الهدف من هذا البروتوكول الفيديو هو إنشاء بروتوكول المصدر وفعالة لجنينية ماوس العصبية الجذعية العزل والثقافة. مرحباً، أنا مريم صادقي زاده. أنا طالب ماجستير في علم الأحياء الخلوية والجزيئية في معهد رويان.
اليوم أنا وزميلي نريد أن تظهر لك كيفية حصاد الخلايا الجذعية العصبية من 13 الجنين الماوس الماوس سماحة العقد. مرحباً، أنا "بهارير عليزاده-شورجستان". أنا طالب ماجستير في علم الأحياء الخلوية والجزيئية في قسم الخلايا الجذعية في معهد رويان للتكنولوجيا الحيوية.
مرحباً، أنا رضا دهقاني- فارنامخاستي. كما أنني أدرس البيولوجيا الخلوية والجزيئية في معهد رويان. وتشمل العمليات الجراحية حصاد كل 13 جنين فأر من الرحم.
قطع الجزء الأمامي من فونتانيل من الجنين مع طرف إبرة عازمة استخراج الدماغ من الجمجمة. تشريح الدماغ المعزول لجني الهجنة. تفكك الأنسجة المحصودة في خلية جذعية عصبية متوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة.
وأخيرا، خلايا الطلاء في ثقافة تعليق لتوليد الخلايا العصبية. تنظيف وتطهير الجلد من منطقة البطن عن طريق الرش مع 70٪ الإيثانول. السيطرة على الجلد إلى أعلى البطن ومن ثم قطع الجلد و تحتها الوجه مع مقص للكشف عن تجويف البطن وقرون الرحم.
إزالة قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة عن طريق مقص ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل الباردة HEPES MEM العازلة. ضع الأنبوب المخروطي تحت غطاء تدفق اللامين. افتح الغطاء تحت غطاء السيارة.
جلب قرون الرحم من الأنبوب، وشطف ثلاث مرات مع حجم كاف من الباردة الطازجة HEPES MEM العازلة للقضاء على الحطام والدم. نقل أنسجة الرحم إلى طبق بتري 10 سم تحتوي على 7 إلى 10 مل الباردة HEPES MEM العازلة. فتح قرون الرحم باستخدام مقص غرامة ونقل الأجنة إلى طبق جديد يحتوي على 7 إلى 10 مل من الباردة HEPES MEM العازلة.
الآن ضع طبق 10 سم مع الأجنة تحت المجهر تشريح لعملية تشريح الدقيقة. ثني غيض من إبرة حقنة عن طريق دفع طرفها على مقبض شفرة مشرط الصلب. ثني طرف الإبرة حتى يتم عازمة على طرف في زاوية من 70 إلى 90 درجة.
تحقق من طرف الإبرة تحت المجهر تشريح لرؤية الانحناء في طرف الإبرة. وبطبيعة الحال الأجنة لها موقف الجانبي في هذا. دون تغيير موقفهم، عقد الرقبة والجسم من الجنين مع ملقط غرامة ومن ثم إدراج الجزء عازمة من الإبرة في عمق الجزء الأمامي من fontanel من رأس الجنين.
سيكون هناك نزيف صغير أو جلطة دموية هناك. حرك طرف الإبرة بشكل سطحي بينما الجزء المنحني داخل الانتفاخ نحو الجبهة ثم نحو مؤخرة الرأس. تأكد من قطع الجلد والجمجمة، وعدم تلف الدماغ الكامنة.
دفع الجلد مع طرف إبرة بشكلٍ مُنَمَرِيًا لكشف الدماغ. أدخل الإبرة من الجانب الجانبي للجلد إلى أسفل الإطار من الجانب الجانبي للجلد إلى المنطقة الواقعة تحت الدماغ. ثم قم بإزالة الدماغ من فروة الرأس هذه عن طريق دفعه للخروج من الجمجمة المتشَقِخة.
تظهر سماحة العقد بوضوح في الفيديو مع أجزائها الوسيطة والمئيمة. عقد الدماغ ثابت باستخدام ملقط الرعاية ومن ثم استخدام microscissors لقطع قشرة كل نصف الكرة الأرضية لفضح سماحة العقدة. عقد الدماغ والمكان تشريح سماحة العقدية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل التي تحتوي على وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية.
كرر هذا الإجراء حتى يتم تشريح جميع الدماغ الجزئي. قطع تشريح الانسة العقدية عن طريق وضع طرف ماصة ضد الجزء السفلي من الأنبوب وماصة تعليق صعودا وهبوطا لمدة 2 5 مرات لتفريق الأنسجة للحصول على تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي تعليق في 110 غرام لمدة 5 دقائق.
إزالة فائقة و resuspend الخلايا في 1 مل من 0.05٪ أنبوب في EDTA. احتضان تعليق الخلية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم إضافة حجم مكافئ من مثبطات التربسين فول الصويا لوقف نشاط التربسين.
Pipette تعليق الخلية صعودا وهبوطا للتأكد من أن التربسين قد تم تعطيل تماما. الطرد المركزي تعليق الخلية في 110 غرام لمدة 5 دقائق. إزالة فائقة و resuspend الخلايا في 1 مل من الخلايا الجذعية العصبية كاملة المتوسطة وعدد عدد الخلايا.
لوحة الخلايا في الخلايا الجذعية العصبية المتوسطة في حجم مناسب زراعة النسيج قارورة. نقل 5 مل من 2T25، 20 مل إلى T75، و 40 مل إلى قارورة T175. ستظهر القطاعات العصبية بعد 3 أيام من الاستزراع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
وامتصاص الاستزراع العصبي، نقل الوسيلة ذات الفوفيرات العصبية المعلقة إلى جهاز الطرد المركزي إلى جهاز طرد مركزي عند 110 غ لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من المكبر. في 1 مل من 0.05٪ تريبسين EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تعطيل التربسين باستخدام مثبطات التيروبسين الصويا والماصات في الخلايا العصبية بلطف صعودا وهبوطا لجعلها خلايا واحدة.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 110 غرام لمدة 5 دقائق. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في 1 مل من الخلايا الجذعية العصبية المتوسطة. هذه الخلايا جاهزة لثقافة الخطوة التالية أو الثقافة على سطح صفح ومغلفة بالكامل لإجراء تجارب متقدمة.
من خلال زراعة مليون خلية جذعية عصبية أولية بعد سبعة أيام، سيزداد عدد الخلايا إلى ثلاثة إلى أربعة ملايين. بعد ستة إلى سبعة أيام يجب أن تقيس المجالات ما بين 150 إلى 200 ميكرومتر في القطر وستكون جاهزة للثقافة الفرعية على الأطباق المغلفة بولي أو نيثين في غياب bFGF وEGF للتمايز العصبي. تظهر نتائج قياس التدفق للخلايا أن ما يقرب من 95٪ من الخلايا التي تشكل الخلايا العصبية كانت إيجابية Nestin وهو علامة معروفة للخلايا الجذعية العصبية.
الاختبارات باستخدام بيتا tubulin الثالث و ganglio الأجسام المضادة للبروتين الليفي تكشف عن أنه من خلال زراعة الخلايا الجذعية العصبية على سطح المغلفة حول 94٪ يظهر النمط الظاهري العصبي وحوالي 5٪ تظهر النمط الظاهري الدالسي. في هذا الفيديو القصير فقط تقنية مختبر للعزل السريع للخلايا الجذعية العصبية من 13 وسمية جانج الجنين الماوس. آمل أن تكون ناجحاً في ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بك.
