فإن الكتاب أود أن أشكر biolitec بحوث محدودة (جينا، ألمانيا) لتتكرم تزويدنا صياغة الليبوسومال mTHPC، مع شكر خاص لسوزانا GRAFE وأرنو Wiehe لمساعدتهم والخبرة التقنية. نحن أيضا نود أن نشكر كيرستين ريدي، الذي ولدت على جزء كبير من النتائج وكان coresponsible لنشره 11. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من Schweizerischer VEREIN Balgrist، جامعة زيوريخ، وزيوريخ Krebsliga فضلا عن منحة من والتر L. ومؤسسة جوانا وولف، زيوريخ، سويسرا ومنحة من EuroNanoMed ERA-NET / الجبهة الوطنية الصومالية السويسرية المؤسسة الوطنية للعلوم 31NM30-131004/1. وأيد هذا العمل أيضا من قبل HSM برنامج (الطب متخصصة للغاية) لعلم الأورام العضلية الهيكلية من Kanton زيوريخ.

1. مقارنة بين امتصاص من mTHPC في أدنى المعنية ودرجة عالية من النقيلي وملتحقا 143B OS خطوط الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM، هام F12، والحرارة المعطل مصل العجل الجنين في نسبة 4.5:4.5:1. ملاحظة: تم حل صياغة الليبوسومال من PS mTHPC في الماء عند تركيز النهائي من 1.5 ملغ / مل mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 0.2 × 10 6 خلايا وملتحقا 143B / جيد في 6 لوحات جيدة (يثلث لكل حالة)، والسماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها. ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لخطوط الخلايا الفردية. A confluency من 80-90٪ هو أنسب وقت التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيز ثابت من mTHPC لفترات زمنية مختلفة (الوقت امتصاص التابعة)، أو مع زيادة تركيزات mTHPC خلال فترة زمنية محددة (جرعة امتصاص التابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع mTHPC لفترة محددة عoints أو تركيزات mTHPC. ملاحظة: في هذه الدراسة، وحضنت كل من ملتحقا وخطوط الخلايا 143B مع 0.6 ميكروغرام / مل mTHPC ل0، 2.5، 5، أو 10 ساعة، أو مع 0، 0.6، 2.5، و 10 ميكروغرام / مل mTHPC لمدة 5 ساعة. قد تختلف الفترات الزمنية المطبقة وجرعات اعتمادا على خط الخلية التي يتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذكر أن يعمل دائما في الظلام أو في ظروف الإضاءة خافتة لمنع التعرض للضوء المباشر للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا في الظروف المشار إليها، نضح المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. المقبل، فصل الخلايا مع 0.5 مل التربسين / EDTA وعدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انفصال، الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق، نضح المتوسطة وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني لكثافة النهائي من 200،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها (أي 20،000 الخلايا) في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من هذه الخلايا في معمل مضان. الإعدادق لقياسات مضان mTHPC هي: 417 نانومتر للإثارة و 652 نانومتر للالانبعاثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حساب كمية mTHPC المنضوية لكل خلية، وتطبيع وحدة مضان النسبي (RFU) لعدد الخلايا وحجم الخلايا كما يلي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنى قياسي باستخدام تركيزات مختلفة من mTHPC في برنامج تلفزيوني 0-4 ميكروغرام / مل (القياسات استخدام ثلاث نسخ). ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من الآبار باستخدام الإعدادات الموضحة في الخطوة 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم RFU (التي تم الحصول عليها للخلايا 20،000) من قبل المنحدر من منحنى القياسية الخطية من mTHPC، والتي تعطي تركيز mTHPC (في ميكروغرام / مل) في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم هذا التركيز mTHPC بنسبة 10 إلى الحصول على المبلغ الإجمالي للmTHPC في بئر واحدة (في ميكروغرام، وهو ما يمثل 100 ميكرولتر من تعليق خلية) وتقسم هذه القيمة عن طريق حجم 20،000 