Les auteurs tiennent à remercier biolitec Research GmbH (Jena, Allemagne) d&#39;avoir bien voulu nous communiquer la formulation liposomale de mTHPC, avec des remerciements particuliers à Susanna Gräfe et Arno Wiehe pour leur aide et leur expertise technique. Nous tenons également à remercier Kerstin Reidy, qui a généré une grande partie des résultats et était coresponsable de sa publication 11. Ce travail a été soutenu par des subventions du Schweizerischer Verein Balgrist, l&#39;Université de Zurich, le Krebsliga Zurich ainsi que par une subvention de la Fondation Walter L. et loup Johanna, Zurich, Suisse et une subvention de EuroNanoMed ERA-NET / SNF suisse National Science Foundation 31NM30-131004/1. Ce travail a également été soutenu par le programme (très médecine spécialisée) de l&#39;appareil locomoteur oncologie du canton de Zurich HSM.

Une. Comparaison de l&#39;absorption de mTHPC dans le respectifs faible et très métastatique HOS et 143B OS lignées cellulaires <ol><li> Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du DMEM, Ham F12, et inactivé sérum de veau foetal de chaleur dans un rapport 4.5:4.5:1. Remarque: La formulation liposomale de la PS mTHPC a été dissous dans de l&#39;eau à une concentration finale de 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Plaque de 0,2 x 10 6 cellules HOS et 143B / puits dans des plaques 6 puits (triple pour chaque condition) et laissez les cellules adhèrent nuit. Remarque: le nombre doit être ajusté à des lignées de cellules individuelles. A une confluence de 80-90% est le plus approprié au moment de l&#39;expérience. </li><li> Le jour suivant, incuber les cellules avec une concentration fixe de mTHPC pour différentes périodes de temps (de l&#39;absorption en fonction du temps), ou avec des concentrations croissantes de mTHPC pendant une période de temps fixe (dose d&#39;absorption dépendant). </li><li> Incuber les cellules avec mTHPC pendant p spécifiqueoints ou concentrations de mTHPC. Nota: Dans cette étude, à la fois le HOS et les lignées de cellules 143B ont été mises en incubation avec 0,6 ug / ml mTHPC pendant 0, 2,5, 5, ou 10 heures, ou avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC pendant 5 heures. Les périodes de temps et les doses appliquées peuvent varier en fonction de la lignée cellulaire qui est utilisée. </li><li> Rappelez-vous de toujours travailler dans l&#39;obscurité ou dans des conditions de lumière tamisée pour éviter l&#39;exposition de la lumière directe des cellules. </li><li> Après incubation des cellules dans des conditions indiquées, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, détacher les cellules avec 0,5 ml de trypsine / EDTA et compter les cellules. </li><li> Après détachement, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans du PBS à une densité finale de 200 000 cellules / ml. </li><li> Introduire à la pipette 100 ul de la suspension cellulaire obtenue (soit 20 000 cellules) dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence de ces cellules dans un spectrophotomètre à fluorescence. Le paramètres pour les mesures de fluorescence sont mTHPC: 417 nm pour l&#39;excitation et 652 nm pour l&#39;émission. </li><li> Pour calculer la quantité de mTHPC intériorisée par cellule, normaliser l&#39;unité de fluorescence relative (RFU) pour le nombre de cellules et le volume des cellules de la manière suivante: </li><li> Préparer une courbe d&#39;étalonnage en utilisant des concentrations différentes de mTHPC dans du PBS 0-4 pg / ml (mesures en triple utilisation). Introduire à la pipette 100 ul de chaque dilution dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence des puits en utilisant les paramètres décrits dans l&#39;étape 1.6. </li><li> Diviser la RFU (obtenu pour 20 000 cellules) par la pente de la courbe d&#39;étalonnage linéaire de mTHPC, ce qui donne la concentration de mTHPC (en pg / ml) dans le puits. </li><li> Diviser cette concentration mTHPC par 10 pour obtenir le montant total de mTHPC dans un puits (en ug, soit 100 pi de suspension cellulaire) et diviser cette valeur par le volume de 20.000 cellules. </li><li> Calculer le volume de la formule pour une sphère: (4/3 x π) xr 3. Obtenir le rayon r en mesurant le diamètre de 20 cellules trypsinisées sous un microscope, et en divisant cette valeur