كيف تتنقل المحاور العصبية في مصفوفة الجهاز العصبي المركزي المعقدة هو سؤال أساسي في علم الأحياء العصبي. يتيح هذا البروتوكول دراسة نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في البيئة الفسيولوجية مع التصوير عالي الدقة. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب سهل الاستخدام من طرف إلى طرف لتوصيل الحمض النووي في الدماغ الجنيني للفأر ، والاستعدادات لشرائح النمط العضوي عالية الجودة ودليل خطوة بخطوة للحصول على الصور وتحليلها.
على الرغم من أنه تم تصميمه في الأصل لدراسة ديناميكيات المحور العصبي في الجهاز العصبي المركزي الجنيني ، إلا أنه يمكن تعديل هذا البروتوكول للسماح بالثقافة العضوية وتصور لدونة المحور العصبي بعد الحالات المؤلمة أو المرضية. البروتوكول نفسه بسيط نسبيا. ومع ذلك ، فإن تحقيق أول وسم والحفاظ على هياكل الدماغ هي نقاط حرجة.
لذلك ، تتطلب خطوات الكهربية وتشريح الدماغ والتقطيع عناية إضافية. سيكون إثبات الإجراء مفيدا ، وطالب الدكتوراه من مختبر Bracket. بعد تخدير أنثى الفأر الحامل ، قم بعمل شق لسحب كل من قرون الرحم باستخدام برعم قطني منقوع في محلول ملحي دافئ أو ملقط ، مع الاستيلاء بعناية على المسافات بين الأجنة.
ثم ضع الأجنة على شاش مبلل. بعد فتح كيس الرحم ، قم بإزالة كل جنين. ضع الأجنة في طبق طوله 10 سنتيمترات يحتوي على HBSS مع مكملات الجلوكوز على الجليد.
بالنسبة للكهربية خارج الرحم ، التقط جنينا وضعه في الحامل. ثم أدخل بعناية الشعيرات الدموية الزجاجية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي الأخضر السريع من خلال جمجمة الجنين في البطين الجانبي ، وحقن اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من مزيج بلازميد الحمض النووي في كل بطين. بعد ذلك ، أمسك رأس الجنين بين أقطاب ملاقط البلاتين بالزاوية المناسبة لاستهداف منطقة الدماغ المطلوبة ، مع مواجهة الكاثود للمنطقة التي يهدف إلى نقل الحمض النووي.
في الرحم الكهربائي ، بعد سحب قرون الرحم ووضع الأجنة على شاش رطب كما هو موضح سابقا ، استخدم أطراف الأصابع لتدوير الجنين بلطف داخل الرحم حتى يتم تحديد موقع خيوط lambdoidal و saggital. ثم أدخل بعناية الشعيرات الدموية الزجاجية التي تحتوي على مزيج الحمض النووي الأخضر السريع من خلال جدار الرحم وجمجمة الجنين في البطين الجانبي ، وحقن اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من مزيج بلازميد الحمض النووي في أحد البطينين أو كليهما حسب الرغبة بحد أقصى ميكرولترين لكل بطين. بعد الحقن ، أمسك رأس الجنين بين أقطاب ملاقط البلاتين بالزاوية المناسبة لاستهداف منطقة الدماغ المطلوبة مع الكاثود الذي يواجه المنطقة التي يقصد بها نقل الحمض النووي.
بمجرد أن يتم فحص جميع الأجنة المطلوبة بالكهرباء ، استخدم برعم قطني منقوع بمحلول ملحي لوضع قرون الرحم بلطف داخل تجويف البطن. خياطة شقوق العضلات والجلد باستخدام 5-0 مادة خياطة، ثم تأمين الجرح باستخدام مشابك خياطة، وتطهير الجرح عن طريق رشه بالبيتادين. ضع الماوس مرة أخرى في قفص الاسترداد وحافظ على الدفء باستخدام ضوء الاحترار بالأشعة تحت الحمراء البعيدة لمدة 20 دقيقة على الأقل بعد الإجراء.
إصلاح رأس الجنين تحت مجهر التشريح. ثم قم بإزالة الجلد في الجمجمة عن طريق القطع على طول خط الوسط بدءا من قاعدة الرأس نحو الأنف. قشر الجلد في الجمجمة أفقيا مما يجعل فجوة كبيرة بما يكفي لاستئصال الدماغ.
بعد ذلك ، لإزالة الدماغ ، أدخل الطرف المغلق من مقص التشريح المعقم الذي يبدأ تحت المصباح الشمي ويتحرك نحو جذع الدماغ. ثم قطع جذع الدماغ وتقليم العديد من القطع فضفاضة من السحايا حول الدماغ. باستخدام ملعقة مثقوبة ، التقط الدماغ وأزل السائل الزائد عن طريق وضع الجزء السفلي من الملعقة على ورق المناديل الجافة.
ثم ضع الدماغ في طبق أغاروز على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام ملعقة أصغر ، امزج الأغاروز لمدة 10 ثوان حتى يبرد ، ثم قم بمناورة الدماغ إلى منتصف الطبق ووضعه أفقيا مع الجانب الظهري لأعلى والتأكد من أنه مغطى بالكامل بالأغاروز من جميع الاتجاهات. التقط كتلة الأغاروز بلطف من محطة عمل Vibratome وجفف الجزء السفلي عن طريق التدليك على المناديل الورقية.
ثم ضع الكتلة على المنطقة الملصقة من حامل العينة مع الجانب السطحي من الدماغ متجها لأعلى ، ووضع حامل العينة على الجليد. اترك الغراء ليجف لمدة دقيقة واحدة. قطع الدماغ في شرائح إكليلية بزاوية 15 درجة.