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم مع صيغة لمجال: (4/3 س π) ×ص 3. الحصول على نصف قطرها ص عن طريق قياس قطرها 20 trypsinized الخلايا تحت المجهر، وتقسيم هذه القيمة بنسبة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وتطبيع كل القيم لتلك التي حصلت للخلايا ملتحقا بعد 10 ساعة من الحضانة (جرعة امتصاص التابعة) أو تعامل مع 10 ميكروغرام / مل mTHPC (الوقت امتصاص التابعة)، والتي تم تعيينها إلى 100٪. </li></ol> 2. قياس الضيائية من PS في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 3،000 خلية / جيدا في لوحة 96 جيدا (يثلث لكل تركيز mTHPC المستخدمة) والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها. وبالمثل إعداد إضافية وحة 96 جيدا وعلاج الخلايا كما هو موضح أدناه، ولكن ثم وضعها جانبا للتصوير النقيض المرحلة. ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لكل خط الخلية الفردية. A confluency من 50-60٪ في وقت التجربة هو المثل الاعلى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع في اعتبارنا أن تضيف المقابلة سيطرة الظلام سمية للخلايا لكل من تركيزات mTHPC. الحد ذاتها هي الخلايا التي سيتم المحتضنة في غياب أو وجود تركيزات مختارة من mTHPC، ولكن لن تكون مضيئة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيزات مختلفة من mTHPC (0، 0.0001، 0.001، 0.01، 0.03، 0.075، 0.15، 0.3، 0.6، 1.25، 2.5، 5، و 10 ميكروغرام / مل) اعتمادا على خطوط الخلايا و الاحتفاظ بها في الظلام لمدة ساعة 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى القسم 1.3.2 ملاحظة: قبل فترة حضانة تعتمد الإضاءة على خط الخلية وعلى PS المستخدمة، وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار تركيزات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة في تجارب منفصلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة للفترة الزمنية المشار إليها، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة متوسطة جديدة دون mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء الضوء على الخلايا مع ليزر ديود 652 نانومتر، محددة لامتصاص الطيف mTHPC (انظر الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الليزر ل21.88 ميغاواط / سم 2 قوة على ارتفاع 13.5 سم distaالامتحانات التنافسية الوطنية من الخلايا، من أجل الحصول على جرعة من الطاقة من 5 J / سم 2. إلقاء الضوء على الخلايا ل230 ثانية. لا تضيء الخلايا السيطرة سمية الظلام (مع وبدون mTHPC). ملاحظة: دائما ارتداء النظارات لحماية العينين من ضوء الليزر المستخدمة في الإثارة من PS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإضاءة، والحفاظ على الخلايا في الظلام في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في وقت لاحق، إضافة الماء نتروبلو القابلة للذوبان (WST-1) كاشف (10 μl/100 ميكرولتر من متوسطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاث ساعات من إضافة كاشف WST-1، وقياس الامتصاصية من الآبار الفردية من لوحة 96 جيدا في 415 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حساب نسبة الخلايا على قيد الحياة، تعيين متوسط ​​القيم التي تم الحصول عليها للخلايا غير المعالجة mTHPC لكل حالة إلى 100٪ (أي مضيئة، دون mTHPC وnonilluminated، دون mTHPC). </li></ol> 3. تقدير عدد الخلايا التي كتبها العد الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 20،000 خلية / نحنليرة لبنانية في 24 لوحة جيدا والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 ساعة مع mTHPC (0.001، 0.003، 0.15، 0.6، و 1.25 ميكروغرام / مل)، وتضيء لهم كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المتوسطة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين لهم وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، ونضح المتوسطة و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا في غرفة نويباور. </li></ol>

