This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.

1. إعداد الحاد الحصين شرائح من دماغ الفئران الكبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع isoflurane. تنبيه: تنفيذ الإجراء باستخدام exicator مغلق، لا يستنشق الأيزوفلورين. تأكد من أن الحيوان هو تخدير تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفئران، وسرعان ما عزل الدماغ، وتزج به في precarbonated (95٪ O 2/5٪ CO 2 خليط الغاز) الجليد الباردة حل Gey في (تكوين في ملي: 130 كلوريد الصوديوم، و 4.9 بوكل، 1.5 CaCl 2 · 2H 2 O 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O، 11 MgCl 2 · 6H 2 O، 0.23 KH 2 PO 4، 0.8 نا 2 هبو 4 · 7H 2 O، 5 الجلوكوز · H 2 O، 25 HEPES، 22 NaHCO 3، ودرجة الحموضة 7.32) لمدة 30 دقيقة 1،2،10،16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المخيخ وجزء من القشرة المخية الأنفية الداخلية. فصل نصفي الكرة الأرضية القشرية مع خفض منتصف السهمي، ثم وضع كل نصف الكرة أسفل على سطحه وسطي. جعل بعد ذلكو50-70 ° قطع (50-70 درجة عرضية) على طول حافة الظهرية كل نصف الكرة 13،14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء كل نصف الكرة مع سطح قطع طازجة على منصة تشريح للنظام باجتزاء. يجب تغطية منصة بواسطة precarbogenated حل Gey في الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 350 ميكرون 50-70 ° شرائح عرضية من الجانب الأمامي إلى الخلفي باستخدام vibratome تعديلها للحد من محور ض التذبذب. سوف تشكيل الحصين، والقشور مرفدي المخية الأنفية الداخلية، فضلا عن القشور التي تقع ظهراني جانبي لالحصين أن تكون جزءا من شرائح المستخدمة في التجارب 13،14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شرائح الحصين إلى U-شكل والمغمورة نوع الحاضنة واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة عند 32 درجة مئوية مع carbogenated السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF يحتوي في ملي: 110 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2.5 CaCl 2 · 2H 2 O، 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O، 1.24 KH 2 PO 4، 10 الجلوكوز · H 2O، 27.4 NaHCO 3، ودرجة الحموضة 7.3) 1،2،10،16. </li></ol> 2. وضعية أقطاب، الاساس تسجيل، وتحريض LTP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شريحة الحصين إلى الغرفة المغمورة نوع تسجيل شنت تحت المجهر. يروي (6-7 مل / دقيقة) مع ACSF carbogenated لا يقل عن 30 دقيقة في 32 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الميكروية الشعرية زجاجية مملوءة ACSF (المقاومة هي غيض MΩ 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الميكروية زجاجية مملوءة ACSF في الألياف CA1 شافر-ضمانات لتحفيز وفي المشععة CA1 الطبقة لfEPSP تسجيل 1،2،10 (الشكل 2). المسافة بين الأقطاب يجب أن يكون حوالي 300 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استحضار الحقل مثير بعد المشبكي إمكانيات (fEPSPs) من خلال تحفيز ألياف شافر-ضمانات مع نبضات الحالية مستطيلة ثنائية الطور (200 ميللي ثانية / قطبية) في مجموعة من 3-4 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء أقصى اختبار التحفيز عن طريق قياس INPالعلاقة التحرير والمخرجات وتحدد قوة التحفيز إلى 40٪ من القيم fEPSP المنحدر القصوى التي تم الحصول عليها وابقائها ثابتة طوال التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تسجيل خط الأساس لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد أقصى اختبار التحفيز. قياس الاستجابات لاختبار محفزات كل دقيقة في كافة مراحل التجربة. أداء التسجيلات الأساسية مع التحفيز التردد المنخفض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل خط الأساس لمدة 30 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقت متأخر من LTP تحريض تطبيق عالية التردد 100 هرتز تكزيز تتألف من ثلاثة قطارات التحفيز 1 ثانية عند 100 هرتز مع فاصل زمني intertrain 5 دقائق. لزيادة مجال التحفيز داخل المنطقة CA1 5 ميكرومتر bicuculline يمكن غسلها في 2 دقيقة قبل تكزيز ويجب غسلها على الفور بعد تكزيز الماضية. </li></ol> 3. جمع شرائح بعد تحريض LTP والتقط التجميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توقف LTP تسجيل 2 دقيقة أو 30 دقيقة بعد ثلاثة قطارات من التحفيز كزازي حمل في وقت متأخر من LTP. </li><lط&gt; إزالة الأقطاب وسرعة نقل شريحة في الصعود إلى منصة معدنية precold وضعت على الثلج الجاف. كرر الإجراء لشريحة تحكم يوضع في حاضنة على شكل حرف U. تنبيه: استخدام القفازات أثناء العمل مع الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل شريحة في أنبوب 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol> 4. عزل المخصب الكسور النووية من المنطقة CA1 من الحصين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ 1.5 مل أنابيب إيبندورف مع شرائح المجمدة من -80 ° C والاحتفاظ بها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من TBS العازلة التي تحتوي على الأنزيم البروتيني الطازجة الباردة (PI) والفوسفاتيز (PS) مثبطات، في أنبوب. احتضان لمدة 2-3 دقيقة ونقل إلى stereomicroscope. تنبيه: استخدام القفازات الواقية ومعطف المختبر بينما كان يعمل مع PI وPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح المنطقة الهرمية CA1 من الطبقة الحصين باستخدام اثنين من الإبر. استخدام إبرة واحدة لعقد شريحة تحت stereomicroscope والإبرة الثانية لقطع المنطقة CA1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع CA تشريح1 مناطق من 5 شرائح (لكل مجموعة) في أنبوب جديد 1.5 مل تحتوي على 50 ميكرولتر تحلل العازلة (1X منخفض التوتر