وأيد TLW من قبل زمالة ماري كوري الدولية الواردة. وقد تم تمويل هذا العمل أيضا من التمويل المؤسسية الأساسية، Bundesministerium الفراء Bildung وForschung (BMBF) والتمويل جزئيا بدعم من برنامج البحوث ذات الأولوية (SFB) 655 لGK. فإن الكتاب أود أن أشكر آن Karasinsky للرعاية وصيانة جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وأوديت ليتر، سوزان Ruhwald، فاني بوهمه، وريتشارد يتزيل لزراعة الخلايا والمساعدة المجهري.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2-responsive+neuronal+progenitors+reside+in+proliferative+and+quiescent+regions+of+the+adult+rodent+brain.">FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain.</a> Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).</li><li>Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+precursor+cells+and+neuroblasts+from+embryonic+and+adult+central+nervous+system.">Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system.</a> Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).</li><li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells:+morphological+and+ultrastructural+characterization.">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Res. 993, 18-29 (2003).</li><li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons.">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+and+nonclonal+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells.</a> Stem Cells. 25, 871-874 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).</li><li>Freund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+individuality+in+genetically+identical+mice.">Emergence of individuality in genetically identical mice.</a> Science. 340, 756-759 (2013).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-+re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+stem+cell+population+is+retained+in+the+hippocampus+of+transgenic+Huntington's+disease+mice+but+not+wild-type+mice.">The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+stimulates+precursor+cells+in+the+adult+mouse+hippocampus.">Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+stem+and+progenitor+cells+in+the+hippocampus+are+activated+by+neural+excitation.">Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation.</a> J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin-1+allows+prospective+isolation+of+neural+stem+cells+from+the+adult+murine+hippocampus.">Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus.</a> J. Neurosci. 33, (2013).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Babu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+enriched+monolayer+cultivation+of+neural+precursor+cells+from+mouse+dentate+gyrus.">A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus.</a> Front. Neurosci. 5, 89 (2011).</li><li>Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+molecular+identity+of+cells+in+the+adult+subventricular+zone+in+vivo+and+after+expansion+in+vitro.">Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تعرض هذه الورقة بروتوكول مفصلة لبدء الثقافات السلائف العصبية، سواء الطبقات الوحيدة ملتصقة كما وneurospheres، من المنطقتين العصبية الرئيسية في مخ الفأر الكبار. هناك عدد من النقاط الهامة التي يجب أن يوضع في الاعتبار عند محاولة أي من هذه النظم في المختبر الثقافة. أولا، اختيار أسلوب التفكك مهم جدا وتعتمد الأنسجة. في أيدينا، 0.05٪ التربسين EDTA-فعالة جدا لتفكك النسيج SVZ، والنتائج في عدد أكبر من neurospheres من عند استخدام تقنية التفكك القائم على غراء. لتفكك النسيج DG ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة نهج التفكك القائم على غراء. عند مقارنة مباشرة الأساليب تفارق اثنين على الأنسجة DG، لاحظنا العائد أقل بكثير من خلايا قابلة للحياة، وحوالي 10 أضعاف أقل neurospheres عند استخدام التربسين. هذا الاختلاف في التفكك يمكن أن يكون راجعا إلى الاختلاف في الأنسجة compositioن بين المنطقتين. وتحيط الأنسجة المدمجة التابعة للإدارة العامة من قبل neuropil واسعة ويمكن أن تحدث أضرار واسعة النطاق من خلال العمليات الخلوية التفكك. والنقطة الثانية الهامة هو أن نلاحظ أنه في حين أن الفحص neurosphere يمكن أن تكون مفيدة في الإدلاء ببيانات كمية عن عدد الخلايا السلائف موجودة في عينة نسيج معين، يجب، مع ذلك، أن تستخدم بعض الحذر في تفسير هذه الأرقام المطلقة. انصهار neurospheres يمكن أن يكون عاملا رئيسيا التباس. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا العصبية هي متحركة للغاية ويمكن أن تندمج، حتى في ظل ما من المفترض أن تكون الظروف &#39;النسيلي&#39; 7،19. تردد neurosphere الناتجة يمكن أن تكون تعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل بما في ذلك مكونات المتوسطة، وإجراء تشريح وعملية التفكك. حتى بين معالجات خبرة بعض الاختلاف في عدد neurospheres المتولدة من العينات متطابقة يفترض هو واضح (انظر الشكل 1A.) أكثر فائدة، هو المقارنة المباشرة من وتيرة السلائف بين عينتين معين (أي سيطرة مقابل معاملة أو من النوع البري مقابل خروج المغلوب) التي تمت معالجتها بواسطة نفس الشخص في تجربة واحدة، بدلا من بيان الكمي من مجموع عدد الخلايا السلائف. عند البت فيها الطرق الثقافة الاثنين هو الأكثر ملاءمة لإجراء تجربة معينة فمن المهم أن نلاحظ أن هذه الأنظمة ثقافة اثنين تختلف في تجانس أنواع الخلايا المتولدة. بالمقارنة مع تكاثر الخلايا الملتصقة الثقافات، والتي تظهر على تجمع الخلايا السلائف متجانسة إلى حد ما (~ 98٪ من الخلايا هي Sox2 +) 20، neurospheres أكثر غير متجانسة وتحتوي، فضلا عن تكاثر الخلايا السلائف، الخلايا العصبية متباينة، والخلايا النجمية 21،22. من المهم أن neurospheres ليست مثقف لفترات طويلة بين المقاطع كما أكبر neurosphere تصبح الأرجح هو أن تجد أنواع الخلايا المتمايزة في جوهرها. نبدأ عادة ملتصقة أحادي الطبقة الثقافات السلائف العصبية من الأنسجة DG ما بين 5-8 الفئران. لذلك، عند محاولة إنشاء الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة من DG أو SVZ من ماوس واحدة، يحتاج الرعاية القصوى التي يجب اتخاذها أثناء إجراء تفارق الأنسجة من أجل تجنب موت الخلايا المفرطة الناجمة عن أكثر من الطحن من الأنسجة، أو أخذ تمديد الفترات الزمنية بين تشريح وخطوات زراعة النهائي. يصف هذا البروتوكول، للمرة الأولى، جيل من الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة السلائف من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية. هناك العديد من الحالات عندما يحتاج المقارنة بين انتشار السلائف والتمايز إلى أن يتم على أساس حيوان واحد. وتشمل هذه القدرة على مقارنة مباشرة للإدارة العامة لوSVZ الحيوانات الفردية المقترنة باستخدام الإحصاءات والبيانات لإقران الثقافة مع البيانات السلوكية أو الفسيولوجية الفردية 9. ثقافات حيوان واحد أيضا:انخفاض استخدام الحيوانات النادرة المعدلة وراثيا، حيث مجموعة من المانحين 5-8 في ثقافة مطابقة سن غير ممكن، وكذلك الحيوانات الفريدة (مثل الصلبان F2 أو الحيوانات المرباة خارج) لجمعية دراسات الجينية.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 &#181;g/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 &#181;g/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 &#181;g/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 &#181;m sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 &#181;l growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 &#181;l Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 &#181;l growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 &#181;l/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 &#181;l of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 &#181;l of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 &#181;l containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 &#181;m.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does the Figure 1 description in Results.

Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

مقايسة neurosphere 1،2 و ثقافة أحادي الطبقة ملتصقة 3،4، كل من البلدان المتقدمة في 1990s في وقت مبكر، لا يزال المعيار الذهبي في المختبر فحوصات الخلايا الجذعية العصبية. في هذه المقايسات، الأنسجة الابتدائي الجزئي تشريح الدماغ من منطقة معينة، نأت الى تعليق خلية واحدة والمثقف في وجود عامل نمو البشرة mitogens (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية-2 (FGF2) لتشكيل إما مجانا العائمة مجموعات (neurospheres) أو الطبقات الوحيدة ملتصقة. كلا النظامين لديها وينبغي إيلاء عدد من مزايا وعيوب ودراسة متأنية للمسألة التي يتعين معالجتها قبل اختيار واحد أو نظام آخر. Neurospheres تسمح لقراءة واضحة للخروج من الخلافات في عدد الخلايا السلائف والمحتملين. بالإضافة إلى ذلك، neurospheres هي أيضا أداة مفيدة لدراسة المواصفات الذاتية للخلايا عند إزالتها من البيئة الخارجية العادية. Extrinالعظة كذا يمكن دراستها ببساطة عن طريق إضافة عامل تهم متوسطة النمو وتحديد عدد وحجم neurospheres المتولدة. العيب الرئيسي من neurospheres ومع ذلك، هو أنها تشكل مكانة خاصة بهم، مع الخلايا في وسط neurospheres (neurospheres كبيرة على وجه الخصوص) كونها أكثر تمايزا من تلك التي على السطح 5. Neurospheres تحتوي على مزيج من الخلايا الجذعية، التي ارتكبت الأسلاف، وخلايا متباينة، والتفاعلات خلية خلية داخل neurospheres مواجهة صيانة الخلايا الجذعية. هذا هو السبب في neurospheres تحتوي إلا على عدد قليل من الخلايا الجذعية صحيح 6-8. الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أيضا توفير نظام جيد في المختبر إلى نموذج في انتشار الجسم الحي. يمكن الثقافات ملتصقة، في الخلايا التي تبقى أكثر عزلة ومتجانسة، والقضاء على الطبيعة غير المتجانسة للneurosphere. في ظل هذه الظروف نمو الخلايا السلائف تتكاثر RAPIDLY والخلايا كلها تقريبا يتم تقسيم والتعبير عن علامات مميزة السلائف العصبية Nestin، Sox2، وBLBP. والعيب الرئيسي لنظام أحادي الطبقة الثقافة مقارنة مع مقايسة neurosphere هو أن الحيوانات المستنسخة الفردية المستمدة من السلائف غير قادرين على رصد وكميا. وكان من العيب معظم بروتوكولات لكلا النوعين من الثقافات ضرورة لاستخدام أعداد كبيرة نسبيا من الحيوانات، لأن العائد من استراتيجيات العزلة كثيرا ما كان الفقراء. في نفس الوقت، فقد أصبح من الواضح أن تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في تفريد الدماغ 9، مما أدى إلى ضرورة فردية فيفو السابقين النماذج كذلك. هذه الاحتياجات يمكن تلبيتها عن طريق بروتوكولات &quot;الفأر واحد، ثقافة واحدة&quot; كما هو موضح في هذا التقرير. يصف بروتوكول البصرية التالية جيل في وقت واحد من الثقافات السلائف العصبية من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية إما ملتصقة مonolayers أو كما neurospheres. الجيل الثقافات من الحيوانات الفردية مفيد بشكل خاص عندما يتطلب الأمر مقارنات بين الحيوانات المعالجة بشكل فردي أو المعدلة وراثيا مختلف الفردية أو البرية من نوع الفئران. ويشمل هذا البروتوكول تعليمات مفصلة للتسليخ مجهري في وقت واحد من المناطق SVZ وDG من الفئران الكبار، تفارق بهم في تعليق خلية واحدة، والثقافة في المختبر إما الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أو neurospheres وتحليل multipotentiality والمحتملة على المدى الطويل، الكاردينال اثنين خصائص الخلايا الجذعية النية العظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