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أي مصالح أو تضارب المصالح المالية المتنافسة.

لتحقيق السمسة الأمثل ردا على PDT، لا بد من اختيار الحق وإعدادات ضوء الليزر ومرات الحضانة. الإجراءات الموصوفة هنا هي متسقة وفعالة لتحديد امتصاص PS وقياس السمية الخلوية PDT يتسبب في المختبر. باستخدام موجات الامتصاص النوعي للPS mTHPC، يمكن تحديد امتصاص PS الخلوية بطريقة م?...

الدولة اليوم من العلاج فن عظمية (OS)، ورم العظام الأولية، ويشمل مجموعة من المحافظين الجدد العلاج الكيميائي المواد المساعدة والجراحة. وكشف هذا نظام المعالجة زيادة في معدل بقاء المرضى الذين يعانون من مرض المترجمة من حوالي 20٪ قبل استخدام العلاج الكيميائي، لحاليا بين 60-70٪ 3، 4. ومع ذلك، في العقدين الأخيرين، فقد استقر على البقاء الإجمالي من المرضى يعانون من مرض OS المحلية 4، 5. علاوة على ذلك، 30-40٪ من هؤلاء المرضى الانتكاس في غضون 3 سنوات بعد التشخيص والاستمرار المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر أن يكون لها بقاء الفقراء من 20-30٪ 4، 6، 7. لتحسين نتائج هؤلاء المرضى، والحاجة إلى تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. العلاج الضوئي (PDT)، والعلاج المضادة للسرطان الرواية بدلا من ذلك، يستخدم ضوء طول موجة محددة لالإثارة من photosensitizer (PS)، التي تتراكم في الخلايا السرطانية بعد الحقن لها في مجرى الدم. ضوء الليزر الإثارة من PS يولد الجذور الأكسجين في وجود الأكسجين، مما يحفز رد فعل السامة للخلايا في الخلايا السرطانية وموت الخلايا. إلى جانب هذه الآلية الأولية، أثار إضافيتين PDT تسهم العمليات البيولوجية لانخفاض نمو الورم: PDT يسبب تضيق الأوعية وتكوين خثرة من الأوعية الدموية الدقيقة الورم، ونقص الأكسجة بالتالي المحلية ونقص الأكسجين داخل الورم، مما يؤدي إلى احتشاء الورم. أخيرا، أصيب PDT ويموتون الخلايا السرطانية يؤدي الى استجابة مناعية المحلية، وهي ميزة فريدة من نوعها بدلا من PDT. هذا ينطوي على نظام مكمل وتفعيل مستضد تقديم الخلايا الجذعية 8. وبالتالي، يتم تهيئة الظروف لعرض مستضدات الأورام مع تفعيل لاحقة من الخلايا اللمفاوية، مما يؤدي إلى الحصانة محددة الورم. حتى الآن، وقد استخدم لعلاج PDT عدة أنواع من أورام الأنسجة الرخوة وhyperplفي آسيا، مثل تقران سافع والمريء باريت، وأورام داخل القصبة، وسرطان المثانة، وسرطان الخلايا القاعدية، والمعالجة الملطفة لسرطان الرأس والرقبة 2. ومن المعروف أن العلاج للحث المحلية، على نطاق واسع نخر مع الآثار الجانبية قليلا فقط، وبالتالي لديه القدرة على القضاء بشكل انتقائي الأنسجة السرطانية. على الرغم من هذه المزايا، وتطبيق PDT لا تزال من الناحية الفنية أكثر تطلبا من إدارة المخدرات العلاج الكيميائي. من أجل تحقيق فعالية قصوى، وتركيز PS، وقت التعرض للضوء ومجموع نقل الطاقة الضوئية في حاجة إلى أن يكون الأمثل. ويمكن أن يتم ذلك في في التجارب المجراة، ولكن، نظرا لوجود عدد كبير من المعلمات النسبية التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل، وهو أكثر فعالية لتحديد الظروف المثلى في البداية في المختبر. في التجارب المذكورة أدناه، ونحن اختبار فعالية في المختبر من PDT باستخدام PS-5،10،15،20 tetrakis (الفوقية hydroxyphenyl) شيليأورين، يختصر mTHPC (الشكل 1A). mTHPC هو المادة الفعالة في المنتج الطبية Foscan، والذي يستخدم حاليا في العيادة لتلقي العلاج الملطفة لسرطان الرأس والرقبة. وهي واحدة من أقوى PS، الأمر الذي أدى تلف الخلايا الضخمة بالفعل في تركيزات منخفضة، وقد تبين أن تكون متفوقة على غيرها PS من حيث اختراق الأنسجة 9، 10. في امتصاص الضوء الطيف (الشكل 1B) يبين اثنين من قمم بارزة، واحد في 417 نانومتر، والثانية في 652 نانومتر، والتي تستخدم لتوطين الأنسجة تراكم PS وPDT الحث على التوالي. حاليا، صياغة الليبوسومال لmTHPC هي قيد التطوير. هنا، نحن تصف إجراءات لقياس الإقبال على هذه الصيغة الليبوسومال، وأداء PDT في اثنين من خطوط الخلايا OS الإنسان، وملتحقا النقيلي منخفضة والخلايا 143B النقيلي عالية. وقد تم الإبلاغ عن بعض البيانات المقدمة هنا في وقت سابق 11. النهج ه الموصوفة هنا تمكننا من دراسة تأثير النمط الظاهري المنتشر على PDT فعالية. 143B الخلايا، وحقن orthotopically في الأطراف الخلفية من المناعة الفئران SCID ناقصة يسبب الأورام الأولية المتفاقمة intratibial، نموذج محاكاة عن كثب مرض نقيلي الإنسان. وبالتالي، فإن التجارب في المختبر المقترحة هي مناسبة تماما لتقييم إعدادات PDT الأمثل لاستخدامها في وقت لاحق في التجارب المجراة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

