة، في حين يستهدف تالين القريبة غشاء واحد 12-16. Kindlins وتالين على حد سواء بالإضافة تمتلك مجال F0-N محطة مع أمثالها مثل اليوبيكويتين التي لم يتم العثور في البروتينات FERM أخرى 11،17. وقد أظهرت الدراسات على نطاق F0 من kindlin-2 أنه يربط بشكل مستقل لفوسفتيدلينوستول (4،5) bisphosphate الأغشية المخصب 17. وkindlins تظهر الأنسجة أنماط التعبير paralogue محددة والوظائف الفسيولوجية nonredundant. وأعرب عن Kindlin-1 في المقام الأول في البشرة، ولكن أيضا إلى حد أقل في القولون، والمعدة، والكلى؛ وأعرب عن kindlin-2 بتواجد مطلق ولكن تتركز في محززة وسلسالعضلات وkindlin هي فقط التي أعرب عنها في التطور الجنيني 4، ويتم التعبير عن kindlin-3 في الأنسجة المكونة للدم وفقا لأعلى تركيز kindlin-3 الموجودة في الخلايا السوية العرطلة 18. ومع ذلك، فقد اقترح أكثر الدراسات الحديثة أن يتم التعبير عن بروتين وظيفية في الأنسجة البطانية وكذلك 19. Kindlin-3 هو من مصلحة الطبية الحادة نظرا لدورها المهم الفسيولوجية في الدم. فمن الأهمية بمكان لتراكم الصفائح الدموية ونشر خلال تشكيل خثرة 20، الكريات البيض المتداول في الاستجابة للعدوى والالتهابات و21،22 تشكيل خلية رجلاء ناقضة العظم في ارتشاف العظم 23. وعلاوة على ذلك، ونضوب kindlin-3 في البشر يؤدي إلى التصاق الكريات البيض نقص النوع الثالث - وهو مرض يتميز النزيف اضطرابات التي تهدد الحياة والالتهابات البكتيرية المتكررة 20،24،25. كشفت Kindlin-3 دراسات خروج المغلوب في الفئران وظيفة حاسمة من البروتين فيالتصاق الخلية KIND3 - / - الفئران الظواهر عرض متميزة، مثل نزيف حاد بسبب لل integrins غير نشط الصفائح الدموية، تصخر العظم الشديد، وضعف التصاق الكريات البيض 20،22، تشبه الأعراض في البشر تفتقر kindlin-3. حتى الآن، تم تقييد البيانات الهيكلية عالية الدقة على kindlins إلى النطاقات الفرعية الفردية مثل التماثل pleckstrin (PH) مجال kindlin-1 9 و kindlin-2 26،27 والمجال F0 من kindlin-1 11 وkindlin -2 17. ومع ذلك فقد قاوم معظم المجالات الفرعية لكل ببتيد kindlin الاستنساخ والتحليل البنيوي (ييتس وجيلبرت والملاحظات غير منشورة)، وقد عرقلت دراسات من البروتينات كامل طول من صعوبة في التعبير عن وتنقية كميات كافية باستخدام E. القولونية (الملاحظات غير منشورة وHarburger وآخرون 14). هناك اهتمام كبير في kindlin الطبية-3 وفو لnction، جنبا إلى جنب مع اثنين