نود أن نشكر الأستاذان. Huibert Mansvelder وبيرت Sakmann للحصول على دعم واسع النطاق، والدكتور مارسيل Oberlaender لإجراء مناقشات مثمرة وتوفير تتبع الخلايا العصبية، وبريندان ودر للحصول على المساعدة الفنية. تم الحصول على البيانات باستخدام ntrode السادس لابفيف، قدمت بسخاء من قبل R. برونو (جامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). وأيد هذا البحث من قبل جمعية ماكس بلانك ومركز العلوم العصبية الحاسوبية لبرنشتاين، توبنغن (بتمويل من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF؛ FKZ: 01GQ1002)) (RTN)، مركز البحوث وNeurogenomics المعرفي (CNCR) ، علم الأعصاب في الحرم الجامعي أمستردام (NCA)، التمويل لCPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 وENC-P3-# شبكة C3) وVU جامعة أمستردام.

1. إعداد الحيوان يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للقانون الهولندي وبعد تقييم من قبل لجنة أخلاقية المحلية في VU جامعة أمستردام، هولندا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران ويستار (P25-P45، ♂ / ♀) مع isoflurane و(2-3٪ في الأكسجين)، وبعد ذلك مع يوريثان (20٪ في كلوريد الصوديوم 0.9٪، 1،6-1،7 جم / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تقييم عمق التخدير عن طريق مراقبة انسحاب قرصة، وردود الفعل جفن، والحركات vibrissae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة جرعة إضافية من يوريثان (10٪ من الجرعة الأولي) في حال الحيوان لا يصل عمق التخدير كافية أو كلما لاحظت تشنجات vibrissae أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان تخدير على الإطار التجسيمي مجهزة وسادة التدفئة، إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم والحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 ± 0.5 درجة مئوية بحلول وسادة التدفئة. </li><lط&gt; ضع رأس الحيوان في إطار التجسيمي؛ تقليم الشعر على أعلى الرأس باستخدام مقص لجعل الجلد مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 100 ميكرولتر 1٪ ليدوكائين (في كلوريد الصوديوم 0.9٪) تحت الجلد لتخدير موضعي في موقع العملية والانتظار 3-5 دقائق. إزالة الجلد تغطي سطح الجمجمة عن طريق خفض في الاتجاه الذيلية-إلى منقاري وتنظيف الأنسجة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الجمجمة على نطاق واسع مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم ومسحات ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إحداثيات المنطقة المستهدفة على نصف الكرة المخية الأيسر (على القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1): 2.5 ملم و 5.5 ملم الخلفي الجانبي لbregma). وضع علامة على موقع على الجمجمة مع الجراحية علامة الجلد من ركلة جزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط العظام بلطف بواسطة حفر الأسنان من منطقة الفائدة حتى يصبح شفافا العظام والأوعية الدموية هي واضحة للعيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 0.5 مم × 0.5 مم حج القحف عن طريق خفض نافذة في الجمجمة ضعيفة مع مشرط (# 11)، وتجنب الأضرار التي لحقت الأم الجافيةوالأوعية الدموية. اختياري: علم على حواف حج القحف باستخدام الجراحية علامة الجلد القلم لتحسين الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة من superglue على الجمجمة الجافة ثم الاسمنت الأسنان لبناء حمام (أي غرفة تسجيل) إحاطة حج القحف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم شعيرات في الجانب المقابل لبالضبط 5 ملم من بصيلات الطولي. اختياري: تسليط الضوء على شعيرات قلص مع الماسكارا السوداء. </li></ol> 2. Juxtasomal تسجيلات وصفها Biocytin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ماصات التصحيح من الزجاج البورسليكات مع قطر الحافة داخل ~ 1 ميكرون للحصول على الأقطاب مع المقاومة MΩ 3-5. ملاحظة: مورفولوجيا ماصة مثالية لتسجيل juxtasomal هو تفتق تدريجي مرهف، زاوية المخروط منخفضة، و~ 1 ميكرون طرف (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على عمق تسجيل (مع الاحترام لسطح حنوني)، ينبغي تعديل أبعاد تفتق من القطب تسجيل. بالغ الأهمية هو أن روقال انه ينبغي أن يكون تفتق قطرها أقل من 75 ميكرون في نقطة الدخول في الدماغ لتجنب الأضرار الميكانيكية أو الإجهاد إلى منطقة التسجيل. هذا يدل على أن للتسجيلات القشرية سطحية، لا بد من تفتق من 300-500 ميكرون مع القطر الخارجي الحد الأقصى من 75 ميكرومتر (الشكل 1A) في حين التسجيلات من الطبقات القشرية العميقة نسبيا تتطلب تفتق أطول من 1،500-1،800 ميكرون، ومرة أخرى مع الخارجي القصوى قطر 75 ميكرومتر (ميكرون في 1،800 من طرف القطب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ماصة التصحيح مع الفئران العادية المسابقة (NRR) تستكمل مع 2٪ biocytin (انظر الجدول رقم 1 لإيجاد حلول والكواشف) وجبل ماصة التصحيح على مرحلة الرأس ثابت إلى مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين زاوية حامل القطب إلى 34 درجة فيما يتعلق المستوى السهمي خصيصا لاستهداف العمود D2 من S1 الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط رئيس لمرحلة مكبر للصوت في جسر وضع (أي المشبك الحالي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع التصحيحماصة على مقربة من حج القحف. ملء حوض الاستحمام مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتحديد المقاومة القطب الذي يجب أن يكون بين 3-5 MΩ وتقييمها عن طريق تطبيق نبض مربع مع الحقن الحالية إيجابية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الضغط الزائد من 100-150 م بار، ودفع ماصة التصحيح في 1 ميكرومتر الخطوات أثناء تطبيق الحالية إيجابية البقول مربع (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). رصد تغير المقاومة القوية عند إنشاء اتصال مع الأم الجافية. عند هذه النقطة، تعيين إحداثيات مياداة مجهرية ل&#39;صفر&#39; للسماح للقياسات عمق دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقدم في الخطوة 1 ميكرومتر الوضع حتى تخترق ماصة التصحيح الأم الجافية يتبين من انخفاض مفاجئ في مقاومة القطب. إزالة الضغط عقد ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث عن وحدة واحدة في حين تتقدم في 1 ميكرومتر الخطوات. رصد المقاومة الكهربائي بشكل مستمر من خلال تطبيق 200 ميللي ثانية على / قبالة البقول. زيادة في القطب المقاومة typicحليف يشير إلى القرب من الخلايا