مقايسة neurosphere ونظام الثقافة أحادي الطبقة ملتصقة هي أدوات قيمة لتحديد إمكانية (الانتشار أو تمايز) من الكبار الخلايا الجذعية العصبية في المختبر. هذه المقايسات يمكن استخدامها لمقارنة المحتملة السلائف الخلايا المعزولة من مختلف وراثيا أو المعالجة بشكل مختلف الحيوانات لتحديد تأثير العوامل الخارجية على تكاثر الخلايا العصبية السلائف والتمايز والعصبية لتوليد خطوط الخلايا السلائف التي يمكن أن يعاير أكثر المقاطع المستمر. يتم استخدام مقايسة neurosphere تقليديا لتحديد بعد خاص من الخلايا الجذعية، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود علامات نهائية مع التي يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة الأولية ولديه ميزة كبيرة لإعطاء تقدير الآن من أعداد الخلايا السلائف في أنسجة المخ المشتقة من الحيوانات الفردية. الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة، في المقابل، لا تستخدم عادة للمقارنة بين انتشار الحيوانات الفردية، كما بدأت كل ثقافة عموما من النسيج مجتمعة بين 5-8 حيوانات. ومع ذلك، لديهم ميزة كبيرة أنه، خلافا neurospheres، أنها تتكون من مجموعة من السكان معظمهم متجانسة من الخلايا السلائف ومفيدة لمتابعة عملية التمايز في الخلايا واحدة. هنا، نحن تصف، بالتفصيل، وجيل من الثقافات neurosphere و، لأول مرة، والثقافات ملتصقة من الحيوانات الفردية. وهذا له العديد من الآثار الهامة بما في ذلك تحليل يقترن الانتشار و / أو المحتملة التمايز في كل من منطقة subventricular (SVZ) والتلفيف المسنن (DG) من خطوط الماوس أو معاملة مختلفة وراثيا، فضلا عن خفض كبير في استخدام الحيوان.