par deux. </li><li> Enfin, normaliser toutes les valeurs à celles obtenues pour les cellules HOS après 10 h d&#39;incubation (dose d&#39;absorption dépendant) ou traitées avec 10 pg / ml mTHPC (absorption en fonction du temps), ce qui a été défini à 100%. </li></ol> 2. Mesure de la phototoxicité de PS In Vitro <ol><li> Fleurs 3000 cellules / puits dans une plaque de 96 puits (triple pour chaque concentration de mTHPC utilisés) et permettent de faire adhérer la nuit. Préparer même une plaque de 96 puits supplémentaires et de traiter les cellules comme décrit ci-dessous, puis les mettre de côté pour l&#39;imagerie de contraste de phase. Remarque: le nombre doit être ajusté pour chaque ligne de cellule individuelle. A une confluence de 50 à 60% au moment de l&#39;expérience est idéal. <ol><li> Gardez à l&#39;esprit pour ajouter le contrôle de toxicité dans l&#39;obscurité correspondant de cellules pour chacune des concentrations mTHPC. Lasoi sont des cellules qui seront incubés en l&#39;absence ou en présence de concentrations sélectionnées de mTHPC, mais ne sera pas allumé. </li></ol></li><li> Le jour suivant, incuber les cellules avec des concentrations différentes de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 et 10 pg / ml) en fonction des lignées cellulaires et les garder dans l&#39;obscurité pendant 5 heures. <ol><li> Reportez-vous à la section 1.3.2 Remarque: Le temps d&#39;incubation avant l&#39;illumination dépend de la lignée cellulaire et le PS utilisé, par conséquent, il est recommandé de tester des concentrations différentes et de différents points dans le temps dans des expériences séparées. </li></ol></li><li> Après incubation pendant la période indiquée, laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter de nouvelles du milieu frais sans mTHPC. </li><li> Éclairer les cellules avec une diode laser de 652 nm, spécifique pour le spectre d&#39;absorption mTHPC (voir la figure 1). <ol><li> Réglez le laser à 21.88 mW / cm 2 puissance à une hauteur de 13,5 cm distance à partir des cellules, afin d&#39;obtenir une dose d&#39;énergie de 5 J / cm 2. Éclairer les cellules pour 230 sec. Ne pas éclairer les cellules sombres de contrôle de la toxicité (avec et sans mTHPC). Remarque: Toujours porter des lunettes pour protéger les yeux de la lumière laser utilisée pour l&#39;excitation du PS. </li></ol></li><li> Après l&#39;illumination, maintenir les cellules dans l&#39;obscurité à 37 ° C pendant 24 heures. Par la suite, ajouter de l&#39;eau tétrazolium soluble (WST-1) réactif (10 μl/100 ul de milieu). </li><li> Trois heures après l&#39;addition du réactif WST-1, mesurer l&#39;absorbance de chaque puits de la plaque à 96 puits à 415 nm. </li><li> Afin de calculer le pourcentage de cellules survivantes, réglez la moyenne des valeurs obtenues pour les cellules non traitées mTHPC pour chaque condition à 100% (c.-à-éclairés, sans mTHPC et non éclairée, sans mTHPC). </li></ol> 3. Estimation du nombre de cellules par Comptage des cellules <ol><li> Semences cellules 20000 / nousll dans une plaque de 24 puits et permettent de faire adhérer la nuit. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 heures avec mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, et 1,25 pg / ml) et de les illuminer, comme décrit ci-dessus. </li><li> Recueillir le milieu, laver les cellules une fois avec du PBS, trypsiniser eux et à leur rassemblement par centrifugation à 400 g pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de milieu frais. </li><li> Compter les cellules dans une chambre de Neubauer. </li></ol>

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. 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Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt ou conflits d&#39;intérêts financiers concurrents.

Pour atteindre la cytotoxicité optimale en réponse à la PDT, il est essentiel de choisir les bons réglages de lumière laser et des temps d&#39;incubation. Les procédures décrites ici sont cohérentes et efficaces pour déterminer PS absorption et de quantifier la cytotoxicité induite par PDT in vitro. En utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;absorption spécifique de la PS mTHPC, l&#39;absorption cellulaire de PS peut être déterminée d&#39;une manière directe, et le PS peut être activé afin de ...

