نود أن نشكر الدكتور يانغ شياو ون (PROTEX خدمة الاستنساخ) لإعداد بنيات التعبير المستخدم لهذا العمل وجامعة ليستر الخدمات الأساسية الحيوية. وأيد هذا العمل من قبل studentship BBSRC، وبرنامج يلكوم ترست والمنح باحث العليا WT085408 وWT100237 وBBSRC منح RM31G0224.

ملاحظة: بروتوكول مناسب لحجم أي تعبير، وبالتالي أحجام وكميات الكواشف يجب تحجيمها بشكل متناسب. يجب أن تستخدم مناسبة متجه التعبير الثدييات لهذا البروتوكول. نحن هنا استخدام تعديل pcDNA 3.1 ناقلات التعبير التي تسمح بسهولة إدراج أو استبعاد علامة تقارب اعتمادا على اختيار تقييد الانزيمات المستخدمة في الاستنساخ (الشكل 1). يصف البروتوكول بعد ترنسفكأيشن نطاق واسع. 1. كبيرة الثقافة مقياس / ترنسفكأيشن في 1 لتر زجاجات الأسطوانة النمو والحفاظ على خلايا تكييفها تعليق HEK293F وفقا لبروتوكولات القياسية. وعادة ما تزرع ثقافات المبدئ بين 30 و 100 مل في 250 مل المخروطية قوارير ثقافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور عند 0.5 × 10 6 خلية / مل إلى الحجم النهائي من 300 مل في كل زجاجة الأسطوانة 1 L. ملاحظة: زجاجات الأسطوانة تستوعب ما لا يقل عن 150 مل لمدة أقصاها300 مل من ثقافة تعليق. لtransfections نطاق أوسع استخدام زجاجات متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة شاكر المدارية عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، و 5٪ CO 2 حتى تصل إلى خلايا كثافة 1.0 × 10 6 خلية / مل (خلايا يجب تقسيم تقريبا كل 24 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ما مجموعه 300 ميكروغرام من الحمض النووي فلتر تعقيم (انظر طريقة التكميلي) في 30 مل من برنامج تلفزيوني ودوامة بقوة لمدة 3 ثانية. ملاحظة: استخدم ما مجموعه 1 ميكروغرام من الحمض النووي في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مليون. إذا اثنين أو أكثر من البلازميدات هي يشترك transfected-تقلل من كمية كل ذلك أن نسبة الحمض النووي لخلايا لا تزال مستمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.2 مل من 0.5 ملغ / مل تصفية تعقيم-PEI إلى PBS / حل DNA ودوامة بقوة لمدة 3 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذا المزيج في RT لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DNA / PEI المزيج إلى الخلايا - التي ينبغي أن تكون في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل (الخطوة 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في ترنسفكأيشن التالية، واحتضان الخلايافي حاضنة شاكر المداري ل48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، وCO 2 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات داخل الخلايا الحصاد بواسطة الطرد المركزي الخلايا في 3000 x ج لمدة 5 دقائق وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية. ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدام معيار (غير CO-2) يهز حاضنة، إذا تم استبدال الغلاف الجوي فوق الثقافة مع CO 2 5٪ ومختومة في غطاء زجاجة. سوف تحتاج الجو لتحل محلها في كل ممر (عادة كل أيام 2). </li></ol> 2. البروتين تنقية معقدة من استخراج خلية كاملة تم تحسين هذا البروتوكول لتنقية المجمعات النووية باستخدام بروتينات الموسومة العلم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذويب بيليه الخلية إلى ~ 40 مل من تحلل العازلة قبل المبردة (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪، 0.3٪ تريتون X-100، مثبطات الأنزيم البروتيني) لكل لتر من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات (لتجنب رغوة، لا الدوامة). </lأنا&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما اعادة تعليق الخلايا باستخدام الخالط الزجاج. يصوتن لمدة 3 دورات (15 ثانية على، 15 ثانية