نشكر FortéBio لتقديم الرسومات المستخدمة في الشكل 1. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM083088 إلى TMD

<html> 1. برمجة صك BLI الفحص بدوره على الصك ساعة واحدة على الأقل في وقت مبكر للسماح للمصباح في عملية الاحماء، وهذا أمر ضروري للحد من الضوضاء والانجراف في الإشارات الضوئية أثناء التجربة. ضبط درجة الحرارة المطلوبة من خلال علامة التبويب أداة لprewarm حامل لوحة العينة. ثم إعداد التصميم التجريبي في البرنامج الحصول على البيانات. حدد &quot;جديد حركية التجربة&quot; في علامة التبويب معالج التجربة. هذا يمثل القائمة كلفه مع جميع الخطوات التي يجب أن تكون محددة. 1.1. لوحة تعريف تعريف الأعمدة ليتم استخدامها على لوحة عينة 96 جيدا. تعيين الأعمدة لاحتواء العازلة، البروتين يجمد أو شريك ملزمة. لكل جمعية جيدا، أدخل تركيز شريك ملزمة لاستخدامها. ملاحظة: تعريف لوحة هو مبين في الشكل 2 لديها خيارات لفحوصات متميزة. 1.2. فحص الوضوح ontent &quot;&gt; تعريف جميع الخطوات اللازمة لفحص وتشمل هذه (ط) الأساس (عدة)، (ب) جاري التحميل، (ج) جمعية و (iv) التفكك لشريك ملزم، ثم كما هو موضح أدناه، ربط خطوات الفحص الفردية مع أعمدة من الآبار على لوحة عينة عن طريق تحديد الخطوة مقايسة ثم النقر المزدوج على العمود منها. هذه البرامج على أجهزة استشعار يمكن نقلها من عمود واحد من الآبار إلى أخرى أثناء الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط الأساس تبدأ خطوة أساسية موجزة (≥ 60 ثانية)، مع أجهزة الاستشعار في المخزن فحص (الشكل 2، العمود 1)، لإنشاء إشارات BLI الأولية في لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل (شل حركة البروتين البيروكسيديز على أجهزة الاستشعار) تعيين أجهزة الاستشعار لآبار التي سوف تحتوي على البروتين البيروكسيديز (الشكل 2، العمود 2). استخدام وظيفة عتبة لتحقيق مستوى محدد سلفا من ملزمة (انظر المقدمة). تعيين الخيار عتبة حتى يتسنى لجميع أجهزة الاستشعار ستكون الخطوةد إلى العمود التالي من الآبار عند أي واحد من أجهزة الاستشعار تصل إلى العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط الأساس وتشمل خطوة أخرى أساسية في المخزن (الشكل 2، العمود 3؛ عادة&gt; 5 دقائق) ليغسل البروتينات البيروكسيديز nonimmobilized من أجهزة الاستشعار وإنشاء، وإشارات خط الأساس مستقرة جديدة. لفحوصات ملزمة / التفكك الأساسية فقط (كما في الشكل 3)، وتشمل خطوة إضافية الأساس (60 ثانية) مع أجهزة الاستشعار في آبار جديدة من العازلة (الشكل 2، العمود 4) قبل الخطوة الرابطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمعية (الشريك ملزمة للبروتين يجمد) لالملزمة / تفارق مقايسة الأساسية (كما في الشكل 3)، حدد مجموعة من تركيزات شريك ملزمة لاستخدامها لمختلف أجهزة الاستشعار / الآبار (الشكل 2، العمود 5). ضبط الوقت خطوة بحيث لا يقل تركيز تشبع من الشريك ملزم ينبغي الاقتراب التوازن إشارة ملزمة. لفحص لاختبار آثار تفارغي من بروابط صغيرة على التفكك من مجمع البروتين البروتين (كما في الشكل 5)، حدد تركيز عال من شريك واحد ملزم (~ 10 أضعاف فوق يقدر K D) للاستخدام في جميع الآبار الجمعيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفكك (الشريك ملزم) لالملزمة / تفارق مقايسة الأساسية فقط (كما في الشكل 3)، تعيين أجهزة استشعار للعودة إلى العمود 4 (الشكل 2)، وهو نفس الآبار العازلة المستخدمة لخط الأساس اضافية قبل جمعية. لفحص لاختبار آثار تفارغي من بروابط صغيرة، بدلا من ذلك تعيين أجهزة استشعار للانتقال إلى العمود 6 (الشكل 2)، حيث يمكن أن تحتوي على كل بئر عازلة بالإضافة إلى بروابط تفارغي مختلفة. </li></ol> 1.3. استشعار الواجب تشير إلى مواقع في علبة الاستشعار التي سوف تحتوي على أجهزة استشعار prewetted للمقايسة. تحديد أي مواقف فارغة منذ التجربة سوف FAIل إذا لم يتم اختيار أجهزة الاستشعار فوق. 1.4. تجربة الاستعراض تصور جميع الخطوات المخطط لها للتحقق من الأخطاء والعودة الى تصحيحها. 