تحلل العازلة التي تحتوي في ملي: 10 HEPES، 1.5 MgCl 2، 10 بوكل، ودرجة الحموضة 7.9، مع PI وPS). لاحظ أن هذه الكمية من المواد ستكون كافية لتشغيل immunoblots 2-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأنسجة التي جمعتها دقيق يصل pipetting لوهبوطا. استخدام ماصة 200 ميكرولتر. احتضان المحللة على الجليد لمدة 5-7 دقيقة للسماح للخلايا لتنتفخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 2 ميكرولتر من المحللة، وانخفاض على شريحة مجهرية، وتصور تورم الخلايا تحت المجهر حقل مشرق. مع تورم السليم للخلايا تظهر نواة جولة وهياكل سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 20 ميكرولتر من العينة في أنبوب 1.5 مل جديدة باسم &#39;جزء جناسة. إضافة 8 ميكرولتر من تغيير طبيعة 4x وSDS عينة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لست] المتبقية في 11،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بعناية طاف من أعلى (&#39;جزء عصاري خلوي&#39;)، آرansfer في أنبوب جديد وإضافة 20 ميكرولتر من العينة 4X العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 60 ميكرولتر من العازلة منخفض التوتر وإضافة 20 ميكرولتر من 4x وعينة العازلة. ويشار إلى هذا الكسر ك &quot;جزء التخصيب النووي&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جناسة، عصاري خلوي، والكسور التخصيب النووية يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة immunoblotting لاحق. </li></ol> 5. Immunoblotting نصف كمي للSynapto البروتينات النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Defreeze العينات وسلقها لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 5 ميكرولتر من كل جزء وتحديد تركيز البروتين بواسطة amido اختبار أسود أو اختبار BCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كمية مساوية من عينات البروتين من جناسة، والكسور حشوية والنووية المخصب على SDS-PAGE. ينبغي أن توضع عينات من السيطرة وشرائح LTP على نفس هلام للمقارنة المباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ إجراء النشاف الغربي القياسية (يوصى نقل الرطب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث الأغشية مع تي<html> انه الأضداد في الاختيار. في وقت لاحق من نفس البقع (أو نفس العينات بالتوازي) يمكن بحثها مع علامة حشوية - enolase2 الخلايا العصبية محددة (NSE2) وعلامة النووية - NeuN والأجسام المضادة -actin كما تحكم التحميل. </li></ol> تحليل البيانات 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كفاءة LTP الاستقراء يمكن تحليلها بواسطة برنامج Clampfit. تمت مقارنة متوسط ​​المنحدر من التسجيلات الأساسية مع المنحدرات بعد تكزيز باستخدام اتجاهين أنوفا، ف &lt;0.05 اعتبر اختلافا كبيرا. وقد تم تصوير القيم المنحدر fEPSP في المخططات كما يعني ± SEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقدير حجم immunoblots والمسح إما فيلم autoradiographic وتحليل كثافة متكاملة من العصابات البروتين يماغيج أو العصابات مضان مع نظام Licor. يجب تطبيع قيم عصابات مناعيا لمراقبة التحميل والنشاف. للمقارنة بين السيطرة والجماعات LTP على nonparametrical مان ويتني U للتجارب يمكن استخدامها. </li></ol><table border="0"</html style=";text-align:right;direction:rtl">بطانة الخلايا = &quot;0&quot; CELLSPACING = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> اسم المخزن المؤقت </td><td> كاشف </td><td> التركيز (ملم) </td><td> كمية </td><td> التعليقات / الوصف </td></tr><tr><td> Gey في الحل (درجة الحموضة: 7.3 ~ 7.4) </td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 130 </td><td> 7.6 ز </td><td> الترشيح العقيمة </td></tr><tr><td> 1،000 مل </td><td> بوكل </td><td> 4.9 </td><td> 0.37 ز </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.22 ز </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 0.3 </td><td> 0.0739 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2.24 ز </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> 0.0313 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> نا 2 هبو 4 · 7H 2 O </td><td> 0.8 </td><td> 0.2145 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> الجلوكوز · H 2 O </td><td> 5 </td><td> 0.9909 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5.96 ز </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 22 </td><td> 1.85 ز </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (الرقم الهيدروجيني: 7.3 ~ 7.4) </td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 110 </td><td> 6.428 غرام </td><td> الترشيح العقيمة </td></tr><tr><td> 1،000 مل </td><td> بوكل </td><td> 2.5 </td><td> 0.1865 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0.368 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 غرام </tد&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0.169 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> الجلوكوز · H 2 O </td><td> 10 </td><td> 1.9817 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 27.4 </td><td> 2.3 غرام </td><td></td></tr><tr><td> 1X ناقص التوتر العازلة (درجة الحموضة: 7.9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0.23 ز </td><td></td></tr><tr><td> 100 مل </td><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.0304 غرام </td><td></td></tr><tr><td></td><td> بوكل </td><td> 10 </td><td> 0.07455 غرام </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. المخازن.