إيقاف). أجهزة الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 25 دقيقة في 4ºC والاحتفاظ طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن 1.25 مل من مكافحة العلم معبأة الراتنج الاغاروز لكل لتر من الثقافة عن طريق غسل ثلاث مرات مع العازلة الراتنج موازنة (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان استخراج خلية كاملة من الخطوة 2.3 مع الراتنج تقارب في واحدة أو أكثر من 50 مل أنابيب الطرد المركزي وتناوب بلطف العينة ل30-120 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية، وطاف تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع 45 مل من العازلة قبل المبردة 1 (100 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪، 0.3٪ تريتون X-100). أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.7 باستخدام العازلة عالية من الملح (300 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس 7.5 درجة الحموضة، الجلسرين 5٪)، تليها عازلة الملح منخفضة (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 و 5٪ الجلسرين) والشق TEV العازلة (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 ملي TCEP). ملاحظة: تأكد من كل غسل هو أي جيزة، كافية تماما لاعادة تعليق الراتنج ولم يعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينة 10 ميكرولتر من الراتنج وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين لتحليل (ملزمة تحكم البروتين). لا تستخدم وكلاء الحد من أجل تجنب الافراج عن الأجسام المضادة من الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الراتنج إلى 8-10 مل من قبل المبردة عازلة TEV انشقاق ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 40 ميكروغرام من TEV البروتيني (من المخزون في 1 ملغ / مل) لكل لتر من الثقافة الأصلية ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال أنبوب الغلاف الجوي مع 100٪ N 2 الغاز لمنع أكسدة البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوب بلطف O / N في 4ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل طاف في عامل تصفية الطرد المركزي فائقة مع الوزن الجزيئي قطع المناسبة والتركيزوصولا إلى 500 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينة 10 ميكرولتر من البروتين المركز وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين للتحليل. (TEV شطافة السيطرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينة 10 ميكرولتر من الراتنج وتمييع إلى 1 حجم 2X العازلة تحميل البروتين للتحليل. لا تستخدم الحد من وكلاء من أجل تجنب إطلاق كميات كبيرة من الأجسام المضادة الراتنج. (بعد TEV السيطرة الراتنج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن حجم استبعاد العمود اللوني هلام مع العازلة الترشيح (50 ملي خلات البوتاسيوم، و 50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 ملي TCEP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية البروتين من خلال مرشح 0.22 ميكرون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينة إلى العمود وجمع الكسور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات من خطوات تشغيل 2.9، 2.15 و 2.16 وكسور الترشيح هلام من الخطوة 2.19 على SDS-PAGE Coomassie وصمة عار للتحليل. ملاحظة: ومن المستحسن لتشغيل SDS-PAGE عينات من الخطوات 2.9، 2.15 و 2.16 قبل هلام الترشيح لتأكيد التعبير عن بروتين الهدف.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