1.5. تشغيل التجربة أدخل التفاصيل الضرورية، بما في ذلك موقع ملفات البيانات. أدخل درجة الحرارة المطلوبة للتجربة. إذا كانت أجهزة الاستشعار لا تزال تتطلب prewetting، حدد الخيار لتأخير بدء التجربة. أخيرا، مرة واحدة كل إعداد العينات كاملة (الخطوة 2) ويتم تحميل كل من لوحة عينة وصينية الاستشعار في الصك، انقر فوق الزر انتقال لتشغيل الفحص. 2. تحضير العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة العازلة المناسبة. العازلة المستخدمة في التجارب هو مبين في الأرقام 3 و 5: 20 ملي اجتماعات الأطراف (3 - (N-Morpholino) حمض propanesulfonic)، تريس (تريس (هيدروكسي) الميثان الأمينية) (المضافة لضبط درجة الحموضة إلى 8.0)، 50 ملي بوكل. وتشمل BSA (ألبومين المصل البقري، الدهنية حمض الحرة، 0.5ملغ / مل النهائي) في المخزن المؤقت لجميع خطوات الفحص وللجميع التخفيفات من البروتين البيروكسيديز أو شريك ملزمة للحد ملزمة غير محدد من البروتينات إلى أجهزة الاستشعار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من البروتين البيروكسيديز (ε) في المنطقة العازلة مقايسة إلى التركيز المناسب (انظر المقدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير التخفيفات الشريك ملزم (F 1 (ε)) في المخزن فحص (انظر مناقشة لمجموعة من تركيزات لاستخدام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewet أجهزة الاستشعار streptavidin المغلفة لمدة 10 دقيقة على الأقل لإزالة طلاء واقية السكروز. إزالة رف المحتوية على الاستشعار من درج أجهزة الاستشعار وإدراج لوحة 96 جيدا في الجزء السفلي من الدرج، وانزلاق زاوية واحدة من لوحة إلى الشق توجيههم على الدرج. للعمود من أجهزة الاستشعار لاستخدامها، إضافة 200 ميكرولتر من العازلة الفحص لكل بئر في هذا العمود من لوحة 96 جيدا. العودة رف من أجهزة الاستشعار لعلبة في الاتجاه الصحيح (مع علامات التبويب في فتحات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تم تعيينها خلال البرمجة في الخطوة 1، وملء الآبار سو لوحة عينة مع العازلة مقايسة أو التخفيفات المناسبة من البروتين، كما في الشكل 2. تجنب إدخال فقاعات، لأنها يمكن أن تسبب الضوضاء في إشارة الضوئية. تشمل واحدة أو أكثر الآبار التي حذفت إشارة إما (ط) المعقدة البيروكسيديز البروتين أو (ب) شريك ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح باب الصك وتضاف علبة استشعار على خشبة المسرح (يسار)، مع علامات التبويب علبة لإدراجها في فتحات المرحلة. إدراج لوحة العينة في حامل لوحة (يمين)، تأكد من أن لوحة مسطحة ويجلس في الاتجاه الصحيح، كما هو مبين على حامل لوحة. يغلق الباب ويبدأ الفحص من البرنامج الحصول على البيانات (الخطوة 1.5). </li></ol> 3. معالجة المعلومات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشغيل الفحص، افتح البرنامج تحليل البيانات وتحميل المجلد الذي يحتوي على البيانات. انقر على &quot;معالجة&quot; التبويب لرؤية قائمة تدريجي تجهيز (في اليسار) والبيانات الخام الحركية، مع كل أجهزة الاستشعار (ه) تعيين لون مختلفة (انظرالشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;اختيار البيانات&quot;، انقر فوق الزر &quot;الاستشعار