آخرين من أفراد الأسرة، ونحن في الآونة الأخيرة ولدت كميات مليغرام من ذلك عن طريق التعبير المؤتلف في الخلايا frugiperda ورق القطن مدفوعا عدوى الفيروسة العصوية 12. لذا نحن هنا تصف أساليب لإنتاج كميات مليغرام من الماوس المؤتلف kindlin-3 في الثقافة خلية الحشرات، ومناسبة للدراسات الهيكلية واسعة النطاق وتحليل الكيمياء الحيوية. في هذا البروتوكول والاستفادة من bacmid خروج المغلوب هندسيا (BAC10 KO: 1629) وهذا هو، وحده، قادر على إنتاج virions قابلة للحياة 28. وهكذا أنقذت الحمض النووي الفيروسي عن طريق إعادة التركيب مع ناقلات نقل أنه في هذه الحالة يشمل أيضا الجين kindlin-3 (FERMT3) والنتائج في الجين FERMT3 استبدال الفيروس الجيني في وقت متأخر جدا، وهو ما يعبر عنه للغاية ولكن لزوم لها، مما أدى إلى المؤتلف الفيروس الذي يعبر عن الماوس kindlin-3 كجزء من دورة حياة الفيروس 28. حددنا هذاطريقة لإنتاج kindlin-3 بعد أن أثبتت محاولات للتعبير عن وتطهيره في المضيفين التعبير الأخرى صعبة باهظة (الملاحظات غير منشورة)، ولكن أيضا بسبب براعة من مجموعة ناقلات شبكة المعلومات السكانية، والتي كنا لالاستنساخ والتي يمكن نشرها في العديد من التعبير يستضيف 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlins هي coactivators الأساسية، مع تالين، من سطح الخلية مستقبلات لل integrins وأيضا المشاركة في إنتغرين خارج في إشارة، ومراقبة النسخ الجيني في نواة الخلية. وkindlins هي ~ 75 كيلو دالتون البروتينات متعددة المجالات وربط لعزر NPxY والمنبع العنقودية T / S الذيل حشوية إنتغرين β-الوحيدات. شكل الإسوي kindlin hematopoietically الهامة، kindlin-3، هو أمر حاسم لتراكم الصفائح الدموية خلال تشكيل خثرة، الكريات البيض المتداول في الاستجابة للعدوى والالتهابات وتشكيل خلية رجلاء ناقضة العظم في ارتشاف العظم. وقد أدى دور Kindlin-3 في هذه العمليات في الدراسات الخلوية والفسيولوجية واسعة النطاق. ومع ذلك، هناك حاجة إلى وسيلة فعالة للحصول على كميات مليغرام جودة عالية من البروتين لمزيد من الدراسات. وضعنا بروتوكولا، وهنا وصفها، للتعبير عن كفاءة وتنقية المؤتلف kindlin-3 الفئران عن طريق استخدام باكولوفيروس ديعصف نظام التعبير في خلايا Sf9 الغلة كميات كافية من البروتين عالية النقاء كامل طول السماح لها توصيف الفيزيائية الحيوية. يمكن اتخاذها نفس النهج في دراسة أخرى على الأشكال الإسوية kindlin الثدييات.