العصبية واحدة. تقدم القطب حتى إمكانات العمل الإيجابي (ا ف ب) يتم تسجيل الطول الموجي من ~ 2 بالسيارات (أرقام 2A و 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: قم بتسجيل نمط ارتفاعه عفوية من الخلايا العصبية وتحديد ارتفاعه من قبل، على سبيل المثال، تشتيت نحو caudally شعيرات فردية ل200 ميللي ثانية في زاوية من 3.3 درجة باستخدام جهاز كهرضغطية 18-أثار ضئيلة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدم القطب حتى المقاومة 25-35 MΩ والمسامير لديهم سعة من 3-8 بالسيارات للحصول على ظروف مثلى من juxtasomal التعبئة. بدء ملء juxtasomal من خلال تطبيق نبضات مربع من الإيجابية الحالية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). ببطء وتدريجيا يزيدون الكمية الحالية من خلال الخطوات من 0.1 غ في حين رصد الموجي AP وتردد (أرقام 2A و 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد افتتاح الغشاء كما زيادة واضحة في وتيرة AP أثناء مرحلة على من نبض كتلة (الشكل 2C </قوية&gt;). الموجي ارتفاع خلال ملء يبين زيادة العرض وانخفاض بعد فرط الاستقطاب (أرقام 2C و 2D). وتشمل معلمات إضافية زادت الضوضاء أو صغيرة (1-5 بالسيارات) سلبي DC التحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة أو نقصان الحالية (1 غ) في حين ملء للحفاظ على استقرار ضخ biocytin. خفض أو وقف نبضات الحالي على زيادة مفاجئة في وتيرة AP لتجنب السمية عن طريق تدفق الزائد من الأيونات خارج الخلية، مثل أيونات الصوديوم. ملاحظة: ستكون كل الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف للحقن الحالية ووضع العلامات juxtasomal تحتاج المعلمات إلى تعديل تبعا لظروف التسجيل الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن كثب رصد إشارة بعد إيقاف الحقن الحالية. الموجي ارتفاع بعد جلسة ملء عادة ما يتم توسيع ويظهر انخفض بشدة بعد فرط الاستقطاب. انتظر استعادة الخلايا العصبية، والتي هي واضحة عندما يعود إلى خصائص ارتفاع الموجي الأصلي (أي وجودطبيعي بعد فرط الاستقطاب، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار biocytin ملء جلسات بعد الشفاء الكامل من الخلايا العصبية لزيادة الحمل biocytin لتحسين جودة تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ماصة التصحيح في الخطوات من 1 ميكرون حتى يقلل من السعة ارتفاع للحد من أي إجهاد للخلية. الانتظار ما لا يقل عن 1 ساعة لbiocytin لنزع فتيل داخل الخلية بينما تراقب عن كثب درجة حرارة جسم الحيوان والتنفس. </li></ol> 3. Perfusing الحيوان وإزالة الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإعداد التروية، شطف، وتهيئة تحميلها على الأنابيب مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على صينية الجراحية وآمن مع الشريط وضع العلامات القياسية. ضمان عمق كاف من التخدير؛ قرصة القدم وردود الفعل جفن يجب أن يكون غائبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الإنسي إلى الوحشي شق (5-6 سم) من خلال جدار البطن فقط تحت القفص الصدري والمضي قدما في اتجاه الخلفي الأمامي لفضح القص.سحب القص الأمامية وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز، وقطع من خلال انخفاض أضلاعه ومواصلة شق على طول من تجويف البطن لفضح القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التأمور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الإبرة في البطين الأيسر وإجراء شق في الأذين الأيمن. يروي مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (~ 8 مل / دقيقة) حتى إزالة اللون من الكبد كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى ضخ بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حتى تصلب مخلب الجبهة والفك السفلي هو واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفأر باستخدام زوج من مقص </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عضلات الرقبة المتبقية وفضح الجمجمة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع مقص في جذع الدماغ على الجانب الظهري وقطع العظم بعناية على طول الدرز السهمي، والحفاظ على موقف الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العظام من كلا الجانبين من الدرز السهمي لفضح الدماغ باستخدام ملقط. إزالة الجافية بعناية لتجنب دamage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية ملعقة حادة إلى الجانب البطنية من الدماغ وإزالة الدماغ بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح بين عشية وضحاها في الدماغ كله PFA في 4 درجات مئوية. التبديل الدماغ إلى 0.05 M العازلة الفوسفات (PB) وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. تشريح الدماغ في أقسام تماسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الدماغ من 0.05 M PB ووضعها على ورقة الترشيح التي تواجه الأمامي. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع المخيخ على طول الطائرة الاكليلية وفصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق خفض طول الطائرة منتصف السهمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق superglue على منصة تصاعد وجبل نصف الكرة اليسار على المستوى السهمي مع الأمامية التي تواجه الحق. تأمين منصة متزايدة في زاوية من 45 درجة على vibratome ويغرق في الدماغ 0.05 M PB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين شفرة حلاقة على vibratome وتأكد من أن أول اتصال مع سطح الدماغ في منتصف الطائرة الأمامي الخلفي من نصف الكرة الغربي. قطع 24 100 ميكرونأقسام وجمعها في لوحة 24 أيضا تحتوي على 0.05 M PB. </li></ol> 5. إجراءات النسيجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء بروتوكولات النسيجية لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز 24 و-البيوتين أفيدين طريقة البيروكسيداز وفقا للأساليب الموصوفة سابقا 25. اختياري: تصور biocytin باستخدام تقارن الفلورسنت أفيدين / streptavidin-اليكسا. وهذا يسمح بالإضافة المزدوج تلطيخ مع تقنيات تتبع إلى الوراء أو تقدمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام غسيل 5 × 5 دقائق مع 0.05 M PB وإعداد tetrahydrochloride 3،-3&#39;-diaminobenzidine (DAB) التي تحتوي على حل لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز لتصور برميل في طبقة 4 (L4) من S1 (انظر الجدول 2 لحلول و الكواشف). احتضان أقسام 6-12 من الحنون في حل محمى لمدة 30-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 0.05 M PB ل6 × 5 دقائق وإخماد النشاط البيروكسيديز الذاتية التي يحتضنها كل المقاطع في 3٪ H 2 </الفرعية&gt; O 2 في 0.05 م PB لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. احتضان المقاطع في ABC-الحل (انظر الجدول 3 لحلول والكواشف) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 0.05 M PB لمدة 5 × 10 دقيقة، وإعداد حل DAB-لتصور الخلايا العصبية مليئة biocytin (انظر الجدول رقم 4 لحلول والكواشف). احتضان المقاطع في حل تصفيتها عن 45-60 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. أقسام جبل على الشرائح المجهر وغطاء قابل للانزلاق مع Mowiol (انظر الجدول 5 للحلول والكواشف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نوعية وضع العلامات باستخدام المجهر الضوئي. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+identity:+a+key+to+unlocking+the+function+of+neocortical+circuits.">Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).</li><li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebellar+microcircuit+as+an+adaptive+filter:+experimental+and+computational+evidence.">The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+three-dimensional+structure+of+thalamocortical+circuits+in+a+column+of+rat+vibrissal+cortex.">Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex.</a> Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).</li><li>Dyer, M. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+proliferation+during+retinal+development.">Regulating proliferation during retinal development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).</li><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics:+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations.">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li><li>Urban, N., Tripathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Circuits+drive+cell+diversity.">Neuroscience: Circuits drive cell diversity.</a> Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).</li><li>Gentet, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+functional+properties+of+somatostatin-expressing+GABAergic+neurons+in+mouse+barrel+cortex.">Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex.</a> Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).</li><li>Burgalossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcircuits+of+functionally+identified+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex.">Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).</li><li>Herfst, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-based+stabilization+of+juxtacellular+recordings+in+freely+moving+rats.">Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats.</a> J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).</li><li>Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biocytin+labeling+and+neuronal+3D+reconstruction.">Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).</li><li>Bruno, R. M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex+is+driven+by+weak+but+synchronously+active+thalamocortical+synapses.">Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses.</a> Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).</li><li>Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+restructures+thalamocortical+axons+during+adulthood.">Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood.</a> Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo-a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).</li><li>de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer+and+cell+type+specific+suprathreshold+stimulus+representation+in+primary+somatosensory+cortex.">Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).</li><li>Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+and+standardization+of+the+rat+vibrissal+cortex+for+precise+registration+of+single+neuron+morphology.">3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).</li><li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+axon+morphologies+of+individual+layer+5+neurons+indicate+cell+type-specific+intracortical+pathways+for+whisker+motion+and.">Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).</li><li>Sakata, S., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+structure+of+spontaneous+and+sensory-evoked+population+activity+in+auditory+cortex.">Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex.</a> Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+action+potential+bursts+(&gt;or=+100+Hz)+in+L2/3+and+L5B+thick+tufted+neurons+in+anaesthetized+and+awake+rat+primary+somatosensory+cortex.">High frequency action potential bursts (&gt;or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).</li><li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific.">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Horikawa, K., Armstrong, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+means+of+intracellular+labeling:+injection+of+biocytin+and+its+detection+with+avidin+conjugates.">A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates.</a> J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).</li><li>O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Veinante, P., Deschenes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+study+of+motor+cortex+projections+to+the+barrel+field+in+rats.">Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats.</a> J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats.">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li><li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology.">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