قمنا بتطوير طريقة فعالة واضحة وبكلفة (PEI تكاليف أقل بكثير من المتاحة تجاريا الكواشف ترنسفكأيشن محبة للدهون) للتعبير عن وتنقية كميات كبيرة من البروتينات المؤتلف والمجمعات متعددة فرعية من خلايا الثدييات. يمكن الوصول ترنسفكأيشن الأمثل والكفاءة التعبير إذا تم استخدام DNA البلازميد نقية للغاية (260/280 بين 1.8 و 2.0) في تركيبة مع PEI كما هو موضح في قسم البروتوكول. يجب أن يكون مثقف الخلايا في serum- وخالية من المضادات الحيوية وسائل الإعلام، وبالتالي، مطلوب تقنية معقمة بدقة عن الركض والخلايا transfecting من أجل تجنب العدوى مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وينبغي أن يكون بقاء الخلية 90٪ أو أعلى، وينبغي ألا نمت الثقافات إلى كثافة أكبر من 2.5 × 10 6 خلية / مل على الفور قبل ترنسفكأيشن، لأن ذلك سوف يقلل العائد البروتين. لترنسفكأيشن ناجحا، يجب الثقافات تحتوي فقط على الخلايا واحدة أو تقسيم. يمكن تقسيم المجموعات من قبل قوةvortexing لالأوس 20 الى 30 ثانية (الشكل 5). نسبة كل بلازميد المستخدمة في التعاون ترنسفكأيشن يمكن أن تختلف من قبل المستخدم وفقا لرياضيات الكيمياء للكائن معقد دراستها. يمكن تحسين كفاءة التعبير عن البروتين من الفائدة، بحيث يمكن إنشاء الوقت التعبير مناسب. يجب أن يتم تنفيذ تنقية حفظ البرد عينة البروتين في جميع الأوقات للحد من مخاطر تدهور بروتين غير المرغوب فيها. اختيار العلامات ومخازن تنقية أمر بالغ الأهمية، لأنها قد تتداخل مع العناصر الهيكلية أو المواقع المفعلة بعض البروتينات، مما أدى إلى انخفاض الذوبان و / أو فقدان النشاط الأنزيمي في كثير من الأحيان. transfections صغار مفيدة بشكل خاص لاختبار بنيات مختلفة لتنقية البروتين المجمعات الكبيرة. اليوم، تتوفر للتعبير عن البروتينات المؤتلف حقيقية النواة (الجدول 2) مجموعة كبيرة ومتنوعة من منهجيات بديلة. على سبيل المثال، Baculoviويستخدم روس التعبير في خلايا الحشرات على نطاق واسع بسبب ارتفاع كفاءة ترنسدوكأيشن وافتقارها إلى سمية الخلايا بالمقارنة مع الأنواع الفيروسية الأخرى 6. ومع ذلك، فإن عملية جعل الفيروس تستغرق وقتا طويلا ولا يسمح عدم الاستقرار الفيروس ليتم تخزينها لفترات طويلة. من ناحية أخرى، نظم الخميرة التعبير توفر إمكانية خلايا الكثافة إلى عالية جدا متزايد في الثقافات تخمير، مما أدى إلى عوائد بروتين عالية 7. لكنها لا تزال تفتقر إلى مجموعة كاملة من التعديلات بعد متعدية المطلوبة للبروتينات حقيقية النواة لأضعاف بشكل صحيح والتفاعل مع الشركاء البروتين. HDAC3، على سبيل المثال، يتم التعبير لكن لا أضعاف في E. القولونية. ومع ذلك، عندما أعرب في 293F الخلايا، وتمكنا من تنقية انزيم نشط في مجمع مع الجهات المشاركة في كاظمة (SMRT) وجزيء من اينوزيتول tetraphosphate (IP4) 8، والتي لم يتم العثور في الخلايا أولية النواة. هذه الطريقة سمحت لنا أيضا لتنقية وحل الكريستال الحادي وructure من HDAC1 التفاعل مع MTA1 في مجمع NuRD، الذي ينشط مماثل IP4 9. من الناحية المثالية، نود دائما للتعبير عن البروتينات في حقيقية النواة الطبيعية وبيئتها الفسيولوجية. وقد وصفت النظم التعبير الثدييات التي تستخدم خلايا HEK 293-EBNA1 في المفاعلات الحيوية 10-12 وتسفر مستويات عالية جدا من البروتين، ولكن هذه يمكن أن تكون معقدة للاستخدام. أسلوبنا هو بديل بسيط وفي متناول التعبير في أنظمة البكتيريا والخميرة ومفاعل حيوي. طريقة التعبير هو سريع ولا يتطلب استخدام معدات غالية الثمن، خاصة إذا تم استبدال الأسطوانة زجاجة أو قارورة الجو مع 5٪ CO 2 وتستخدم حاضنات تهز القياسية. وقد استخدمنا هذه البروتوكولات إلى المشاركة في البلازميدات بالنقل متعددة وتنقية المجمعات مع ما يصل الى خمسة البروتينات مع غلة&gt; 1 ملغ / لتر من الثقافة. ومن المثير للاهتمام، ونظام يساعد على تحديد مستقرة المجمعات حسن تصرف. على سبيل المثال، السابقأعطى بريشن من مجمع ثنائي HDAC1 وSin3A عوائد محدودة من البروتين، ولكن أدت إضافة SDS3 في 5 أضعاف كميات أكبر، وبالتالي يوجه الأحياء الهيكلي في اختيار التركيبات المناسبة والمجمعات مستقرة للتبلور.