<ol>
	<li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression.">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).</li><li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation.">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li><li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA(A)+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters.">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li><li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus.">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldendrin-Jacob:+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus.">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).</li><li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons.">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li><li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling:+implications+for+neurodegenerative+disorders.">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li><li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+(ERK)+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons.">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li><li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+protein+shuttling:+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling.">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li><li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus.">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li><li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking.">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li><li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons.">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures.">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li><li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve.">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li><li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro.">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li><li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation:+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الخطوات المذكورة في البروتوكول فوق إرشادات كيفية تحضير شرائح الحصين الحادة من الشباب أو الكبار الفئران، لحث وسجل LTP، تشريح بسرعة منطقة حفز شريحة، وإعداد جزء التخصيب النووي لدراسة نشاط ديناميات البروتين تعتمد. هذا النهج مستمد من مزيج من عدة أساليب مختلفة تستخدم بشكل...

متشابك N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات (NMDARs) تلعب دورا حاسما في اللدونة متشابك وبقاء الخلية إشارات حين تفعيل NMDARs extrasynaptic يمكن أن تؤدي إلى تنكس عصبي وموت الخلايا. هذه التغيرات تعتمد على / النشاط المنظم لرقابة مشددة التعبير الجيني يتوقف وبالتالي تتطلب التواصل المستمر بين نقاط الاشتباك العصبي أو التشعبات وتنشيط نواة 7. خطة عمل البحر المتوسط ​​تحركات ERK1 / 2 هي المستجيبات المصب من NMDARs متشابك الإشارات ويشاركون في NMDAR-يسببها تفعيل التعبير الجيني، في حين يشير عبر NMDAR extrasynaptic لا يوجد لديه أو لها تأثير كابح بشكل خاص على ERK1 / 2 النشاط 8،11. هناك عدد من البروتينات التي ثبت أنها مكوكية بين التشعبات القاصي والنواة. العديد من هذه البروتينات تحتوي على إشارة توطين النووية ويتم نقلها بنشاط على طول microtubuli في داينين ​​وبطريقة تعتمد على importin إلى النواة 6،9. Interestinglذ، بعض هذه رسل عبور فقط إلى النواة في الاستجابة للمؤثرات متشابك محددة. على سبيل المثال، التي يسببها النقل الوراء من دوري AMP عنصر استجابة ملزمة البروتين 2 (CREB2) من خلال LTD الكيميائي ولكن ليس LTP 12. المحلية التي تعتمد على التحفيز NMDAR متشابك يقود التنظيم CREB coactivator النسخي (CRTC1) في النواة، وهي عملية النبات، التي تشارك في اللدونة الحصين على المدى الطويل 4. وقد تبين مؤخرا أن رسول البروتين يعقوب translocates إلى النواة بعد كل وتفعيل NMDAR متشابك وextrasynaptic وينظم CREB النسخ الجيني يعتمد 5. يتم ترميز أصل متشابك أو extrasynaptic للإشارة إلى تعديل ما بعد النقل يعقوب. النشاط متشابك يدفع ERK1 / 2 الفسفرة تعتمد يعقوب في سيرين حاسمة في الموقف 180 (pJacobS 180) الذي هو شرط مسبق لاحق إزفاء إلى النواة في الثقافة الحصين الابتدائية. وعلاوة على ذلك، طن الخلايا العصبية CA1 من شرائح الحصين الحادة pJacobS 180 translocates إلى النواة بعد شافر ضمانات LTP لكن ليس LTD 1،10. pS180 يعقوب يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة اللدونة وهذا التعبير الجيني يغذي العودة إلى وظيفة متشابك. في تناقض حاد، يعقوب أن translocates إلى النواة بعد لم يتم تفعيل فسفرته NMDARs extrasynaptic في Ser180 و قد تترافق مع مجمع بروتين مختلفة في النواة مما تسبب في &quot;CREB ايقافها&quot; وتراجع من الاتصالات متشابك 10. أجريت معظم الدراسات المنشورة على استيراد النووي-synapto النووي البروتين رسول في الثقافات الأولية العصبية فصلها. لذا سيكون من المثير للاهتمام أن نرى ما اذا كان يمكن تكرار هذه النتائج في أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الظروف باستخدام شرائح قرن آمون حيث الربط وظيفة الخلايا العصبية هي أفضل بكثير الحفاظ عليها. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لتقييم LTP-ديمعلقة النبات النووي من رسل البروتين immunoblotting. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لتحليل النشاط الفسفرة تعتمد البروتينات في جزء نووي بدائي. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي يتضمن إعداد الحادة شرائح CA1 الحصين، التعريفي، وتسجيل LTP. بعد ذلك، يتم تشريح المنطقة CA1 مجهريا لعزل المنطقة حفز. ونحن معا وتعديل البروتوكول لعزل النووية التي تقدمها CellLytic النووية استخراج كيت مع التغييرات التي أدخلها تشاو وزملاؤه 17. ويشمل الإجراء الأمثل تحلل من المناطق CA1 تشريح في المخزن منخفض التوتر السماح تورم الخلية وإطلاق نوى. يمكن تحديد تحلل الخلايا وأنويتها مورفولوجيا عن طريق الفحص المجهري. ويتحقق تخصيب اليورانيوم بواسطة الطرد المركزي خطوة قصيرة. Immunoblotting مع تحليل الأجسام المضادة ضد NeuN وNSE2، وعلامات محددة من الكسور النووية أو عصاري خلوي، يشير إلى أن هذا النهج يمكن أن تستخدم بسرعةوبروتوكول استنساخه لعزل هذه الكسور التحت خلوية ودراسة تعديلات ما بعد النقل عطوب جدا مثل البروتين الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مفيد للعينات الأنسجة الصغيرة المستمدة من مناطق CA1 تشريح شرائح قرن آمون، ويمكن استخدامها في تركيبة لالمناعية من شرائح قرن آمون.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED 1401 AD/DA converter</td>
			<td>Cambridge Electronics Design, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/data_acquisition_system">Axon Digidata acquisition system</a></td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2&#65292;Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Standard microelectrode puller</td>
			<td>Sutter&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a></td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S4E, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica VT1000S, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated pulse stimulator</td>
			<td>Model2100, A-M systmes, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE system</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>JULABO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field Microscope</td>
			<td>NIKON ECLIPSE TS100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, HERAEUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, SM-5, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting chamber and electric power supplier</td>
			<td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julabo, F12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submerged type Recording Chamber</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shape and submerged type incubator&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic culture dish&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.3957.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6781.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>5886.05</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>12034.025</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06574.1000</td>
			<td>extra pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#183;H2O</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6887.1</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.9105.4</td>
			<td>PUFFERAN, &#8805;99.5%, p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Coctail</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphostop</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Tocris bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Isofluran</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJac-s180</td>
			<td>Biogenes/ purified</td>
			<td></td>
			<td>rabbit (dil. 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>mouse (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSE</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>D20H2</td>
			<td>rabbit (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5441</td>
			<td>mouse (dil. 1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - mouse (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - rabbit (1:5,000)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins

دراسة نشاط البروتين يعتمد التعبير، إزفاء التحت خلوية، أو الفسفرة ضروري لفهم الآليات الخلوية الكامنة وراء اللدونة متشابك. تحظى بقبول واسع التقوية طويلة الأمد (LTP) والاكتئاب الطويل الأمد (LTD) المستحثة في شرائح الحصين الحادة كنماذج الخلوية التعلم والذاكرة. هناك العديد من الدراسات التي تستخدم التصوير الخلية المناعية أو النهج الحية لتصور النشاط ديناميات البروتين تعتمد. لكن هذه الطرق تعتمد على مدى ملاءمة الأجسام المضادة للمناعية أو overexpression من البروتينات الموسومة مضان في الخلايا العصبية واحدة. Immunoblotting من البروتينات هو طريقة بديلة توفير تأكيد مستقل للنتائج. العامل المحدد الأول في إعداد الكسور التحت خلوية من شرائح قرن آمون tetanized الفردية هو كمية قليلة من المواد. ثانيا، إجراء معالجة أمر بالغ الأهمية لأن التلاعب حتى قصيرة جدا وبسيطة للترتعيشان شرائح قد تتسبب في تنشيط بعض أجهزة الطرد المركزي الإشارات. نحن هنا وصف لسير العمل الأمثل من أجل الحصول على كمية كافية من نسبة التخصيب النووي من النقاء ما يكفي من المنطقة CA1 من شرائح الحصين الحادة من دماغ الفئران. كمثال التمثيلي وتبين لنا أن شكل فسفرته للsynapto النووي البروتين رسول ERK1 / 2 يعقوب translocates بنشاط إلى النواة على تحريض LTP ويمكن الكشف في جزء التخصيب النووي من الخلايا العصبية CA1.