وauthros ليس لديهم ما يكشف.

يسمح أسلوب juxtasomal تسجيل في العمل فيفو ارتفاعه المحتملة من وحدات واحدة عبر الظروف السلوكية (تخدير، مستيقظا أو بحرية التحرك الثابت الرأس) مع خيار من الخلايا العصبية المسجلة لآخر مخصص نوع من الخلايا تصنيف و / أو إعادة الإعمار 3D-وصفها biocytin. والميزة الرئيسية ...

تتكون الشبكات العصبية من أنواع خلايا متعددة، وتتميز خصائص المورفولوجية والفسيولوجية محددة للغاية 1-7. نتيجة لذلك، أنواع الخلايا الفردية أداء المهام المتخصصة داخل الشبكة (انظر على سبيل المثال Gentet وآخرون. 8 وBurgalossi وآخرون. 9). نحن ليست سوى بداية لفهم وظائف محددة نوع الخلية عبر الشبكات العصبية والكثير لا يزال يتعين اكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية، العديد من المعامل وتنفيذ نهج التجريبية التي تسمح للتحليل الخصائص المورفولوجية من نفس السكان من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها المعلمات الفسيولوجية 1،10-15. هنا، ونحن لشرح وضع العلامات juxtasomal تقنية 16،17 الذي ينطوي التسجيلات الكهربية باستخدام ماصات التصحيح التقليدية في التكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية في تركيبة مع التثقيب الكهربائي من الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin. الالميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن طبيعة موسع يضمن أن العمل ارتفاعه المحتملة من الخلايا العصبية الفردية يتم تسجيلها دون تغيير (على سبيل المثال dialyzing) محتوى الخلايا من الخلية. تليها التثقيب الكهربائي، ونهج juxtasomal يوفر خيار آخر تحديد الخلية المخصصة وإعادة الإعمار لربط وظيفة (وظائف الأعضاء) لهيكل (التشكل). عادة والتعمير المورفولوجية ينطوي على إعادة بناء التشكل شجيري ومحور عصبي والتي يمكن أن تمتد إلى العمود الفقري الكمي و / أو حبة الكثافة أو حتى إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية في القرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني. تقنية تسجيل juxtasomal يمكن استخدامها لفي الجسم الحي تسجيلات لمختلف أنواع الخلايا عبر الطبقات القشرية أو في المناطق شبه القشرية في مجموعة من الأنواع، على الرغم من أن معظم الدراسات قد طبقت هذه التقنية في القوارض الصغيرة مثل الفئران أو الجرذان. وتركز أبحاثنا على تسجيل ووصفها الخلايا العصبيةمن الفئران القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) وينطوي على تحديد الخلايا العصبية البصرية سجلت 18، شجيري اعادة البناء في تركيبة مع تسجيل دقيق في إطار مرجعية موحدة لعكس مهندس شبكات القشرية 4،19 وإعادة الإعمار مفصلة العمارة محور عصبي لوصف نوع محدد خلية محلية والإسقاط طويل المدى يستهدف 20. مقارنة في الجسم الحي تقنيات التسجيل بديلة (الخلايا أو خلية كاملة)، والتسجيلات juxtasomal مستقرة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها في جميع أنحاء دول السلوكية بما في ذلك تخدير 21،22، مخدرا 14، 23 مستيقظا الحيوانات الثابتة الرأس، أو التحرك بحرية، وحتى 9 . هنا، وتبين لنا وضع العلامات juxtasomal في S1 من الفئران تخدير يوريثان، على الرغم من أننا نشدد على تطبيق العام لهذه التقنية إلى العديد من الأعمال التحضيرية في الاختيار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