في السنوات الأخيرة، كان هناك صعوبة في إيجاد علاجات أكثر فعالية ضد السرطان مع أقل آثار جانبية جهازية. بالتالي العلاج الضوئي هو نهج جديدة لعلاج أكثر انتقائية الورم. العلاج الضوئي (PDT) أن يجعل من استخدام الضيائي غير سام (PS)، والتي، على تفعيل مع ضوء طول موجة محددة في وجود الأكسجين، وتولد الجذور الأكسجين التي تثير استجابة السامة للخلايا 1. على الرغم من موافقتها منذ ما يقرب من عشرين عاما من قبل ادارة الاغذية والعقاقير، وتستخدم في الوقت الحاضر PDT فقط لعلاج عدد محدود من أنواع السرطان (الجلد والمثانة) وأمراض nononcological (الصدفية، تقران سافع) 2. والميزة الرئيسية لاستخدام PDT هو القدرة على إجراء المعالجة المحلية، والذي يمنع الآثار الجانبية الجهازية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح علاج الأورام في مواقع حساسة (مثلا حول الأعصاب أو الأوعية الدموية). هنا، وهو intraoperatويعتبر تطبيق إيف من PDT في عظمية (OS)، ورم العظام، لاستهداف أقمار الورم الرئيسي خلفها الورم في الأنسجة المحيطة بعد استئصال الورم الجراحية. يهدف العلاج إلى تقليل عدد تكرار وإلى الحد من المخاطر ل(بعد عملية) ورم خبيث. في هذه الدراسة، فإننا نقدم في المختبر إجراءات PDT لإنشاء إعدادات PDT الأمثل لعلاج فعال من خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع OS التي تستخدم لإنتاج الأمراض التي تصيب البشر في نماذج الماوس OS intratibial راسخة. تم فحص امتصاص للPS mTHPC مع وأثار طيفي والضيائية مع ضوء الليزر الإثارة من mTHPC في 652 نانومتر للحث على موت الخلايا المقررة مع WST-1 فحص وفرز الخلايا على قيد الحياة. تقنيات إنشاء تمكننا من تحديد إعدادات PDT الأمثل للدراسات المستقبلية في النماذج الحيوانية. فهي أداة سهلة وسريعة لتقييم فعالية PDT <em&gt; في المختبر قبل تطبيق في الجسم الحي.

مع تقنيات ذكرت هنا، ونحن التحقيق PDT مقرها mTHPC في خلايا OS الإنسان. أولا، تم التحقيق في الوقت وامتصاص الجرعة تعتمد على mTHPC في ملتحقا النقيلي منخفضة والمنتشر في غاية خطوط الخلايا 143B OS. يمكن تقييم mTHPC امتصاص عن طريق قياس مضان من mTHPC مع معمل مضان (الشكل 2، مستنسخة بإذ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

بروتوكول ذكرت هنا يسمح تقييم فعالية العلاج الضوئي (PDT) في خطوط الخلايا وتعظيم الاستفادة من إعدادات PDT قبل تطبيق العلاج في النماذج الحيوانية.

السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية<em&gt; في المختبر</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

12.7K Views.  Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland.  بروتوكول ذكرت هنا يسمح تقييم فعالية العلاج الضوئي (PDT) في خطوط الخلايا وتعظيم الاستفادة من إعدادات PDT قبل تطبيق العلاج في النماذج الحيوانية. 

Video: Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

تحت الشبكية حقن المتجهات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في العين ماوس

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

في التخصيب في المختبر من خلايا سرطان المبيض-الشروع ورم

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

A طريقة لقياس أداء الطرف العلوي في الحياة اليومية عن طريق التسارع

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

نهج في المختبر للعلاج الضوئي

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

إعداد حبيبات غوشوكانغ (GSK) للتجارب في الجسم الحي وفي المختبر

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.