التحديد&quot;. على &quot;نموذج لوحة الخريطة&quot;، بتعيين الآبار لل1 أو 2 أجهزة استشعار مراقبة (G، H في مقايسة من الشكل 3)، والآبار المرجعية. في القائمة التحميل، حدد المربع &quot;الطرح&quot; وحدد &quot;مرجع ويلز&quot; لطرح إشارة مرجعية (واحد أو متوسط) من كل إشارة استشعار الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة كل أثر لY = 0 باستخدام &quot;محاذاة المحور Y&quot; خطوة. حدد &quot;الأساس&quot; كخطوة المحاذاة (وهذا يجري على خط الأساس الأخيرة قبل جمعية خطوة). ل &quot;المدى الزمني&quot;، أدخل ثانية 10 مشاركة من هذا الأساس (أي 50-60 ثانية لخط الأساس 60 ثانية، كما في الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علامة في المربع &quot;إنتر خطوة تصحيح&quot; لتقليل نوبات إشارة بين الخطوات النقابية والتفكك. حدد محاذاة إلى خط الأساس أو التفكك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد Savitzky-غولي وظيفة التصفية في معظم الحالات، وانقر فوق &quot;بيانات عملية!&quot; والمضي قدما. تفقد البصرالبيانات المعالجة النهائية (أقل اللوحة اليمنى). مع المقايسات المعدة للتحليل بيانات عالمية (كما في الشكل 4)، إذا تبين آثار إشارة تحولا كبيرا بين جمعية والخطوات التفكك، تغيير التحديد من التفكك أو خط الأساس ل&quot;تصحيح المشتركة بين خطوة&quot; واعادة معالجة البيانات قبل الشروع في البيانات التحليل. </li></ol> 4. تحليل البيانات انقر على &quot;تحليل&quot; التبويب في تحليل البيانات للبدء. ملاحظة: الخطوات المثال أدناه هي لأغراض التحليل العالمي للمنحنيات متعددة الملزمة / التفكك (كما في الشكل 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل&quot;خطوة إلى تحليل&quot;، واختيار جمعية والتفكك. ل &quot;الموديل&quot;، حدد 1:1. ملاحظة: هي الخيارات الأخرى المتاحة محدودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل &quot;تركيب&quot;، اختر العالمية (كامل). ل &quot;المجموعة حسب&quot; اختيار اللون (كما في الرسم البياني). حدد &quot;R ماكس غير المرتبطة بواسطة الاستشعار&quot; للسماح المناسب مستقلة عن R ماكس (ردا على إشارة تشبع القصوى الملزمة للتكافؤtner للبروتين يجمد). ملاحظة: نحن نفعل ذلك بالنسبة لمعظم المقايسات، وأجهزة الاستشعار تختلف قليلا في كمية البروتين يجمد (انظر الشكل 3، تحميل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الطاولة هو مبين، تأكد من كل آثار استشعار ليتم تحليلها لها نفس اللون، بحيث سيتم تحليلها كمجموعة العالمية. إذا لزم الأمر، حدد جهاز استشعار واحد أو أكثر يتتبع حذف من المناسب العالمية: تحت عمود &quot;تضمين&quot;، انقر بزر الماوس الأيمن على جهاز استشعار الموقف المطلوب وحدد &quot;استبعاد ويلز&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;منحنيات صالح!&quot; لبدء تحليل الانحدار غير الخطية. دراسة نتائج المناسب، والتي تشمل (ط) تراكب من منحنيات الانحدار مع آثار بيانات الاستشعار (كما في الشكل 4)، (ب) قطع من مخلفات المناسب، و (iii) جدول مع القيم المعلمة العزم (ثوابت المعدل، R كحد أقصى، K D) وإحصاءات (الأخطاء المعيارية للمعلمات، تشي التربيعية، R 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;تصدير البيانات&quot;، لإنقاذ نتائج المناسب بالنقر على &quot;تصدير الجدول إلى ملف CSV&quot;. للالعنبهينج أو مزيد من التحليل للبيانات / منحنيات تركيبها مع البرامج الأخرى، انقر فوق &quot;تصدير نتائج تركيب&quot; لحفظ البيانات كل أجهزة الاستشعار ومنحنى المجهزة في ملف نصي. </li></ol>

