نشكر الدكتور S. ستيلا وهيلين فونج للمساهمات في بروتوكول التصوير الكالسيوم. نشكر صفائح الدكتور ك لتصوير مشاهد المقابلة. نشكر الدكتور أرلين هيرانو لتعليقاتها على المخطوطة. وأجري هذا المشروع البحث والتطوير من قبل المؤلفين في كلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا ويتم بفضل اتفاق العقد الذي منحت ويديرها البحوث الطبية وقيادة العتاد في الجيش الأميركي (USAMRMC) والتطبيب عن بعد والتكنولوجيا المتقدمة مركز الأبحاث (TATRC)، في فورت ديتريك بولاية ميريلاند تحت رقم العقد: W81XWH-10-2-0077. كما جاء الدعم لهذه الدراسات من المعاهد الوطنية للصحة EY04067 وVA الاستحقاق مراجعة (ملحوظة). الأهلي هو VA الوظيفي عالم أبحاث.

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية من أجل رفاهية حيوانات التجارب الصادرة عن سياسة دائرة الصحة العامة الأميركية على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية وجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) لجنة البحوث الحيوانية. واستخدمت الذكور والإناث الكبار الفئران سبراغ داولي (معمل نهر تشارلز، ويلمنجتون، MA) تتراوح أعمارهم بين 3-5 أسابيع. 1. الحيوانية والأنسجة التحضير لWholemount الشبكية وبروتوكول المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح، 2 ملقط مع نصائح جيدة جدا، مقص، ورقة الترشيح السليلوز، ماصة بلاستيكية وشريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران في غرفة مغلقة من قبل التخدير العميق الحيوان مع 1-3٪ الأيزوفلورين تليها قطع الرأس مع المقصلة. إزالة العينين مع زوج من مقص القزحية وضعها في طبق بتري تحتوي على حل خارج الخلية. السبات A، أميس البياناتينصح المتوسط ​​أبعد أو حلول الفسيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [خطوة اختيارية إذا كان المطلوب ردمها من RGCs مع فلوو-4]. أداء العلامات فلوو-4 كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح (شدة الضوء: 1.6 × 10 8 الفوتونات / مم 2 ⋅sec)، وإزالة القرنية عن طريق قطع الجزء الأمامي من كرة العين. إزالة العدسة والجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية بالملقط. لإزالة الجسم الزجاجي، تحقيق الاستقرار في مقلة العين من خلال عقد الصلبة بحزم مع forcep واحد. قشر بلطف قاعدة زجاجي باتجاه مركز الشبكية مع forcep الأخرى. ويسمى في هذه المرحلة إعداد فنجان العين، والذي يستخدم لcryosections. مزيد من التفاصيل حول cryosections يمكن العثور عليها في المراجع 14،15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشبكية من فنجان العين. ثم، وجعل أربعة تخفيضات للسماح الشبكية لوضع مسطح. جبل بلطف شبكية العين على شريحة المجهر مع مبصرة طبقة فوق. إضافة قطرة واحدة من حل لشبكية العين ووضع مورق الترشيح llulose على شبكية العين. وبمجرد تولي الشبكية إلى ورقة الترشيح، ووضع شبكية العين مرة أخرى في الحل. إذا لزم الأمر، تتسطح في شبكية العين مع فرشاة أو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شبكية العين wholemounted إلى 4٪ PFA لمدة 10-15 دقيقة لتثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل شبكية العين wholemounted ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB)، ودرجة الحموضة 7.4. منع شبكية العين مع 5٪ مصل الماعز العادي أو مصل حمار في 0.1 PB تحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 و 0.1٪ نان 3 في 4 درجات مئوية خلال الليل. نوصي الحجم النهائي من 500 ميكرولتر لكافة الخطوات لإنقاذ عرقلة الحلول والأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، واحتضان wholemounts الشبكية مع الأجسام المضادة الأولية 5-7 أيام في 4 درجات مئوية. يجب تحديد التخفيفات الأمثل من قبل المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل شبكية العين 3 × 30 دقيقة في PB 0.1 M واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الضد الثانوية-fluorophore مترافق المقابل الموجه ضد هذا النوع من الأجسام المضادة الأولية (تركيز 1: 1،000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يغسل النهائية من 30 دقيقة لكل منهما مع PB، تركيب شبكية العين في تصاعد المتوسطة. ختم لل coverslips مع طلاء الأظافر للتخزين لفترة طويلة. تخزين العينات في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء. </li></ol> 2. وصفها من خلايا العقدة والمحاوير في الجرذ Wholemount شبكية العين مع الكالسيوم صبغ المؤشر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1،000 مل من الثدييات التي تحتوي على قارع الأجراس (مم) 125 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 2 CaCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4، 1 MgCl 2 و 25 NaHCO 3، و 10 الجلوكوز فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO &#173; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تشريح كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل خلايا الشبكية العقدة (RGCs) ومحاور مع مؤشر صبغ الكالسيوم، وضخ 0.5 ميكرولتر من فلوو-4 pentapotassium الملح (40 ملي الأسهم في H 2 O) في جذع العصب البصري حوالي 1 ملم الخلفي لمقلة العين باستخدام حقنة . لقياس ارتفاع ديناميكية في الخلايا العقدية [كا 2+ </سوب&gt;] ط مؤشرا مع تقارب عالية، مثل فلوو-4 مع د K لها من 345 نانومتر، هو الأمثل. فلوو-4 تقدم فائدة إضافية تتمثل في وجود كفاءة الكم عالية جدا مما أدى إلى زيادة انبعاث&gt; 100 أضعاف عندما يتجهون إلى الكالسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فنجان العين في الثدييات رينغر فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO &#173; 2 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li></ol> بروتوكول التصوير 3. الكالسيوم لخلايا الشبكية العقدة ومحاور عصبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العين والعدسة والجسم الزجاجي كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،4. عزل الشبكية من فنجان العين وتقسيمها إلى أجزاء. جبل الجانب الخلايا العقدية رباعي واحد حتى على شريحة زجاجية واستخدام شبكة شريحة القيثارة لتحقيق الاستقرار فيه. الحفاظ على القطع الأخرى داكنة تكييفها في الثدييات رينغر فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO &#173; 2 على الجليد لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse غرفة تسجيل مع الثدييات حل رينغر والحفاظ على حل محتدما باستمرار مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الأنسجة تحت المجهر. تجارب السلوك في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) أو تحقيق درجات الحرارة الفسيولوجية التي كتبها الاحترار المرحلة، تسخين حمام الماء تحت عينة أو تطبيق الهواء الدافئ على سطح العينة. ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أن العديد من الوظائف الخلوية وينظم درجة الحرارة، والتي تلعب دورا أساسيا في الحفاظ على توازن بين الخلايا 16. ومع ذلك، اتخاذ تدابير الاحتباس الحراري قد يزيد من معدل photobleaching من، تبخر الانجراف المتوسطة والتركيز الناجم عن التمدد الحراري 17. استخدام درجة حرارة الغرفة بين الخلايا يقلل تجزئة فلوو-4 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء السيطرة على اثنين تقرن عالية K + البقول في غياب المخدرات. يزيل الاستقطاب RGCs وRGC محاور عصبية من خلال رفع [K +] س من 3 ملم إلى 60 ملم لمدة 33 ثانية خلال كل نبضة لتفعيلVGCCs مع نظام superfusion مدفوعة ثمانية الجاذبية القنوات. تقليل الصوديوم بنسبة 57 مم للحفاظ على isosmolarity في ارتفاع الحل K +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم مساهمة VGCCs مختلفة للإشارة الكالسيوم مع استخدام عامة أو محددة حاصرات قناة الكالسيوم. على سبيل المثال، انخفاض في إشارة الكالسيوم التالية إدارة غير محددة حاصرات قنوات الكالسيوم والكوبالت، بشرط إجراء شبه الكمية للمساهمة VGCCs إلى K + عالية إشارة الكالسيوم -evoked. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب القيم كثافة مضان عن طريق وضع المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول RGCs الفائدة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع التغير في كثافة مضان التي تنتجها عالية K + الثاني الذروة إلى التغيير التي تنتجها الأول K + عالية الذروة. ثم، لاختبار محددة حاصرات قنوات الكالسيوم، وتطبيق المخدرات فقط خلال ارتفاع K + نبض الثاني من زوج وتطبيع هذه الذروة ضدقيمة الذروة الأولى. لقياس تأثير الدواء على ارتفاع K + الذروة، تقسيم اتساع K + الثاني الذروة من أن من الأولى. يجب إجراء تحليل على هذه القيم فيما يتعلق مطابقة الضوابط المستمدة من تقرن K + قمم عالية تقاس في غياب المخدرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور في 5 فترات ثانية. لتجنب الصور تبيض، والحفاظ على الإثارة ليزر عند أدنى مستوى ممكن. تقديم الإثارة من قبل خط 488 نانومتر ليزر الأرجون، في حين أن أنبوب مضخم يجمع الانبعاثات الفلورسنت من خلال مرشح LP 505 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat.">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li><li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4.">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li><li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2++channels.">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium--a+life+and+death+signal.">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+microdomains+Organization+and+function.">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist.">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch.">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li><li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves.">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li><li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells.">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li><li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+&#945;(2)&#948;(4)+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina.">Expression of voltage-gated calcium channel &#945;(2)&#948;(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li><li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells.">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+dynamics,+homeostasis+and+remodeling.">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li><li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup.">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4.">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).</li><li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li><li>P&#233;rez deSevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina.">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thy1-CFP+DBA/2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells.">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones.">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li><li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture.">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li><li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat.">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li><li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons.">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li><li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells.">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li><li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells.">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li><li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina.">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li><li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging.">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li><li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter.">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells.">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li><li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم الإفصاحات.