وقد أدى التقدم السريع لبيولوجيا الخلية الجزيئية والحاجة المستمرة لتحسين العقاقير في الطب حاجة لعلماء الأحياء الهيكلية للنظر في الهياكل البروتين على نحو متزايد أكثر تعقيدا. يمكن لهذه غالبا ما تتطلب تعديلات خاصة بعد متعدية، المحرمين الجزيئية والعوامل المشتركة لدعم للطي من محكم والنشاط الأنزيمي. في حين أن الغالبية العظمى من الهياكل الحالية في بنك معلومات البروتين قد تم الحصول عليها باستخدام أنظمة التعبير البكتيرية، بدائيات النوى غير قادرة على تنفيذ عدد كبير من هذه التعديلات وتفتقر العديد من العوامل المشارك حقيقية النواة الأساسية. وهذا يمكن أن يكون مشكلة لدراسة المجمعات متعددة فرعية الكبيرة التي يتم تفعيلها من خلال جزيئات صغيرة مما يشير كذلك لالنووية وسطح الخلية والبروتينات يفرز التي تتطلب وضع آليات قابلة للطي. وهناك عدد من E. وقد تم تصميم سلالات القولونية للتغلب على بعض هذه القيود 1. في السنوات الأخيرة، ومع ذلك، فإن استخدام منظم التعبير ammalian قد تزايد لأنها تنتج موثوق البروتينات حقيقية النواة التي هي على خلاف ذلك للتعبير عن إشكالية في الأنظمة الأخرى 2. اليوم، فإنه من الممكن الحصول على خطوط الخلايا التعبير الثدييات مستقرة وعابرة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين تنبيغ الفيروسية لترنسفكأيشن بوساطة الكيميائية والفيزيائية تحويل الجينات مثل Electroporation للوالحقن المباشر 3. في حين أن كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من المزايا والعيوب، فقط عدد قليل منها هي مناسبة للدراسات الهيكلية أنها إما مكلفة للغاية و / أو وقتا طويلا. نحن هنا وصف طريقة بسيطة جدا وسريعة، وغير مكلفة حتى الآن كفاءة عالية للتعبير عن مجمعات البروتين لعلم الأحياء الهيكلي في تعليق نمت خلايا الثدييات. يستخدم نهج عابر شارك في ترنسفكأيشن خط الجنينية البشرية الكلى (HEK) الخلايا (مثل خلايا حرة HEK 293F). وقد استمدت هذه الخلايا من 293 م HEKخط ليرة لبنانية، يتم تكييفها لتنمو في الثقافات تعليق، ووصلت كثافة عالية باستخدام المصل خالية سائل الإعلام (مثل حرة 293 التعبير المتوسطة). ثم و transfected خلايا عابر باستخدام نسخة من أفرع polyethylenimine (PEI)، وكاشف البوليمرية غير مكلفة التي ذكرت في العمل لمجموعة كبيرة من خلايا الثدييات 4 من خلال تشكيل الحمض النووي / المجمعات PEI التي تدخل الخلية المضيفة عن طريق الإلتقام 5. هذا الأسلوب هو مناسبة لكلا نطاق صغير (30 مل) وعلى نطاق واسع (ما يصل الى 300 مل) التجارب ويمكن أن تنتج مستويات عالية من المجمعات البروتين المنقى. انها مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتينات التي تتطلب أجهزة معقدة للطي، والعوامل المشارك أو خاصة التعديلات بعد متعدية التي لا يمكن أن يقوم بها البكتيريا والخميرة وخلايا الحشرات. في هذا البروتوكول نقدم التعبير وتنقية السقالة وسط ثلاثة البروتين من مجمع القمع النسخي Sin3A. هذا يتكون من هيستونDeacetylase 1 (HDAC1)، المكثف من المعيب إسكات 3 (SDS3) والتبديل مستقلة-3 (Sin3A). يتم استخدام مجمع النقي للمحاكمات تبلور عالية الإنتاجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

نحن هنا تظهر L 2 (8 × 250 مل الثقافات) عابرة شارك في ترنسفكأيشن وتنقية HDAC1، SDS3، Sin3A مجمع الثلاثي. HDAC1 وSDS3 التفاعل مع Sin3A من خلال المجال HDAC التفاعل (HID) من Sin3A. وعائدات تنقية نموذجية تصل إلى 1 ملغ من مجمع للتر الواحد من الثقافة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. تخطيطي لتعديل ناقلات pcDNA 3.1 التعبير. تم هضمها البلازميد مع EcoRV وEcoRI لتشمل تقارب العلامة وTEV انشقاق الموقع على محطة الأمينية من Sin3A. لاستنساخ إصدارات لازال من HDAC1 وSDS3، تم استيعاب ناقلات مع KpnI وEcoRI. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. SDS-PAG<html> E تظهر الخطوة الأولى لتنقية ويبين &quot;بروتين ملزمة&quot; حارة المجمع منضمة إلى الراتنج تقارب. TEV التالية الهضم، والمشقوق العلامة موجودة على Sin3A-HID قبالة ومزال مجمع من الراتنج كما هو مبين في الممرات الثانية والثالثة من هلام. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. المخطط الاستشرابي من البروتين النقي معقدة باستخدام استبعاد حجم اللوني. لاحظ أن مجمع النقي مزال في حجم الفراغ لأنه يشكل ديمر في الحل. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4. SDS-PAGE تظهر أجزاء من الترشيح هلام هو مبين في الشكل 3. r.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. التريبان خلايا HEK 293F الزرقاء الملطخة في 2.3x10 6 خلية / مل جاهزة ليتم transfected. يجب أن تكون خلايا فقط بوصفها واحدة أو تقسيم الخلايا، في حين يمكن تقسيم مجموعات كبيرة تصل من قبل vortexing قوية لحوالي 25 ثانية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مشكلة </td><td> الأسباب المحتملة </td><td> العمل </td></tr><tr><td rowspan="4"> انخفاض العائد البروتين. </td><td> انخفاض عدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. </td><td> جعل كثافة الخلية المؤكد تقريبا 1.0 × 10 6 قبل إضافة خليط التفاعل ترنسفكأيشن للثقافة. </td></tr><tr><td> خلايا قد تم subcultured مرات كثيرة جدا. </td><td> استخدام خلايا الأسهم جديدة بعد ما يقرب من 90 تمريرةالأعمار. </td></tr><tr><td> DNA قد تدهورت أو لديك كمية عالية من الشوائب. </td><td> تأكد من أن الحمض النووي بلازميد تستخدم لديه نسبة 260/280 بين 1.8 و 2.0. تشغيل DNA على هلام الاغاروز من المستحسن لتقييم جودتها. </td></tr><tr><td> بروتين (ق) التي أعرب ليست مستقرة بما فيه الكفاية أو ذوبان. </td><td> اختبار بنيات مختلفة في نطاق ضيق قبل يصل تسلق transfections. جعل علامات على يقين لا تتداخل مع بنية البروتين (ق) من الفائدة. </td></tr><tr><td> الخلايا تبدو غائمة ولها لون غير عادي و / أو رائحة. </td><td> يصاب الخلايا مع البكتيريا أو الخميرة. </td><td> يجب استخدام تقنية معقمة جيدة في جميع الأوقات. تبخير اغطية تدفق الصفحي والأشعة فوق البنفسجية تعقيم غرفة زراعة الخلايا في حالة من حالات العدوى يساعد على احتواء المشكلة. </td></tr><tr><td rowspan="2"> الخلايا لديها قابلية منخفضة. </td><td> درجة الحموضة خاطئة في وسائل الإعلام. </td><td> جعل تزرع ثقافات المؤكد في 5-8٪ CO 2في جميع الأوقات. </td></tr><tr><td> تم تربيتها خلايا تصل إلى كثافة أكثر من 3.0x10 6 خلية / مل. </td><td> لا ينبغي أن نمت الخلايا يصل إلى كثافة فوق 2.5 × 10 6 خلية / مل على الفور قبل ترنسفكأيشن وأبدا فوق 3.0 × 10 6 خلية / مل. </td></tr><tr><td rowspan="2"> لم تنقية تقارب لا تعمل </td><td> لا يتم أعرب البروتين (ق). </td><td> انظر أعلاه. </td></tr><tr><td> شروط تنقية قد تكون خاطئة. </td><td> ضبط الظروف عازلة (مثل الملح العالية، والملح منخفضة، ودرجة الحموضة.) </td></tr></tbody></table> الجدول 1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نظام </td><td> مزايا </td><td> عيوب </td></tr><tr><td> كولاي </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعةنظام التعبير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عوائد عالية من البروتين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير مكلفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناسبة لإنتاج بأسعار معقولة من البروتينات المسمى isotopically </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم وجود مرافقين المهم أن قد تكون هناك حاجة للبروتين للطي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم وجود العديد من التعديلات آخر متعدية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تفتقر شارك في العوامل التي تعتبر مهمة لوظيفة البروتين و / أو التجميع تعقيدا. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تؤدي غالبية متعدية آخر التعديلات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير مكلفة </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفتقر بعض التعديلات بعد متعدية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تفتقر شارك في العوامل التي تعتبر مهمة لوظيفة البروتين و / أو التجميع تعقيدا. </li></ul></td></tr><tr><td> التعبير الفيروسة العصوية في خلايا الحشرات </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء كافة التعديلات آخر متعدية &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيروسة العصوية غير السامة للخلايا أقل من السلالات الفيروسية الأخرى </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفيروس لتنبيغ هو مضيعة للوقت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيروس غير مستقر ولا يمكن تخزينها لفترات طويلة من الزمن </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تفتقر خلايا الحشرات شارك في العوامل التي تعتبر مهمة لوظيفة البروتين و / أو التجميع تعقيدا. </li></ul></td></tr><tr><td> المفاعلات الحيوية مع أنظمة الثدييات </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء كافة التعديلات آخر متعدية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن توفر جميع العوامل المشتركة اللازمة لوظيفة البروتين والتجمع معقد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن خلايا ثقافة بكثافات عالية جدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التعبير عن كل البروتينات الثدييات التي تتطلب أجهزة معقدة للطي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عائدات بروتين عالية جدا </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتطلب موظفين متخصصين لاستخدام مفاعل حيوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب معدات باهظة الثمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين حالة التعبيرق قد يكون مضيعة للوقت. </li></ul></td></tr><tr><td> خلايا تعليق HEK 293F </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء كافة التعديلات آخر متعدية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن توفر جميع العوامل المشتركة اللازمة لوظيفة البروتين والتجمع معقد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التعبير عن كل البروتينات الثدييات التي تتطلب آليات معقدة للطي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سريعة وبديهية بروتوكول ترنسفكأيشن </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع المفاعلات الحيوية و / أو غيرها من الكواشف ترنسفكأيشن المتاحة تجاريا. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الرغم من بأسعار معقولة، ليست رخيصة كما في التعبير البكتيريا </li></ul></td></tr></tbody></table> الجدول 2. مزايا وعيوب الأنظمة التعبير الرئيسية.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

التعبير البروتين المؤتلف لعلم الأحياء الهيكلي في HEK 293F خلايا نظام التعليق: رواية ويمكن الوصول إليه المنهج

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

53.3K Views.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Video: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...