الزيتون السفلي هو الجزء الأكثر بطنية من النخاع ، وبالتالي من الصعب للغاية الوصول إليه في حي. هنا، نقدم بروتوكولا لفضح جذع فأرة الكبار من الجانب البطني، واستخدام عدسات GRIN لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الزيتونية السفلية التي تعبر عن مستشعرات الكالسيوم. تتجنب هذه الطريقة الضرر الذي يلحق بجنع الدماغ الحرج للحياة، وتمكن من إجراء تحقيقات حول أنماط النشاط المكاني والزماني ودمج المدخلات في الزيتون السفلي.
وبما أن العملية تتم في منطقة الحلق المعقدة مع العديد من الهياكل الحيوية ، فمن الضروري أن يتم إجراؤها من قبل باحث ذو مهارات جراحية عالية المستوى. إعداد أنبوب التنبيب عن طريق قطع 5 إلى 6 ملليمتر طويلة و0.8 ملليمتر فتحة واسعة من غيض من قسطرة قياس 20. إعداد إبرة حادة ومنحنية عن طريق قطع طرف قبالة، والرمل سطح الكسر، وثنيه مع plier.
وسوف تستخدم هذه لدعم القصبة الهوائية أثناء القصبة الهوائية. تمييع 15 ملليغرام لكل الكيتامين ملليلتر مع المالحة إلى 15٪ تجميع أدوات الجراحة والمواد الاستهلاكية. تعيين وسادة التدفئة إلى 38 درجة مئوية.
بدوره nosecone 180 درجة أفقيا في إطار ستيريوتاكسيك. وزن الماوس الذي الزيتون السفلي كان سابقا المصابة من قبل GCaMP6s تحمل الفيروس، وحساب كمية الكيتامين المخفف للحقن. قبل ملء مربع التعريفي مع 5٪ isoflurane، وتخدير الماوس.
جبل الماوس في إطار ستيريوتاكسيك، الجانب البطني لأعلى. حلق الفأر منطقة الحلق والفخذ. إزالة الشعر المتبقية مع كريم إزالة الشعر.
تطبيق موضعي هلام xylocaine على جلد الحلق. راقب درجة حرارة الماوس باستخدام مستشعر حراري مستقيمي. حقن ملليلتر واحد قبل تسخينها المالحة intraperitoneally.
تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة قوية على أصابع الساق الخلفية. وينبغي عدم إثارة أي استجابة يمكن اكتشافها. إجراء شق عمودي في جلد الحلق على طول خط الوسط.
فصل جلد الرقبة من الأحشاء تحته باستخدام طريقة تشريح حادة وقطع الجلد. الغدد اللعابية الحرة من النسيج الضام، والوجه لهم أفقيا لفضح القصبة الهوائية المغطاة بالعضلات sternothyroid. حقن Intraperitoneally الجرعة الأولى من الكيتامين المخفف في خمسة ملليلتر لكل كيلوغرام من وزن الحيوان.
تقسيم بعناية العضلة sternothyroid على طول خط الوسط مع غيض من ملقط غرامة لفضح القصبة الهوائية. فصل القصبة الهوائية من الأوعية الدموية والمريء مع ملقط باستخدام طريقة تشريح حادة. حقن جرعة ثانية من الكيتامين المخفف في 2.5 ملليلتر لكل كيلوغرام من وزن الحيوان.
إدراج عبر إبرة حادة تحت القصبة الهوائية. رفع القصبة الهوائية مع إبرة حادة. جعل الخيط خياطة تدور حول حلقة القصبة الهوائية الثالثة، caudal الغدة الدرقية، مع إبرة نصف دائرة.
جعل أربعة ربطات صك على هذا الخاتم. ثقب جلد الصدر مع نفس إبرة نصف دائرة وقيادة الخيط من خلال الجلد. رفع القصبة الهوائية بلطف مع الخيط، وقطع القصبة الهوائية إلى الغدة الدرقية.