تتميز قشرة الدماغ بواسطة طبقات متعددة وكثيرة متميزة الخلية الأنواع التي معا كشبكة هي المسؤولة عن العديد من الوظائف المعرفية بما في ذلك صنع القرار العليا، والسلوك الحسي موجهة أو الذاكرة. لفهم كيف يمكن لهذه الشبكات العصبية المعقدة أداء مثل هذه المهام، خطوة حاسمة في تحديد وظيفة (أو النشاط الكهربائي) من أنواع الخلايا الفردية داخل الشبكة، تفضيلي عند الحيوان هو أداء مهمة المعرفية ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا لتحديد بنية التشريحية للشبكة والبنية المورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية للسماح الهندسة العكسية شبكة القشرية. اختراقات التقنية المتاحة اليوم تسمح تسجيل النشاط الخلوي في اليقظة، تتصرف الحيوانات مع خيار قيمة من آخر مخصص تحديد الخلايا العصبية المسجلة. هنا، علينا أن نظهر تقنية وضع العلامات juxtasomal biocytin، الذي ينطوي على إجراءات تسجيل potentiآل ارتفاعه في تكوين خارج الخلية (أو فضفاضة التصحيح) باستخدام ماصات التصحيح التقليدية. تكوين تسجيل juxtasomal مستقرة نسبيا وقابلة للتطبيق في جميع أنحاء الظروف السلوكية، بما في ذلك تخدير، مخدرا، مستيقظا الثابتة الرأس، وحتى في الحيوان يتحرك بحرية. وهكذا، وهذه الطريقة تسمح ربط الخلايا من نوع إجراءات محددة ارتفاعه المحتملة خلال سلوك الحيوان لإعادة بناء الخلايا العصبية الفردية، وفي نهاية المطاف، والمتناهية الصغر القشرية بأكملها. في هذه المخطوطة الفيديو، وتبين لنا كيف يمكن أن توصف الخلايا العصبية الفردية في تكوين juxtasomal مع biocytin في الفئران مخدرة يوريثان لتحديد آخر مخصص وإعادة الإعمار المورفولوجية.

معرفة تفصيلية على هيكل 3D من الخلايا العصبية الفردية هو أمر حاسم لتوضيح المبادئ التنظيمية للشبكات العصبية. يتضمن أسلوب لدينا خط أنابيب لتحقيق وضع العلامات biocytin جودة عالية من الإعداد في الجسم الحي، مما يتيح تصنيف الوظائف المخصصة الخلايا العصبية وإعادة ...

Watch this Scientific Journal Video about Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons at JoVE.com

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

لفهم بنية الشبكات العصبية، وتوصيف وظيفي والمورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية هو ضرورة. هنا، علينا أن نظهر وضع العلامات juxtasomal biocytin، والذي يسمح التسجيلات الكهربية في تكوين الخلية، ولكن الحفاظ على القدرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية لإعادة الإعمار آخر مخصص للشجيري والهندسة المعمارية محور عصبي.

Juxtasomal Biocytin وصفها لدراسة بنية وظيفة علاقة فردية القشرية الخلايا العصبية

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Views.  VU University Amsterdam.  لفهم بنية الشبكات العصبية، وتوصيف وظيفي والمورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية هو ضرورة. هنا، علينا أن نظهر وضع العلامات juxtasomal biocytin، والذي يسمح التسجيلات الكهربية في تكوين الخلية، ولكن الحفاظ على القدرة على تسمية الخلايا العصبية داخل ?...

Video: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...