على الرغم من أن المنطقتين العصبية للدماغ الفأر الكبار على حد سواء تحتوي على خلايا العصبية السلائف، ويمكن لهذه الخلايا تتصرف بشكل مختلف تماما عند تربيتها في المختبر. تظهر الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة المتولدة من كلتا المنطقتين يمكن تمييزها شكليا (الشكل 1A)، ومع ذلك، فإن الثقافات ملتصقة SVZ مشتقة تتكاثر بشكل أسرع وتحتاج إلى passaged، في المتوسط، في وقت سابق من 1-2 أيام من تلك المستمدة من DG. كما neurospheres، والخلايا السلائف SVZ مشتقة أيضا تتكاثر بشكل أسرع وأكبر تشكيل neurospheres (الشكل 1B) من الخلايا السلائف DG-مشتقة (الشكل 1C). في حين neurospheres SVZ المستمدة من عادة تحسب بعد 6-7 أيام في الثقافة، وعادة ما تكون كميا neurospheres DG-مشتقة بعد 10-12 يوما. بالإضافة إلى ذلك، عددا أكبر بكثير من الخلايا العصبية السلائف يقيمون في SVZ مقارنة DG، كما يتضح من عدد ما يقرب من 10 أضعاف أكبر من neurospheres التي يمكن أن تكون جنساتيد من هذه المنطقة (SVZ: 1،173 ± 74.9 مقابل DG: 145.3 ± 26.4، P = &lt;0.0001، ن = 10 الحيوانات لكل مجموعة؛ الشكل 2A). وقد أظهرت الدراسات أن خلايا السلائف داخل SVZ وDG الرد على محفزات مختلفة. يتم تنشيط الخلايا السلائف في المديرية العامة عن طريق أنواع معينة من التعلم المكاني والمنبهات مثل تخصيب البيئية والنشاط البدني، في حين يتم تنشيط الخلايا السلائف SVZ عن طريق التعلم عن حاسة الشم وحاسة الشم تخصيب. واتساقا مع ذلك، واحد منا (TLW) أظهرت في وقت سابق ان DG يحتوي على عدد سكانها الجذعية الكامنة والخلايا الاصلية التي يمكن تفعيلها من خلال الإثارة العصبية 15-18. في المقابل، وجدنا أن الخلايا السلائف SVZ تستجيب بشكل مختلف تماما لهذا الحافز، مع انخفاض في عدد neurosphere ردا على إزالة إستقطاب مستويات بوكل 17. هنا، ونحن قد تتكرر هذه التجربة، والطلاء نصف الخلايا المعزولة المستمدة من SVZ والمديرية العامة لدائرة الهجرة والجنسيةividual الحيوانات في إزالة إستقطاب مستويات بوكل، والنصف الآخر في السيطرة مستويات بوكل. علينا أن نبرهن، كما سبق، أنه في حين يتم تنشيط الخلايا السلائف DG بواسطة الاستقطاب (101.2 ± 17.4 مقابل 184.8 ± 12.5، ص = 0.005، ن = 5 الحيوانات)، وانتشار الخلايا المشتقة من SVZ هو في الواقع انخفضت بشكل ملحوظ ( 368.0 ± 62.9 مقابل 266.6 ± 41.6، ص = 0.02، ن = 5 الحيوانات؛ الشكل 2B). لتأكيد المحتملة على المدى الطويل، واحدة من السمات الأساسية للخلية الجذعية صحيح، neurospheres واحد أو الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة يجب أن تكون قادرة على التوسع طويلة أي أكثر من 10 على الأقل الممرات. في كل ممر، وبعد إعداد تعليق خلية واحدة، يتم حساب عدد الخلايا ويتم احتساب التوسع أضعاف. ثم يتم احتساب مجموع الخلية النظري بضرب التوسع أضعاف خلال تلك مرور على مجموع النظرية من مرور السابقة. هذا هو DISP<html> الأصغر حجما مثل رسم بياني خط مع عدد مرور تآمر ضد LOG10 من إجمالي عدد الخلايا النظرية (انظر المثال الشكل 3). لتأكيد multipotentiality، سواء الثقافات أحادي الطبقة وneurospheres يمكن تفريقها mitogen الانسحاب وأن تظهر لتؤدي إلى كل من الخلايا العصبية، والخلايا الدبقية (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> . الرقم 1 الماوس خلايا السلائف الكبار يمكن تربيتها، لأن الحضارات أحادي الطبقة ملتصقة (A) أو كما neurospheres (B: SVZ، C: DG). شريط مقياس هو 50 ملم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. بشكل ملحوظ يتم إنشاء أكثر من neurospheres SVZ مقارنة DG من الفئران واحدة (A). الخلايا السلائف SVZ وDG تستجيب بشكل مختلف لإزالة الاستقطاب في المختبر (B). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> الرقم 3. لتأكيد التقوية على المدى الطويل، يتم توسيع neurospheres لأكثر من 10 المقاطع. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> الشكل 4. يمكن أن تكون متباينة في Neurospheres bIII-الأنبوبةلين + الخلايا العصبية (A: أحمر)، GFAP + الخلايا النجمية (A: الأخضر)، O4 + قليلة التغصن (B: أحمر) وMap2ab + الخلايا العصبية (C: أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للجيل في وقت واحد من مزارع الخلايا العصبية السلائف، إما الطبقات الوحيدة ملتصقة أو neurospheres، من منطقة subventricular والتلفيف المسنن من الفئران الكبار الفردية.

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

one-mouse-two-cultures-isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

37.3K Views.  Technische Universität Dresden.  نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للجيل في وقت واحد من مزارع الخلايا العصبية السلائف، إما الطبقات الوحيدة ملتصقة أو neurospheres، من منطقة subventricular والتلفيف المسنن من الفئران الكبار الفردية. 

Video: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...