سحب القصبة الهوائية نحو جلد الصدر. رفع فتح القصبة الهوائية عن طريق إضافة قطعة صغيرة من الإسفنج الجراحي تحته. إزالة أي السائل المتبقي داخل الطرف الافتتاحي من القصبة الهوائية مع شريط رقيقة من تنظيف الأنسجة.
قم بتبديل تدفق الأيزوفلوران من nosecone ستيريوتاكسيك إلى أنبوب التنبيب. أدخل أنبوب التنبيب في القصبة الهوائية. تأكد من أن جزءا من الشق في الأنبوب يبقى خارج القصبة الهوائية للسماح بالتنفس.
إصلاح القصبة الهوائية إلى جلد الصدر الماوس عن طريق جعل ثلاثة إلى أربعة ربطات الصك. ربط القصبة الهوائية مع الخيط خياطة لتأمين أنبوب التنبيب. شق العضلة sternothyroid على طول ألياف العضلات مع ملقط غرامة.
قطع الجزء المعزول قبالة مع مقص الربيع. خالية بعناية بقايا القصبة الهوائية والحنجرة من العضلات لتقليل الضرر على الأوعية الدموية في العضلات. إزالة بقايا القصبة الهوائية والحنجرة.
المريء مجانا من الأنسجة المرفقة مع ملقط وقطع عليه مع مقص الربيع. إزالة العضلات الطولية التي تغطي جذع الدماغ والقوس البطني للأطلس. إزالة العضلات التي تغطي قوس أطلس البطني والدرنة الأمامية.
قطع الأقواس البطنية من أطلس مع rongeur. إزالة الدرنة الأمامية من أطلس. إزالة الدم والسوائل لعرض ماغنوم foramen وسيقان الدماغ.
توسيع ماغنوم foramen عن طريق إزالة العظام القذالي مع rongeur. إزالة الغضروف، وتقشير بعناية طبقة المنظار من ماتر دورا مع ملقط غرامة أن يكون لها رؤية واضحة لعظم الدماغ البطني. قم بمشبك مستشعر SpO2 على فخذ الفأرة لمراقبة العلامات الحيوية مثل معدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين ومعدل التنفس.
قم بتركيب عدسة GRIN على قضيب الزرع. تنظيف العدسة بعناية مع 70٪ الإيثانول غارقة في تنظيف الأنسجة. إصلاح قضيب زرع على إطار ستيريوتاكسيك وجبل المجهر مصغرة على قضيب زرع.
إضافة عدة قطرات من المالحة في منطقة جذع الدماغ لغمر عدسة GRIN. اقترب من جذع الدماغ بعدسة GRIN. يمكن العثور على GCaMP6s التي تعبر عن خلايا عصبية زيتونية أدنى في المنطقة السطحية في منطقة مستطيلة الشكل ، حوالي 0.5 إلى 1.7 ملليمتر وردية إلى الأطلس المتبقي ، وحوالي 2.6 إلى 1.1 ملليمتر الجانبي إلى خط الوسط.
بدوره على LED الأزرق الإثارة في المجهر مصغرة لتحديد موقع GCaMP6s الخلايا العصبية الزيتون السفلي المصابة. تظهر الخلايا العصبية كثافة مضان خط الأساس المختلفة بسبب مستوى التعبير GCaMP6s المختلفة. تغيير مستوى الكالسيوم من الخلايا العصبية الزيتون السفلي دائرة سوماتا في الفيديو على اليسار سوف تظهر لنا دلتا F مقسومة على آثار F على اليمين.
على الرغم من أن الماوس يبقى دافئا ورطبا ، إلا أنه سيضعف حتما بسبب التخدير والجراحة لفترات طويلة. من الضروري الحفاظ على مدة الجراحة قصيرة حتى تكون الحالة البدنية للفأرة جيدة للتسجيل. يمكن للباحث الماهر إنهاء الجراحة في 70 دقيقة.
يمكن استخدام هذه الطريقة ، مع التعديلات ، لدراسة المناطق المجاورة الأخرى من جذع الدماغ البطني.
