يمكن استخدام هذه التقنية لتعزيز فهمنا للتعامل مع الكالسيوم في الخلايا العصبية ، وكيف يمكن للكالسيوم المجزأ تنظيم الآليات المختلفة المهمة لوظيفة الخلايا العصبية في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدقة أعلى للتصوير السريع في الجسم الحي في ظل الظروف الفسيولوجية في C.elegans التي يمكن دمجها مع أدوات الفلورسنت الأخرى. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة حول الآلية التي تنظم إشارات الكالسيوم في الخلايا العصبية في العديد من السياقات المختلفة.
على سبيل المثال ، أثناء الشيخوخة ، وإصابة الخلايا العصبية ، والتنكس العصبي. ويوضح هذا الإجراء إينيس ديهل ، فني أبحاث. كاز نايت ، مرشح دكتوراه ، وراشيل دوسر ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري.
ابدأ باستنساخ متجهات التعبير التي تحتوي على مروج متبوعا بمؤشر الكالسيوم ، وثلاثة UTR رئيسية من اختيارك. قم بإنشاء سلالات C.elegans المعدلة وراثيا عن طريق الحقن المجهري لمزيج الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي المنقذ Lin-15 plus في جين التحوير لمؤشر الكالسيوم في الغدد التناسلية ل C.elegans البالغة من العمر يوما واحدا. حافظ على الديدان الأم المحقونة عند 20 درجة مئوية حتى تصل ذرية F1 إلى مرحلة البلوغ.
حدد البالغين المحورين وراثيا عن طريق فحص غياب النمط الظاهري متعدد الفرج. يشير ذلك إلى التعبير عن مجموعة الكروموسومات الإضافية التي تحتوي على مؤشر الكالسيوم. نسل F1 الكبار مرور Clonally التي لا تملك النمط الظاهري متعدد الفرج.
إجراء تجارب على الأجيال اللاحقة من السلالات المعدلة وراثيا مع التعبير الأمثل لمؤشر الكالسيوم. استخدم مجهرا قادرا على التصوير بفاصل زمني طويل المدى. حدد موقع الدودة تحت هدف تكبير منخفض ثم قم بالتبديل إلى هدف تكبير مرتفع لتحديد موقع الخلايا العصبية.
احصل على الصور باستخدام كاميرا فائقة الحساسية قادرة على التقاط الصور بسرعة تزيد عن 50 إطارا في الثانية. بعد ذلك ، استخدم مرشح انبعاث قياسي لمؤشر الكالسيوم. أضف مصحح الانجراف Z للحصول على تدفقات الصور التي تزيد مدتها عن 10 ثوان.
في أنبوب استزراع زجاجي 13 × 100 ملم ، قم بإعداد ثلاثة ملليلتر من أجار 10٪ عن طريق إذابة أجار الدرجة الجزيئية في M9 والميكروويف لعدة ثوان. لجعل منصات أجار ، أولا ، قم بإعداد شريحتين عن طريق إضافة طبقتين من شريط المختبر. ثم ضع شريحة مجهر بين الشريحتين.
اقطع طرف طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر واستخدمه لامتصاص قطرة صغيرة من الآجار في وسط قسيمة الغطاء. قم بتسطيح الآجار بالضغط على شريحة أخرى لأسفل أعلى الآجار. بعد التبريد ، قم بقطع الآجار إلى قرص صغير باستخدام فتحة أنبوب سعة 10 ملليلتر ، ثم قم بإزالة الأجار المحيط.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول درفلة الدودة عن طريق إذابة مسحوق الموسيمول في M9 لإنشاء مخزون 30 مللي مولار. تمييع المخزون بنسبة واحد إلى واحد مع حبات البوليسترين لجعل حل المتداول. لوضع الدودة للتصوير ، أولا ، ضع 1.6 ميكرولتر من محلول الدرفلة على وسط وسادة أجار.