L&#39;état du traitement de l&#39;art de l&#39;ostéosarcome (OS) d&#39;aujourd&#39;hui, une tumeur osseuse primaire, englobe une combinaison de chimiothérapie néoadjuvante et chirurgie. Ce schéma de traitement a révélé une augmentation du taux de patients avec une maladie localisée à partir d&#39;environ 20% avant l&#39;utilisation de la chimiothérapie de survie, à ce moment entre 60 à 70% 3, 4. Cependant, dans les deux dernières décennies, la survie globale des patients atteints de la maladie d&#39;OS locale a atteint un plateau 4, 5. De plus, 30 à 40% de ces patients rechutent dans les 3 ans après le diagnostic et les patients avec une maladie métastatique continuer à avoir un faible taux de survie de 20 à 30% 4, 6, 7. Pour améliorer les résultats de ces patients, de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées. La thérapie photodynamique (PDT), un lieu nouveau traitement anticancéreux, utilise la lumière d&#39;une longueur d&#39;onde spécifique pour l&#39;excitation d&#39;un photosensibilisanttizer (PS), qui s&#39;accumule dans les cellules tumorales après son injection dans la circulation sanguine. La lumière laser d&#39;excitation de la PS génère des radicaux oxygène en présence d&#39;oxygène, qui induisent une réaction cytotoxique dans les cellules tumorales et la mort cellulaire. Outre ce mécanisme primaire, deux PDT supplémentaire évoquée processus biologiques contribuent à la croissance tumorale réduite: PDT provoque une vasoconstriction et la formation de thrombus de la microvascularisation de la tumeur et, par conséquent, l&#39;hypoxie et l&#39;anoxie locale à l&#39;intérieur de la tumeur, ce qui conduit à un infarctus d&#39;une tumeur. Enfin, PDT blessé et les cellules tumorales meurent déclencher une réponse immunitaire locale, une caractéristique assez unique de PDT. Il s&#39;agit du système du complément et l&#39;activation des cellules dendritiques présentatrices d&#39;antigène 8. Ainsi, des conditions sont créées pour la présentation des antigènes tumoraux avec l&#39;activation subséquente des cellules lymphoïdes, qui conduit à une immunité spécifique de la tumeur. Jusqu&#39;à présent, la PDT a été utilisé pour traiter plusieurs types de tumeurs des tissus mous et hyperplasie du, comme la kératose actinique, l&#39;oesophage de Barrett, une tumeur endobronchique, cancer de la vessie, des carcinomes baso-cellulaires, et le traitement palliatif du cancer tête et cou 2. Le traitement est connu pour provoquer, à grande échelle d&#39;une nécrose locale avec seulement peu d&#39;effets secondaires, et a donc le potentiel pour éliminer de manière sélective du tissu tumoral. Malgré ces avantages, l&#39;application de la PDT reste techniquement plus exigeant que l&#39;administration de médicaments chimiothérapeutiques. Afin d&#39;obtenir une efficacité maximale, la concentration en PS, le temps d&#39;exposition de lumière et de transfert de l&#39;énergie totale de la lumière doivent être optimisés. Cela peut être fait dans des expériences in vivo, mais, en raison du grand nombre relatif de paramètres qui doivent être optimisé, il est plus efficace de déterminer les conditions optimales d&#39;abord in vitro. Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons testé l&#39;efficacité in vitro de la PDT en utilisant le PS 5,10,15,20-tétrakis-(méta-hydroxyphényl) chlOrin, en abrégé mTHPC (figure 1A). mTHPC est la substance active dans le médicament Foscan, qui est actuellement utilisé en clinique pour le traitement palliatif du cancer tête et cou. Il est l&#39;un des plus puissants PS, induisant des lésions cellulaires massif déjà à de faibles concentrations, et il a été démontré pour être supérieur à l&#39;autre PS en termes de pénétration de tissu 9, 10. Son spectre d&#39;absorption de la lumière (Figure 1B) montre deux pics importants, l&#39;un à 417 nm et une seconde à 652 nm, qui sont utilisés pour la localisation tissulaire de PS et d&#39;accumulation pour la PDT induction, respectivement. Actuellement, une formulation liposomale pour mTHPC est en cours de développement. Ici, nous décrivons les procédures de quantifier l&#39;absorption de cette formulation liposomale, et pour effectuer des PDT dans deux lignées de cellules humaines OS, le faible HOS métastatique et les cellules métastatiques 143B élevés. Certaines des données présentées ici ont été signalés plus tôt 11. Thapproche e décrit ici nous permet d&#39;étudier l&#39;effet d&#39;un phénotype métastatique sur PDT efficacité. Cellules 143B, orthotopiquement injectés dans les membres postérieurs des souris SCID immunodéficientes provoquent des métastases des tumeurs primaires intratibial, un modèle imitant de près la maladie de métastases humaine. Ainsi, les expériences proposées in vitro sont parfaitement adaptés pour évaluer les paramètres optimaux PDT pour être utilisés plus tard dans des expériences in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