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

يعلن الكتاب أن لديهم أي تضارب في المصالح.

الأدوات المتاحة حاليا لBLI تسمح إنتاجية كبيرة والمرونة في المقايسات للتفاعلات الجزيئية البيولوجية. يتم الاستغناء عينات حل مختلف في الآبار لوحة microtiter الأسود، ومجموعة من أجهزة الاستشعار BLI موازية مبرمجة لتتحرك ذهابا وإيابا بين أعمدة من الآبار على طبق من ذهب. وأثار الع?...

البروتين البروتين التفاعلات مهمة لكثير من العمليات البيولوجية، واستخدمت وسائل بصرية خالية من التسمية مثل السطحية بلازمون الرنين (SPR) في المختبر لدراسة حركية ملزمة والتفكك 1. معظم طرق خالية من التسمية لشل حركة جزيء حيوي واحد على سطح أجهزة الاستشعار واستخدام الإشارات الضوئية للكشف عن شريك ملزم من الحل لأنه يربط مع جزيء حيوي يجمد 1. بينما SPR هو طريقة حساسة للغاية، هو عرضة للتدخل بسبب التغيرات في معامل الانكسار من الحل تتدفق على الاستشعار 2. وإن لم يكن حساسة مثل SPR، بيو طبقة التداخل (BLI) وأقل تأثرا بالتغيرات في تكوين العينة 1،3. يستخدم BLI أجهزة الاستشعار الألياف البصرية التي لها طلاء حيويا الملكية في الطرف. النظام المستخدم هنا (محاذية-RED96) يحتوي على ثمانية طيفي. يضخ الضوء الأبيض إلى صف تحقيقات التي تتحرك على الذراع الروبوتية. أجهزة استشعار الألياف البصرية عاختار البريد من قبل تحقيقات وانتقل الى لوحة 96 جيدا تحتوي على عينات. ويجمد واحدة من الجزيئات المستهدفة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي. ثم يتم نقل أجهزة الاستشعار لآبار تحتوي على الشريك ملزم في الحل. BLI تراقب جمعية الشريك ملزم مع جزيء يجمد، ثم تراقب التفكك بعد تحريك أجهزة الاستشعار لحل دون شريك ملزمة. ملزمة للجزيئات على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي يؤدي إلى تغييرات في التدخل البصرية بين موجات الضوء التي تعكس مرة أخرى إلى طيفي من السطح الداخلي والخارجي من واجهة بين أجهزة الاستشعار والحل. هذه التغييرات في التدخل يمكن قياسها كميا، وتستخدم لتحديد معدلات الحركية للملزم والتفكك، على النحو الموجز في الرسوم المتحركة من الشكل 1. لقد طبقنا BLI لقياس التفاعلات المعقدة بين الحفاز سينسيز ATP البكتيرية والوحيدات ε، والتي يمكن لصناعة السيارات في تثبيط الانزيم. ATP سيnthase هو nanomotor جزءا لا يتجزأ من الغشاء الدوارة التي يحفز التوليف والتحلل من ATP 4. مجمع الحفاز (F 1) يمكن أن تكون معزولة في شكل قابل للذوبان الذي يعمل بمثابة أتباز. الوحيدات ε اثنين من المجالات: المجال N-محطة (الأمراض الاستوائية المهملة) ضروري لتجميع المناسبة واقتران وظيفية للانزيم ولكن لا تتفاعل مباشرة مع مفارز الحفاز؛ المجال C-محطة (CTD) يمكن أن تمنع الانزيم من خلال التفاعل مع مفارز