ثم باستخدام اختيار دودة مفضل ، انقل دودة من العمر المطلوب إلى محلول الدرفلة على وسادة أجار. انتظر لمدة خمس دقائق تقريبا حتى يقلل muscimol من حركة الدودة ، ثم قم بإسقاط غطاء 22 × 22 ملم فوق وسادة أجار. لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني ، قم بلف الدودة عن طريق تحريك زلة الغطاء قليلا.
لتركيب الدودة على المجهر ، ضع قطرة من زيت الغمر على قسيمة الغطاء. ابحث عن الفيروس المتنقل باستخدام هدف تكبير منخفض في برايتفيلد. ثم قم بالتبديل إلى هدف 100x وحدد موقع عصفور AVA باستخدام إضاءة GCaMP أو mito GCaMP باستخدام ليزر التصوير 488 نانومتر.
بالنسبة للتصوير GCaMP في الجسم الحي ، اضبط ليزر التصوير في إعدادات الاكتساب حتى يصبح مضان الريحان GCaMP في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكي للكاميرا واضبط وقت التعرض على 20 مللي ثانية. بعد تحديد موقع عصور AVA باستخدام مضان GCaMP عند تكبير 100 مرة ، اضبط مصحح الانجراف Z ، وابدأ التركيز التلقائي المستمر. قم بتصحيح المستوى البؤري يدويا حسب الحاجة قبل التصوير.
احصل على دفق من الصور بتكبير 100 مرة. باستخدام هذا البروتوكول ، تم قياس الكالسيوم السيتوبلازمي بدقة زمنية ومكانية عالية. كشف التعبير الخاص بالخلية ل GCaMP6F في الخلايا العصبية الداخلية لأمر AVA glutamatergic عن انتشار اتجاهي لتدفق الكالسيوم.
أظهر القياس الكمي تحت الخلوي لفلورة GCaMP6F أن بداية تدفق الكالسيوم قد تأخرت في جزء من الخلايا العصبية الواقعة على بعد 10 ميكرومتر فقط. أيضا ، أظهرت الهياكل الشبيهة بالعمود الفقري التغصني الموجودة على طول عصبة AVA ومضات في مضان GCaMP6F حدثت بشكل مستقل عن تنشيط الخلايا العصبية ولم تؤد إلى انتشار تدفق الكالسيوم. علاوة على ذلك ، تم قياس مستويات الكالسيوم النسبية في الميتوكوندريا الفردية في الخلايا العصبية المفردة باستخدام سلالة دودة مع تعبير محدد AVA لمصفوفة الميتوكوندريا مؤشر الكالسيوم الموضعي ميتو GCaMP.
أظهرت النتائج الامتصاص المتزامن لكمية كبيرة نسبيا من الكالسيوم في مجموعة فرعية من الميتوكوندريا. على وجه التحديد ، تمت مزامنة امتصاص الكالسيوم في بعض الميتوكوندريا ، في حين لا يبدو أن الميتوكوندريا المجاورة تمتص الكالسيوم. وبالمثل ، أظهرت مجموعات فرعية من الميتوكوندريا امتصاصا سريعا وإطلاق كميات صغيرة من الكالسيوم.
يبدو أن هذا أيضا متزامن ولكن فقط لمجموعة فرعية من الميتوكوندريا. السرعة والتلاعب الدقيق ضروريان لتحديد المواقع للحيوانات والحفاظ على وظيفة الخلايا العصبية. صحة الحيوان هي أيضا ذات أهمية قصوى.
حتى القليل من الجوع يمثل مشكلة. أصعب جزء للتعلم هو التوجيه السريع للحيوانات للفحص المجهري متحد البؤر دون ضرر. نصيحتي هي الكثير من الممارسة والضوابط الجيدة.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التجارب التي يتم فيها إطلاق الكالسيوم من مواقع تحت خلوية أخرى في الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية الأخرى أو الخلايا الأخرى غير الخلايا العصبية في C.elegans. نظرا لأن هذا النهج في C.elegans يترك الحيوانات سليمة ، فمن الممكن معالجة الأسئلة حول تنظيم التعامل مع الكالسيوم تحت الخلوي في الجسم الحي في الخلايا العصبية المفردة للجهاز العصبي الكامل.