ثم باستخدام ملاعق نظيفة ، قم بجمع شرائح الدماغ ووضعها على غشاء PTFE مثبت في طبق زجاجي سفلي 35 ملم باستخدام Parrafin. اجمع ما يصل إلى خمس شرائح دماغية لكل غشاء. بعد ذلك ، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة محلول الجلوكوز HBSS الزائد من حول الشرائح الموجودة على الغشاء تاركا الشرائح شبه جافة ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسائط الشرائح المسخنة مسبقا مباشرة إلى المساحة الموجودة أسفل الغشاء واحتضن الشرائح عند 35 درجة مئوية بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
لتصوير نمو المحور العصبي، حدد موقع منطقة القشرة ذات كثافة الخلايا المنخفضة إلى المتوسطة. بينما بالنسبة لتصوير ديناميكيات مخروط النمو، حدد موقع مخروط النمو في المنطقة المباشرة للقشرة أو المنطقة تحت البطينية. بعد ذلك حدد حجم مكدس Z.
بالنسبة لنمو المحور العصبي في مكدس Z كبير، قم بتعيين حجم خطوة مقداره ميكرومترين وبالنسبة لمخاريط النمو في مكدس Z أصغر، قم بتعيين حجم خطوة بمقدار ميكرومتر واحد. لتحليل البيانات، افتح ملف الصورة في فيجي بالنقر فوق ملف، ثم فتحه، وتحديد الصورة. احصل على أقصى إسقاط كثافة للفاصل الزمني من خلال النقر فوق الصورة، متبوعا بالمكدسات وإسقاط Z والحد الأقصى للكثافة في الإسقاط.
انتقل عبر الفاصل الزمني وحدد موقع محور عصبي متنامي. بمجرد تحديد الموقع ، ارسم خطا عبر المحور العصبي المتنامي ، بدءا من طرف المحور العصبي في الإطار الأول واتباع المحور العصبي خلال الفاصل الزمني بأكمله. بعد ذلك ، قم بغناء المكون الإضافي kymo إعادة شريحة واسعة.
اضبط مقياس الكيموجراف بالانتقال إلى الصورة، ثم الخصائص. بعد تعيين المسافة بالميكرومتر، وعرض البكسل والوقت بالثواني أو الدقائق، وارتفاع البكسل، انتقل إلى التحليل وانقر فوق قياس. لقياس حجم مخروط النمو، افتح ملف الصورة في برنامج تحليل الصور بالنقر فوق ملف وفتحه وتحديد الملف محل الاهتمام.
ثم، حدد معالج إضافة أسطح جديدة في الخطوة الأولى، ضمن إعدادات الخوارزمية، حدد شريحة منطقة اهتمام فقط، وفي الخطوة الثانية، قم بقص الإطار ليناسب مخروط النمو بأكمله في جميع الإطارات. التالي في الخطوة الثالثة ، حافظ على العتبة إلى الكثافة المطلقة وفي الخطوة الرابعة ، تأكد من أن منطقة مخروط النمو بأكملها قد تم عتبتها. ثم في الخطوة الخامسة ، ضمن نوع المرشح ، حدد عدد voxels LMG إلى واحد.
حدد الزر تنفيذ لتنفيذ كافة خطوات الإنشاء وإنهاء معالج إضافة أسطح جديدة. أخيرا ، في علامة التبويب إحصائيات في الجزء العلوي من نافذة المعالج ، حدد قيما ووحدة تخزين محددة ضمن علامة التبويب التفصيلية. عادة ما تظهر شرائح الدماغ المستزرعة بنجاح والمستمدة من الكهرباء في الرحم أو خارج الرحم توزيعا خلويا طبيعيا ومجموعة منظمة من الدبقية الشعاعية مع عمليات اتصال بيلو موجهة بشكل قمي.
في بعض الأحيان ، لوحظ وجود اضطرابات خارج الرحم في السقالات الدبقية الشعاعية وشرائح الدماغ المستزرعة مما يجعل تلطيخ التحكم هذا أمرا مستوصيا. تظهر هنا خلية عصبية قشرية هرمية تمثيلية تعبر عن Lyn-mNeonGreen والسلوك الديناميكي لمخروط نموها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف الخلايا العصبية باستخدام مسبار الأكتين الذي يعبر عن البلازميد لتحليل ديناميكيات الأكتين لمخاريط النمو المحورية في الموقع.
كما أجريت تجارب في الموقع باستخدام فلوروفور مزدوج كري دري يعبر عن تصميم البلازميد ، حيث يمكن تنشيط فلوروفور tRFP أو ZsGreen بشكل خاص وفردي إما عن طريق المؤتلفات dre أو cre ، على التوالي في الخلايا العصبية المجاورة. من kymographs ، يمكن بسهولة الحصول على معلمات النمو الديناميكية مثل سرعة النمو للعديد من المحاور العصبية وحجم مخروط النمو بمرور الوقت. يمكن استخدام هذا لتقييم سرعة طحن الأكتين والتوازن بين الفيلوبوديا والصفائح أثناء نشاط استكشاف مخروط النمو.
من المهم الحفاظ على بنية الدماغ وضبط تركيزات البلازميد لتحقيق وضع علامات متفرقة. هذا أمر بالغ الأهمية للتصور الدقيق للمحاور ومخاريط النمو في القشرة. اعتمادا على البلازما المختارة والخلفية الجينية ، يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين بتعديل الخلايا العصبية أو البيئة التي تنمو فيها مما يسمح بمجموعة واسعة من الدراسات.
من خلال تمكين الوصول عالي الدقة إلى الخلايا العصبية في الموقع ، تمكن هذه التقنية علماء الأعصاب من استجواب التفاعل الديناميكي بين مخاريط النمو ومقاييس الجهاز العصبي المركزي على المستويين المورفولوجي والجزيئي.