الحفاز متعددة 5،6. هذا التنظيم هو بوساطة ε محددة لsynthases ATP البكتيرية وليس لوحظ في نديد الميتوكوندريا. وقد برزت ATP سينسيز كهدف للأدوية المضادة للبكتيريا، كما هو مبين من قبل ادارة الاغذية والعقاقير الموافقة الأخيرة من bedaquiline لعلاج السل المقاوم للأدوية 7. وبالتالي، واستهداف دور ε في المثبطة لاكتشاف المخدرات يمكن أن يسفر عن مضادات الجراثيم التي لا تمنع ATP سينسيز الميتوكوندريا. مع مجمع الحفاز معزولة (F 1)، εيصبح سهل التفريق الوحيدات. ومع ذلك، مع ε بد أن F 1، يمكن للεCTD الخضوع لتغيير متعلق بتكوين دراماتيكية، وإدراج جزئيا في تجويف المركزي الإنزيم وتكوين دولة المثبطة التي من غير المرجح أن تنأى مباشرة 6،8. نستخدم BLI لقياس حركية F 1 / ε ملزمة والتفكك، وبشكل غير مباشر، لدراسة الآثار تفارغي من موقع الحفاز لبروابط على التشكل وε. في نظامنا، ε تم اختياره لتجميد على سطح مستشعر منذ إشارة BLI (مثل SPR) حساس للكتلة جزيئات ملزمة على السطح. الوحيدات ε صغير (15 كيلو دالتون ~) نسبة إلى الرئيسية F 1 مجمع (347 كيلو دالتون ~). وبالتالي، فإن أكبر إشارة BLI تنجم عن ربط F 1 إلى ε يجمد. من أجل رصد F 1 التفكك، والتي يمكن أن تكون بطيئة جدا، ε يجب أن يجمد بشدة. هكذا اخترنا أن biotinylate؛ وشل على أجهزة الاستشعار streptavidin المغلفة. البروتينات يمكن المعقدة البيروكسيديز بنسبة (ط) التعديل عشوائية من سطح lysines 9، (ب) رد فعل السيستين الأصلي أو هندسيا فريدا مع البيوتين maleimide كاشف 10 أو (ج) مضيفا راثيا الببتيد البيوتين متقبل معين يتم المعقدة البيروكسيديز خلال إنزيمي في التعبير المجراة من البروتين الموسومة 11. في نظامنا، والمعقدة البيروكسيديز ε باستخدام طريقة (ج) 8. بمجرد يجمد الموسومة البيوتين ε على أجهزة استشعار streptavidin، يمكن BLI قياس ملزمة وتفكك F 1 التي تم المنضب من الوحيدات ε (F 1 (ε)). للتجارب الموصوفة هنا، قد تم القيام به المقايسات الأولية لتحديد كميات معقولة من البروتين البيروكسيديز لشل على أجهزة الاستشعار. هذا يمكن أن تختلف، اعتمادا على الوزن الجزيئي للبروتين وشريك ملزمة لها، ولكن الهدف هو تحديد كمية ضئيلة من البروتين يجمد ريوفر قبعة (ط) مقبولا الإشارة إلى الضوضاء لحركية ملزمة مع تركيز منخفض من الشريك ملزم (K تحت D) و (ب) الحد الأدنى من التشويه من حركية ملزم مع تركيز تشبع بالقرب من الشريك ملزمة. أيضا، قد تختلف العناصر المتفاعلة من biotinylation (ولكن تجنب&gt; 1 مول البيوتين / البروتين مول)، لذلك قد تكون هناك حاجة إلى بعض الفحص الأولي لكل دفعة جديدة من البروتين البيروكسيديز للتأكد من أن إشارة BLI متسقة يمكن أن يتحقق خلال تجميد على streptavidin المغلفة أجهزة الاستشعار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