في هذه المقالة، التي وصفناها اثنين من تقنيات مختلفة: 1) المناعية لإظهار فلوو-4 التوطين إلى خلايا العقدة في wholemounts الشبكية، و 2) التصوير الكالسيوم لتحليل ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم. المناعية باست...

خلايا الشبكية العقدة (RGCs) تعبر عن L-، N-، P / Q- وT-نوع VGCC كما هو محدد من خلال الحصار الدوائي من هذه المكونات من خلية كاملة CA القناة الحالية 1،2. VGCC هي بروتينات الغشاء multimeric التي تشارك في إطلاق الإرسال، النسخ الجيني، وتنظيم الخلايا واللدونة متشابك 3،4،5. مصنوعة VGCCs وظيفية من ثلاثة على الأقل فئات متميزة من مفارز: كبيرة، عبر الغشاء α 1 المسام تشكيل مفارز التي تحدد خصائص القناة الفيزيائية الحيوية والدوائية، α مساعد خارج الخلية في المقام الأول 2 δ مفارز وحدات فرعية داخل الخلايا β. وهذا الأخير مجمعين شكل مغايرة التغصن مع مختلف α 1 مفارز وتغير حركية النابضة والاتجار القنوات لغشاء البلازما 6. على مدى العقود الأخيرة، وقد استخدمت العديد من التقنيات لدراسة البروتين expression، مثل المناعية، انزيم مرتبط المناعي فحص وتحليل الغربي والتدفق الخلوي. هذه التقنيات تتطلب استخدام أجسام مضادة محددة للكشف عن بروتين معين من الفائدة وتوفر أدوات قوية لتوطين وتوزيع بروتينات معينة في الأنسجة المختلفة. التقنيات المستخدمة لكشف وتحديد مستويات مرنا التعبير عن بروتين معين مثل تحليل لطخة الشمالي، RT-PCR، في الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR، التهجين في الموقع، ميكروأرس [كدنا] وفحص حماية ريبونوكلياز تقدم نهجا بديلا عندما الأجسام المضادة ليست بسهولة مستويات التعبير المتاحة أو إذا كان من بروتين معين منخفضة 7. ومع ذلك، الحد إلى استخدام مثل هذه التقنيات الجزيئية هو تحديد المطلوب من التسلسل الجيني. في توطين البروتينات في شبكية العين، المناعية يمكن أن يؤديها على شبكية العين wholemount. نظرا لسهولة الحصول على RGCs، وwholemountإعداد يوفر منصة ممتازة لدراسة توطين بروتينات معينة إلى somata RGC والمحاور الخاصة بهم. بالإضافة إلى التعريب، وبعض الخصائص الوظيفية للVGCCs في RGCs يمكن البرهنة من خلال استخدام تقنيات التصوير الكالسيوم. نحن تصف بروتوكول التصوير الكالسيوم لتسمية RGCs انتقائي مع صبغة الكالسيوم مؤشر لقياس ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا. مساهمة VGCCs مختلفة للإشارة الكالسيوم في مقصورات الخلوية المختلفة يمكن أن تكون معزولة مع استخدام النوع الفرعي محددة حاصرات قنوات الكالسيوم. ربما يكون واحدا من أكثر الجوانب المفيدة للتقنية التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا هو القدرة على تسجيل في وقت واحد وبشكل مستقل عن RGCs متعددة والمحاور الخاصة بهم. على الرغم من أن العديد من التقنيات الفسيولوجية، مثل خلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك، وتوفير تسجيلات عالية الدقة الزمنية التيارات الغشاء، وجسدية أو مصدر محور عصبي من تساالتيارات البريد المسجل لا يمكن أن يكون هناك تمييز والتسجيلات لا يمكن إلا أن تكون مصنوعة من الخلايا العصبية واحدة في وقت واحد. صفائف Multielectrode (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) قادرة على تسجيل المسامير وقت واحد من العديد من الخلايا، ولكن يمكن أن لا يكشف ولا تميز تفعيل، على سبيل المثال، أنواع فرعية مختلفة من قنوات الكالسيوم. مياس تسجيل تفضيلي من الخلايا التي تقع على مقربة من قطب معين 8 و سجل من الخلايا التي تولد طفرات كبيرة 9. توفر أساليب التصوير الضوئي استراتيجية بديلة لتمكين التسجيلات في وقت واحد ومستقلة للسكان كامل من الخلايا التي يمكن أن تكون متكاملة مع المعلومات التي تم الحصول عليها من مسرى مكروي خلية واحدة والتصحيح تسجيل المشبك وتسجيل MEA. على الرغم من أن تقنيات التصوير الكالسيوم الموصوفة هنا كانوا يعملون لدراسة ديناميات الكالسيوم من RGCs، المشبك التصحيح والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن أن تستخدم أيضا بشكل متواز لزيادة توضيح التيارات الأيونية وارتفاعه خصائص RGCs. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; منذ خلايا عديم الاستطالات المشردين يشكلون حوالي 60٪ من السكان الخلايا العصبية في طبقة الخلايا العقدية في الشبكية الماوس 10، كان هدفنا لاستخدام تقنية تحميل أن تصف بشكل انتقائي RGCs مع صبغة مؤشر الكالسيوم الاصطناعية في إعداد wholemount. على الرغم من الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم توفر منصة ممتازة لدراسة ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا، وقد أعاق استخدام على نطاق واسع من عدم القدرة على تحميل فعال مجموعات سكانية محددة من الخلايا العصبية ضمن شبكة معينة. وقد أجريت العديد من التقنيات مثل معظم العملية 11 و electroporation 8،12 لتحميل جميع السكان من الخلايا، لكن هذه التقنيات لا تميز بين أنواع معينة من الخلايا. المشفرة وراثيا توفر مؤشرات الكالسيوم القدرة على تسمية انتقائي فئات معينة من السكان من الخلايا، لكن هذه الأساليب تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 13. تصف تقنية لدينا methoد انتقائي لتسمية RGCs في إعداد wholemount عبر العصب البصري جدعة حقن صبغة مؤشر الكالسيوم. أخذت معا، والتقنيات الهيكلية والفسيولوجية الموضحة في هذه المقالة توفر منبرا لدراسة توطين ومساهمة VGCCs إلى إشارة الكالسيوم في RGCs والمحاور الخاصة بهم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