Au cours des dernières années, on a observé la difficulté de trouver des traitements plus efficaces contre le cancer avec moins d&#39;effets secondaires systémiques. Par conséquent thérapie photodynamique est une nouvelle approche pour un traitement sélectif plus de tumeur. La thérapie photodynamique (PDT) qui rend l&#39;utilisation d&#39;un photosensibilisateur non toxique (PS), qui, lors de l&#39;activation avec de la lumière d&#39;une longueur d&#39;onde spécifique en présence d&#39;oxygène, génère des radicaux oxygène qui suscitent une réponse cytotoxique 1. Malgré son approbation il ya près de vingt ans par la FDA, PDT n&#39;est plus utilisé que pour traiter un nombre limité de types (de la peau, de la vessie) et les maladies nononcological (psoriasis, la kératose actinique) 2 cancer. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation de la PDT est la capacité à effectuer un traitement local, ce qui empêche les effets secondaires systémiques. En outre, il permet le traitement de tumeurs sur des sites sensibles (par exemple autour des nerfs ou des vaisseaux sanguins). Ici, un intraoperative demande de PDT est considéré dans l&#39;ostéosarcome (OS), une tumeur de la moelle, à une cible, les satellites de la tumeur primaire a laissé la tumeur dans les tissus environnants après la résection chirurgicale de la tumeur. Le traitement vise à diminuer le nombre de récidives et à réduire le risque de (post-opératoire) métastase. Dans la présente étude, nous présentons in vitro procédures PDT à établir les paramètres PDT optimales pour un traitement efficace de lignées cellulaires OS largement utilisés qui sont utilisés pour reproduire la maladie chez l&#39;homme dans les modèles de souris OS intratibial bien établies. L&#39;absorption de la PS mTHPC a été examiné avec un spectrophotomètre et la phototoxicité a été provoqué par une lumière laser excitation de mTHPC à 652 nm pour induire la mort cellulaire évaluée par un test WST-1 et par le comptage des cellules survivantes. Les techniques établies nous permettent de définir les paramètres optimaux PDT pour de futures études sur des modèles animaux. Ils sont un outil simple et rapide pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de la TPD <em&gt; In vitro avant une application in vivo.

Avec les techniques ici rapportés, nous avons étudié PDT à base de mTHPC dans les cellules du système d&#39;exploitation de l&#39;homme. En premier lieu, l&#39;heure et la dose d&#39;absorption dépendant mTHPC a été étudiée dans le bas HOS métastatique et dans les lignées cellulaires hautement métastatiques 143B OS. mTHPC absorption peut être évaluée en mesurant la fluorescence de mTHPC avec un spectrophotomètre de fluorescence (figure 2, reproduite avec la permission de Reidy et al...

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Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Le protocole présenté ici permet l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) dans des lignées cellulaires et l&#39;optimisation des paramètres de PDT avant l&#39;application de la thérapie chez des modèles animaux.

Cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

12.7K vues.  Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland.  Le protocole présenté ici permet l'évaluation de l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) dans des lignées cellulaires et l'optimisation des paramètres de PDT avant l'application de la thérapie chez des modèles animaux. 

Vidéo: Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Médecine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Dans l&#39;Enrichissement vitro du cancer des ovaires cellules initiatrices de tumeurs

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des aimanté miR-modifié cellules endothéliales

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Une méthode de quantification des performances du membre supérieur dans la vie quotidienne utilisant des accéléromètres

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

Une approche In Vitro à la thérapie photodynamique

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Préparation des granules de Gushukang (GSK) pour les expériences in vivo et in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.