وصفنا استخدام بيو طبقة التداخل لدراسة التفاعلات المثبطة للالوحيدات ε مع مجمع الحفاز كولاي ATP سينسيز. البكتيرية نوع F-ATP سينسيز هو الهدف من المضادات الحيوية الجديدة، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لمكافحة السل المقاوم للأدوية. فهم البكتيريا محددة لصناعة السيارات في تثبيط سينسيز ATP من قبل المجال-C محطة من الوحيدات ε يمكن أن توفر وسيلة جديدة لاستهداف إنزيم لاكتشاف أدوية مضادة للجراثيم. المجال-C محطة من ε تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين دراماتيكية عندما التحولات انزيم بين الدول النشطة وغير النشطة، وبروابط الموقع الحفاز يمكن أن تؤثر على أي من التشكل ε هو السائد. التدابير مقايسة حركية ε في ملزمة / التفكك مع مجمع الحفاز، وبشكل غير مباشر الشرق الأوسط وأفريقياسورس التحول من ربط إنزيم ε من وإلى التشكل المثبطة يبدو nondissociable. إشارة التداخل الحيوي طبقة ليست حساسة بشكل مفرط لتكوين الحل، لذلك يمكن أن تستخدم أيضا لرصد الآثار تفارغي من موقع بروابط الحفاز على التغييرات متعلق بتكوين ε ل.

في الوقت الحقيقي ملزمة ويتم عرض حركية تفارق BLI في الشكل 3. وقد تم هذه التجربة مع العازلة مقايسة في تكوين الجمعيات والتفكك. وقد بدأت هذه التجربة مع خطوة أساسية 10 دقيقة منذ أجهزة الاستشعار قد prewet فقط لفترة وجيزة. المقبل، تم تحميل ε المعقدة البيروكسيديز على أجهزة...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

البروتوكولات هنا وصف المقايسات الحركية للتفاعلات البروتين البروتين مع بيو طبقة التداخل. F-نوع ATP سينسيز، التي تشارك في استقلاب الطاقة الخلوية، يمكن تحول دون الوحيدات ε في البكتيريا. تكيفنا الحيوي طبقة التداخل لدراسة التفاعلات المعقدة للالحفاز مع المثبطة-C محطة مجال ε ل.

التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.8K Views.  SUNY Upstate Medical University.  البروتوكولات هنا وصف المقايسات الحركية للتفاعلات البروتين البروتين مع بيو طبقة التداخل. F-نوع ATP سينسيز، التي تشارك في استقلاب الطاقة الخلوية، يمكن تحول دون الوحيدات ε في البكتيريا. تكيفنا الحيوي طبقة التداخ...

Video: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

فحص الكمية والنوعية من التفاعلات الجسيمات الجسيمات الغروية عن طريق مسبار Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

إليسا القائم وتجليد وأسلوب المنافسة لتحديد بسرعة التفاعلات يجند مستقبلات

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

تركيب خالية من يجند أقراص مدمجة النانوية داخل مصفوفة الكبريت كوبوليمر

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

فصل كبريتات التي كتبها الانتقائية تبلور مع يجند مكرر iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

نظرة ثاقبة لتفاعلات الأحماض الأمينية والببتيدات مع المواد غير العضوية عن طريق جزيء واحدة قوة التحليل الطيفي

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

الحصول على قيمة يجند يدعم للانتقال المعادن: معدلة والمتوسط ​​مقياس إعداد 1،2،3،4،5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

يجند بوساطة التنو ونمو البلاديوم معدنية جسيمات نانوية

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.