لقد أظهرنا سابقا أن للsynapto النووي البروتين رسول يعقوب يتراكم في النواة بعد تحريض LTP لكن ليس LTD 1. وعلاوة على ذلك، إزفاء يعقوب بعد التحفيز متشابك يتطلب تفعيل MAPK ERK1 / 2 و الفسفرة يعقوب في Ser180 (الشكل 1). فسفرته يعقوب translocates إلى النواة بطريقة تعتمد على importin ويمك?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins at JoVE.c

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحريض التقوية على المدى الطويل في المنطقة CA1 من الحصين والعزلة اللاحقة الكسور التخصيب النووية من منطقة tetanized للشريحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط يعتمد استيراد البروتين النووي في النماذج الخلوية التعلم والذاكرة.

عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  Leibniz Institute for Neurobiology.  نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحريض التقوية على المدى الطويل في المنطقة CA1 من الحصين والعزلة اللاحقة الكسور التخصيب النووية من منطقة tetanized للشريحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط يعتمد استيراد البروتين النووي في النماذج الخلوية التعل...

Video: Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

إعداد شرائح الحصين الحادة من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك وامراض الشيخوخة خلال اميلويد

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic cues. Their membranes are often juxtaposed at defined contact sites, which become hubs for the exchange of signaling molecules and membrane components1,2,3,4. The inter-organellar membrane microdomains that are formed between the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria at the opening of the IP3-sensitive Ca2+ channel are known as the mitochondria associated-ER membranes or MAMs4,5,6. The protein/lipid composition and biochemical properties of these membrane contact sites have been extensively studied particularly in relation to their role in regulating intracellular Ca2+ 4,5,6. The ER serves as the primary store of intracellular Ca2+, and in this capacity regulates a myriad of cellular processes downstream of Ca2+ signaling, including post-translational protein folding and protein maturation7. Mitochondria, on the other hand, maintain Ca2+ homeostasis, by buffering cytosolic Ca2+ concentration thereby preventing the initiation of apoptotic pathways downstream of Ca2+ unbalance4,8. The dynamic nature of the MAMs makes them ideal sites to dissect basic cellular mechanisms, including Ca2+ signaling and regulation of mitochondrial Ca2+ concentration, lipid biosynthesis and transport, energy metabolism and cell survival 4,9,10,11,12. Several protocols have been described for the purification of these microdomains from liver tissue and cultured cells13,14. 
	Taking previously published methods into account, we have adapted a protocol for the isolation of mitochondria and MAMs from the adult mouse brain. To this procedure we have added an extra purification step, namely a Triton X100 extraction, which enables the isolation of the glycosphingolipid enriched microdomain (GEM) fraction of the MAMs. These GEM preparations share several protein components with caveolae and lipid rafts, derived from the plasma membrane or other intracellular membranes, and are proposed to function as gathering points for the clustering of receptor proteins and for protein&#x2013;protein interactions4,15.

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

This procedure illustrates how to isolate from the adult mouse brain the mitochondria-associated ER membranes or MAMs and the glycosphingolipid-enriched microdomain fractions from MAMs and mitochondrial preparations.

الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER (MAMs) وGlycosphingolipid Microdomains المخصب (GEMS): عزل من مخ الفأر

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

غرس المسابير السليكون المزمنة وتسجيل مكان هيبوكامبال الخلايا في جهاز مخصب المطحنة

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

طريقة محسنة لجمع السائل الدماغي النخاعي من الفئران تخديره

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...