التعبير على نطاق واسع من الماوس المؤتلف kindlin-3 باستخدام الخلايا المصابة Sf9 الفيروسة العصوية يمكن أن يستغرق أقل من أسبوعين لتحقيق كميات مليغرام، كما هو موضح في الشكل 1A التخطيطي ويتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي البلازميد من عدة QIAprep Miniprep، ل المثال. ويتحقق توليد المؤتلف الفيروسة العصوية التي كتبها cotransfecting خلايا Sf9 مع الماوس kindlin-3 (FERMT3) التي تحتوي على البلازميد معا مع bacmid خطي هندسيا (BAC10: KO 1629) وحصاد virions شكلت حديثا بعد 5-7 أيام، كما هو مبين في الشكل 1A. هذا الأسلوب من نتائج الجيل الفيروسة العصوية في 100٪ من الفيروسات المؤتلف ويوزع أساسا على ضرورة تنقية البلاك 28،30. وهناك على نطاق صغير (2 مل أحادي الطبقة) الثقافة ممثل توليد حل المحتوية على الفيروس المؤتلف مع عيار الفيروسية المتوقع تشكيل وحدات 1 × 10 7 وحة (PFU) لكل مل منالثقافة. يمكن للمرء أن إجراء فحص اللوحة لتحديد عيار الفيروسية الفعلي ولكن هذا ربما أيضا كثيفة العمالة عندما يتم اختبار عدد كبير من البنى الهيكلية للدراسات. نجاح الخطوة الجيل الفيروس يمكن تقييمها باستخدام البلازميد التي تحتوي على EGFP في موازاة ذلك، أو، لهذا البناء kindlin-3، وأحادي الطبقة Sf9 يمكن معلق في برنامج تلفزيوني والمقررة من قبل SDS-PAGE والنشاف الغربية، والذي يدل عادة الفرقة واضحة الموافق 75 كيلو دالتون صاحب الموسومة البروتين، كما هو مبين في الشكل 1B. يتم تضخيمه الفيروس بعد ذلك إلى توليد كميات كافية على نطاق واسع (وحدات التخزين لتر) عدوى الخلية الحشرات والعزلة المؤتلف البروتين. يتم إنشاء فيروس المقطع الثاني (P2) عن طريق إصابة الثقافات التعليق مع وزارة الداخلية تقدر ب 0.1 (انظر البروتوكول). فمن الأهمية بمكان أن التضخيم Sf9 الثقافة التعليق تحتل سوى العشرين لإجمالي حجم القارورة. هذا تهوية إضافية يضمن أن ينتج فيرولنا المحتوية على وسائل الإعلام، التي تحصد بعد 3 أيام (72 ساعة) بعد الإصابة، وتوليد كميات كافية من kindlin-3 في ثقافة التعبير اللاحقة. يفترض أن الأسهم الفيروس تضخيم (P2) لتمتلك عيار الفيروسية المتوقعة من 2 × 10 8 PFU / مل على أساس تقدير متحفظ من 100 PFU / خلية باستخدام الكثافة خلية من 2 × 10 6 خلية / مل خلال التضخيم 31. عموما، لإنتاج الأمثل التضخيم الفيروسة العصوية والبروتين، وينبغي أن تكون خلايا Sf9 موحدة في الحجم وكروية، كما هو مبين في الشكل 1C. بالإضافة إلى ذلك، التضخيم الفيروسية والبروتين التعبير هو الحد الأقصى في 72 ساعة بعد الإصابة، ويتم تخفيض حد سواء بشكل ملحوظ في 96 ساعة بعد العدوى. مرة واحدة وقد تم تضخيم الفيروسات واستخدامها لتصيب خلايا Sf9 في التجارب على نطاق واسع يتم تنقيته المؤتلف kindlin-3 جزئيا بحكم المهندسة C-محطة له 6 علامة باستخدام يجمد الاستشراب تقارب المعدن لهاالكروماتوغرافي، كما هو مبين في الشكل 2. فمن المهم لتنفيذ عملية تنقية في 4 درجات مئوية، وقد أضاف أن مثبطات الأنزيم البروتيني الكافي لمنع التحلل البروتيني. وkindlin-3 المنقى جزئيا هو زيادة تخصيبه إلى قرب التجانس بواسطة التبادل الأيوني اللوني (IEC) باستخدام عمود الهيبارين، كما هو موضح في الشكل 3. استخدمناها استخدام عمود الهيبارين بدلا من عمود التبادل الأيوني التقليدية، كما توقعنا أن عدد كبير من بقايا الأساسية، بما في ذلك امتداد بولي يسين داخل نطاق kindlin F1-3، سوف تتفاعل بقوة مع المجموعات كبريتات سالبة الشحنة العمود. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لالحمض النووي والبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي مع بقع ملزمة الحمض النووي الأساسية، على سبيل المثال محطة ملزم RNA uridylyltransferase Cid1 32. أخيرا kindlin-3 النقاء هو &quot;مصقول&quot; حسب حجم الاستبعاد اللوني لإزالة الركام وتحقيق التجانس، كما هو مبين فيالشكل 4. المخازن المؤقتة المحددة في البروتوكولات هي مخازن القياسية التي يكثر استخدامها في تنقية البروتين عن التحليل البنيوي. عموما، وتجنب مخازن القائم على الفوسفات لتنقية البروتينات للدراسات الهيكلية، وخاصة فحص التبلور نظرا لتكوين بلورات فوسفات في بلورة قطرات (وخاصة للتجارب في 4 درجات مئوية). ومع ذلك، أجرينا مقايسة التحول الحراري استنادا Thermofluor لتحديد مخازن التي استقرار لkindlin-3، كما هو مبين في الشكل 5. لفترة وجيزة، والمخفف حل البروتين النقي في المخازن المؤقتة التي تغطي مجموعة واسعة من درجة الحموضة وتركيز الصوديوم كلوريد، وبالتالي تشكيل الشاشة 2 الأبعاد. يتم قياس ذوبان البروتين من خلال مراقبة مضان من Sypro البرتقال صبغة (تحقيقات الجزيئية)، التي تربط لبقايا مسعور داخل البروتين الأساسية مطوية، على مدى درجة حرارة 20-95 درجة مئوية (293-368 K). منتصف النقطة درجة الحرارة التي الالبروتين تتكشف ه تم احتساب (درجة حرارة التحول، T م) باستخدام برنامج مراقبة Opticon ويوصف في مكان آخر 33. ولوحظ Kindlin-3 أن تكون مستقرة في تركيزات عالية كلوريد الصوديوم (500 ملم) في نطاق درجة الحموضة 7،0-9،0، مع درجة حرارة التحول متناسقة (T م) من 55 درجة مئوية. وقد لوحظ أيضا أن T م من Kindlin-3 كان ما يقرب من 55 درجة مئوية في نطاق درجة الحموضة 7،0-7،5 بغض النظر عن تركيز الصوديوم كلوريد. وجدنا أن هناك التحلل البروتيني محدود من kindlin-3 خلال تنقية ولكن أثبت تحليل SDS-PAGE مركزة للغاية من البروتين (~ 15 ملغ / مل) مع اثنين من التلوث محدودة البروتينية إضافية من كثافة متساوية. الغريب، ولكن ليس هناك ما يدل الأنواع إضافية حسب حجم الاستبعاد اللوني، كما هو مبين في الشكل 4. وبالتالي يعتقد أن هذا البروتين هو رصدت من قبل ولكن لا تزال مطوية البروتياز وhydrodynتمييزه amically من البروتين كامل طول. ومن المثير للاهتمام، هو Calpain البروتيني المعروف أن يشق kindlin-3 في Tyrosine373، والذي هو في حلقة β1-β2 من التماثل pleckstrin (PH) للنطاق 34 و قد يفسر ملاحظاتنا. علاوة على ذلك، النشاف الغربية يكشف عن أن واحدة من الحلل ببتيد تمتلك-C محطة صاحب العلامة والوزن الجزيئي واضح من صدرة، عندما لخص، يساوي 75 كيلو دالتون، وهو نفس الوزن الجزيئي للبروتين كما الأم. العائد من تنقية kindlin-3 المؤتلف للتر الواحد من خلايا Sf9 (~ 2 غرام من الوزن الخلية) هو، في أحسن الأحوال، 5 ملغ. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة نظرة عامة على الخلية المصابة الفيروسة العصوية الحشرة مغاير التعبير البروتين (أ) A schematized من generatio الفيروسة العصويةن والتعبير عن kindlin-3 في خلايا Sf9. في الخطط ناقلات DNA، هو لون 5&#39;UTR / ORF603 باللون الأحمر، والملونة باللون الأخضر وORF1629، هو لون الجين من البروتين من الفائدة (POI) الأزرق. (B) لطخة غربية، وذلك باستخدام مضاد للله 6 الضد، ستة على نطاق صغير (2 مل أحادي الطبقة) الثقافات (الممرات المسمى وفقا للثقافة) من الخلايا المنتجة للSf9 الفيروسة العصوية المؤتلف والمؤتلف kindlin-3 الفئران. (C) ضوء صورة مجهرية من الخلايا Sf9 صحية نمت في تعليق في SF-900 II SFM تستكمل مع المضادات الحيوية ونقل إلى 35 ملم صحن زراعة الأنسجة بشكل جيد (انظر البروتوكول). الصورة 20X التكبير. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> الشكل 2. Represeتنقية ntative من kindlin-3 من قبل يجمد اللوني تقارب المعادن (إيماك). SDS-PAGE من النيكل تقارب المنقى المؤتلف الفئران أعرب kindlin-3 في الخلايا المصابة الفيروسة العصوية Sf9 (~ 2 غرام من الوزن الخلية). ومزال البروتين كثف باستخدام التدرج إيميدازول (كما هو موضح أعلاه الجل). وصفت الممرات النحو التالي؛ ميغاواط، الوزن الجزيئي علامة؛ ليز، المحللة خلية كاملة؛ FT، تتدفق من خلال (غير منضم)؛ WI، غسل 1؛ WII، وغسل 2. تم إجراء تحليل لطخة غربية (أدناه) أيضا باستخدام الكسور شطف لتأكيد وجود المهندسة صاحب العلامة على البروتين المؤتلف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> الرقم 3. الدعوة موجهةلاحظ تنقية sentative من kindlin-3 بواسطة الهيبارين تقارب اللوني. (A) ملف شطف عند 280 نانومتر (الأزرق) عرض ذروة متناظرة واحد يبلغ حجمه تحت كلوريد الصوديوم الانحدار الخطي (الأخضر) باستخدام مجموعة تركيز كلوريد الصوديوم من ،05-1،0 M. ( ب) تحليل SDS-PAGE لشطف مجزأة مما يدل على وجود البروتين كيلو دالتون 75، kindlin-3 (K3 المسمى). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> الشكل 4. الممثل الترشيح هلام اللوني ومركزة kindlin-3 (أ) الترشيح جل الشخصي شطف من المنقى kindlin-3 باستخداموSuperdex S200 (16/60) في تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم و 1 ملي DTT عند 20 درجة مئوية. على أساس حجم شطف، kindlin-3 يهاجر كما هو متوقع ل75 كيلو دالتون البروتين، مما يشير إلى أنه في الغالب أحادى. (B) SDS-PAGE عالية التركيز من المنقى المؤتلف kindlin-3 في 14.5 ملغ / مل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> تم تخفيفه مقرها Thermofluor الرقم 5. الفحص التحول الحراري لفحص المخزن المؤقت. Kindlin-3 في مخازن مختلفة تضم شاشة ثنائية الأبعاد من درجة الحموضة في مقابل تركيز الصوديوم كلوريد. وقد لوحظت درجات الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية (درجة الحرارة منتصف نقاط) من خلال مضان منصبغة ملزمة hydrophobically، Sypro البرتقال (تحقيقات الجزيئية) وتحسب باستخدام برنامج مراقب Opticon. (A) والرسم البياني 3D من درجات الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية يتم رسم جنبا إلى جنب مع (B) التغير في درجة حرارة التحول من المتوسط ​​المحسوب من 50.4 درجة مئوية. من أجل الوضوح وأشرطة ملونة وفقا لمجموعة من درجات الحرارة التي تتلاءم معها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies at JoVE.com

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Research

JoVE Journal

Biology

23.2K Views.  University of Oxford.  Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية. 

Video: Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

التعبير عابرة والخلوية توطين البروتينات المؤتلف في الخلايا مثقف الحشرات

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.

تطوير عملية إنتاج وتنقية الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV)2 ناقلات باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات Baculovirus

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

استخراج وتوسيم وتنقية الخلايا الخاصة بالنسب من الجريبات الغارية البشرية

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...