في هذه الورقة وصفنا الأدوات والكواشف، والخطوات العملية اللازمة ل: 1) إعداد الناجح لشبكية العين wholemount لالمناعية و، 2) التصوير الكالسيوم لدراسة الجهد بوابات قنوات الكالسيوم (VGCC) بوساطة إشارات الكالسيوم في شبكية العين خلايا العقدة. أسلوب التصوير الكالسيوم وصفنا القضايا الالتفاف حول تحميل غير محدد من خلايا عديم الاستطالات النازحين في طبقة الخلايا العقدية.

Immunolabeling مع الأجسام المضادة المحددة توفر منصة لدراسة توطين بروتينات معينة من الاهتمام في الشبكية وأسلوب التصوير الكالسيوم يسمح دراسة مساهمة VGCCs لديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم. باستخدام الأجسام ?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

وتستخدم بروتوكولات المناعية لدراسة توطين بروتين معين في شبكية العين. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم.

طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Views.  University of California, Los Angeles.  وتستخدم بروتوكولات المناعية لدراسة توطين بروتين معين في شبكية العين. وتستخدم تقنيات التصوير الكالسيوم لدراسة ديناميات الكالسيوم في خلايا الشبكية العقدة والمحاور الخاصة بهم. 

Video: Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

تصوير ثنائي الفوتون والكالسيوم واسع المجال في القولون العلوي

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن الترميز العصبي وآليات المعالجة البصرية في القولون العلوي 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...