معتمد من قبل MT دكتوراه studentship [المرجع. 092839/Z/10/Z] وCR من قبل جائزة الباحث جديد [المرجع. 095623/Z/11/Z] من ويلكوم ترست.

1. اختياري: إعداد افى جل الهيبارين الخرز (جل الخرز) لFBM الفحص الجذب ملاحظة: إعداد حبات هلام قبل بدء الإجراء يزدرع 1 على الأقل يوميا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 100 ميكرولتر هلام الهيبارين حبة التعليق مع برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 20 دقيقة على الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز بيليه في جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول لمدة 5 دقائق في 13،000 ز س. إضافة برنامج تلفزيوني العقيمة وكرر الإجراء الغسيل 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، إزالة برنامج تلفزيوني ونقع حبات في كمية صغيرة من محلول معقم يحتوي على البروتين المؤتلف في الاختيار، مع الحرص على تغطية الخرز مع الحل. يستخدم هذا البروتوكول 100 نانوغرام / ميكرولتر VEGF165 الإنسان المؤتلف في برنامج تلفزيوني لإعادة إنتاج التجربة المنشورة سابقا 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات هلام الهيبارين مع الحل البروتين المؤتلف مدة لا تقل عن 12 ساعة وبحد أقصى 1 الاسبوع على الأسطوانة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. طلاء الثقافة إدراجق إإكسبلنتس الدماغ المؤخر يتم تربيتها على ثقافة كورنينج إدراج مع حجم المسام 8 ميكرون، أو إدراج ما يعادلها. إدراج الثقافة يمكن إعادة استخدامها بعد الانتهاء من البروتوكول، شريطة أن يتم غسلها بالماء المقطر، تعقيمها مع الايثانول، وتخزينها في الايثانول 70٪ لحين الحاجة إليها. ملاحظة: يجب أن تتم الخطوات التالية في غطاء تدفق تحت ظروف معقمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الإعلام ثقافة يزدرع تتكون من المتوسطة Neurobasal تستكمل مع B27 (20 ميكرولتر / مل)، والجلوكوز (6 ملغ / مل)، والبنسلين / الستربتوميسين (5 ميكروغرام / ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة غسل يدرج مع برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 5 دقائق وجاف لمدة 5-10 دقيقة تحت غطاء تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج ثقافة واحدة في كل بئر الفردية من لوحة 12well. ملاحظة: قد تحتاج إدراج دفعة صغيرة لتناسب بإحكام في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية إدراج الثقافة مع 10-20 ميكروغرام / مل laminin الماوس في المتوسطة Neurobasal ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO <sub&gt; 2) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: طلاء ينبغي الاضطلاع بها في يوم explanting. </li></ol> 3. تشريح Hindbrains من E11.5 أجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعدام توقيت الماوس الإناث الحوامل مع إجراء الموافقة أخلاقيا في يوم الجنينية (E) 11.5 ووضع الرحم الذي يحتوي على الأجنة في طبق من البلاستيك 100 ملم مع الثلج الباردة المتوسطة L15. ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تشريح L15 في الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح وملقط دومون ساعاتي عدد 5، تمزق جدار عضلة الرحم للكشف عن الأجنة، وإطلاق سراح كل جنين، قطع الحبل السري، وإزالة بعناية الكيس المحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستير البلاستيك مع فتحة واسعة الجوف، ونقل كل جنين في طبق من البلاستيك نظيفة مع L15 الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط دومون، وقطع رأس الجنين فقط فوق الأمامية. إذا كانت التجربة يتطلب التنميط الجيني للأجنة، وجمع عينات من الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني (مثل PIEC الصغيرة(ه) من الكيس المحي أو الذيل غيض 16،20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره الجانب الظهري يصل رئيس وتحديد البطين ال 4، التي تغطيها طبقة رقيقة الأنسجة (الشكل 2B). بيرس بعناية roofplate والبدء في قشر بعيدا نحو caudally على طول خط الوسط على الدماغ المؤخر الخلفي والحبل الشوكي، وrostrally على الدماغ المتوسط. وينبغي الآن أن يتعرض الدماغ المؤخر (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بعناية بعيدا المتبقية اللحمة المتوسطة الرأس وأي السحايا التي تعلق على الجانب حنوني من الدماغ المؤخر (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنسجة الحبل الشوكي والدماغ المتوسط ​​بحيث unfurls الدماغ المؤخر، ويمكن أن شقة تقع في إعداد كتاب مفتوح (الشكل 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجموعة واسعة الجوف باستور ماصة بلاستيكية، ونقل كل تشريح الدماغ المؤخر لوحة 12 جيدا تحتوي على الجليد الباردة L15 وتخزينها على الجليد حتى تم تشريح كل hindbrains. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجموعة واسعة الجوف باستور ماصة بلاستيكية، ونقل خطيئةغلي الدماغ المؤخر إلى الطبق الفارغ، وابقائها مفتوحة لإعداد الكتاب، الجانب البطين تصل، في قطرات من تقريبي 100 ميكرولتر L15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عدد قليل من ميكرولتر من الخرز هلام الهيبارين المحتضنة لنفس الحبرية. ملاحظة: نظرا لأن أحجام من الخرز هي المتغير، فإنه من المستحسن لنقل حوالي 10 حبات ومن ثم اختيار الحجم الأمثل لزرع في الدماغ المؤخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المسيل للدموع صغيرة في الأنسجة الدماغ المؤخر وإدراج بعناية 1-3 حبات هلام في الأنسجة الدماغ المؤخر على مستوى R5 / 6، حوالي نصف الطريق بين خط الوسط والحافة الجانبية من الدماغ المؤخر، وخفض لهم في الأنسجة بحيث يتم وضع حبة فقط تحت سطح الدماغ المؤخر. ملاحظة: قد يستغرق الإجراء تشريح بين 5-20 دقيقة / الدماغ المؤخر، اعتمادا على الخبرة، ويمكن أن تمتد على مدى فترة ممتدة إذا الفضلات كبيرة، وفي أي حال، ينبغي أن يكون hindbrains في الثقافة لا تزيد عن 3 ساعة بعد الوفاة من أجل الخير النتائج. </li></ol> 4. الدماغ المؤخريزدرع الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة تحتوي على إدراج ثقافة من الحاضنة، نضح الحل laminin الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج ثقافة واحدة في طبق ثقافة منفصلة مليئة الجليد الباردة L15 و، وذلك باستخدام مجموعة واسعة الجوف باستور ماصة بلاستيكية، ونقل كل جانب بطني الدماغ المؤخر حتى على إدراج الثقافة (الشكل 2G). الدماغ المؤخر يجب الاستلقاء تماما على غشاء إدراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية إدراج الثقافة من الطبق وربت عليه عدة مرات على المناديل الورقية النظيفة لإزالة السائل الزائد. هذه العملية يضمن أن الدماغ المؤخر تتمسك إدراج الثقافة في شقة، وإعداد كتاب مفتوح. إذا كان الدماغ المؤخر تجعيد الشعر حتى، نسيجه قد تنمو بشكل لا رجعة فيه معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الأصلي لوحة 12 جيدا مع 500 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة prewarmed ووضع إدراج مرة أخرى في هذه البئر. ضبط دقيق لحجم 400-600 ميكرولتر مع آخر من وسائل الإعلام لتغطية مجرد الدماغ المؤخر، وضمان أن الدماغ المؤخر لا تطفوقبالة الغشاء. إذا كان يطفو، والعودة إلى الخطوة 4.4 وكرر حتى يبقى الدماغ المؤخر تعلق على الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه المرحلة، فمن الممكن إضافة مثبطات البيولوجية التي تهم وسائل الإعلام لدراسة تأثيرها على هجرة الخلايا العصبية FBM. ملاحظة: إذا زرع الخرز أو إدارة العلاجات الأخرى، فمن المستحسن للحفاظ على الأقل 2 إإكسبلنتس السيطرة في ظل ظروف النمو الطبيعي في التجربة لضمان أنه قد تم تعيين ما يصل التجربة بنجاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إإكسبلنتس ل24-30 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). </li></ol> 5. Wholemount مناعي تلطيخ من الدماغ المؤخر إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من كل بئر، وشطف في برنامج تلفزيوني وإصلاح لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف في الجليد الباردة 4٪ الفورمالديهايد (طازجة أو إذابة حديثا بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني المنحل). ملاحظة: لا تحاول إزالة الدماغ المؤخر من إدراج الثقافة قبل التثبيتاكتمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف 3X مع برنامج تلفزيوني. قشر بعناية hindbrains من إدراج الثقافة باستخدام ملقط دومون. بعض إإكسبلنتس يصعب تقشر، ولكن يمكن عادة رفع عن طريق تطبيق ضغط لطيف من خلال طرد بشكل متكرر في برنامج تلفزيوني من ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل hindbrains إلى 2.0 مل أنابيب القاع مستديرة لوضع العلامات المناعي. Permeabilize hindbrains لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ TritonX-100 (PBT) مع المتداول لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ساعة على RT في PBT تحتوي على 10٪ مصل الماعز العادية المعطل الحرارة مع المتداول لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إإكسبلنتس مع المتداول لطيف في 4 درجات مئوية لمدة 5 أيام مع الأجسام المضادة الأولية محددة لISL1، المخفف 1:100 في PBT تحتوي على 1٪ الحرارة المعطل مصل الماعز العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لل explants في RT 4X مع PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إإكسبلنتس مع المتداول لطيف على RT لمدة 3 ساعة مع fluorophore مترافق الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة (مثل اليكسا فلور 488 الماعز المضادةالماوس، المخفف 1:200) في PBT تحتوي على 1٪ الحرارة المعطل مصل الماعز العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لل explants 4X على RT مع PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع المتداول لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> POSTFIX لل explants في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية شريحة زجاجية مع 3 طبقات من الشريط الكهربائي الأسود والمكوس مع مشرط مربع صغير من الشريط الطبقات لإنشاء جيب لللل explants، بدلا من ذلك، استخدم شريحة زجاجية الاكتئاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل الدماغ المؤخر في SlowFade كاشف في جيب واحد، وتغطي مع ساترة الزجاج، وتجنب بعناية لفقاعات الهواء فخ والصورة باستخدام المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر. ملاحظة: كبديل لالمناعية، الموقع التهجين مع riboprobes التي تعترف FBMs (أي Isl1 أو Phox2b) في يمكن استخدامها لتصور الخلايا العصبية FBM 16،21. </li></ol> ملخص من الخطوات وتوقيت توقيت التزاوج للحصول على الحمل E11.25: ~ 14 يوما اختياري: حبة إعداد (Protocoل 1): ~ 2 ساعة، في اليوم قبل الجنين العزلة إعداد إدراج الثقافة والإعلام (بروتوكول 2): ~ 30 دقيقة، قبل الجنين العزلة عزل الجنين وتشريح الدماغ المؤخر (الخطوات 3،1-3،4): ~ 10 دقيقة / جنين تشريح الدماغ المؤخر (الخطوات 3،5-3،7): ~ 5-10 دقيقة / الدماغ المؤخر الإجراء يزدرع (الخطوات 3،8-3،9): ~ 5-10 دقيقة / الدماغ المؤخر اختياري: زرع حبة (الخطوات 3،10-3،11): ~ 5-10 دقيقة / الدماغ المؤخر الثقافة ازدراع (الخطوة 4.7): 24 ساعة تثبيت لتلوين الأجسام المضادة (الخطوة 5.1): 2 ساعة الإجراء تلطيخ والتصوير (بروتوكول 5): 5 أيام

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

أيا من الكتاب والمصالح أو المصالح المتضاربة المتنافسة.

يصف هذا البروتوكول ثقافة wholemount من hindbrains E11.5 الماوس في نظام transwell لدراسة هجرة الخلايا العصبية FBM. هذا البروتوكول يسمح motorneurons الماوس الدماغ المؤخر إلى أن تبقى على قيد الحياة والهجرة لمدة 24 ساعة، مما يتيح التلاعب فيفو السابقين. هذه الطريقة لها العديد من المزايا التجريبية للمحققين الذين يسعون إلى تحديد الآليات الجزيئية والخلوية للهجرة الخلايا العصبية. في حين المقايسات الهجرة التقليدية ازدراع قطع صغيرة الأنسجة العصبية في مصفوفة على أطباق الثقافة وتمكين المراقبة من الخلايا العصبية الفردية كما أنها تستجيب للمؤثرات الخارجية، وميزة كبيرة للمقايسة transwell هو مدى ملاءمتها لمعالجة الخلايا العصبية المهاجرة ضمن بيئة الجهاز المضيف، وبالتالي أكثر سياق الفسيولوجية. الأهم من ذلك، مواد يمكن تطبيقها بسهولة إلى الدماغ المؤخر إإكسبلنتس فيفو السابقين لاختبار تأثيرها على هجرة الخلايا العصبية، التحايل على الآثار الجانبية المحتملة المرتبطة administeترن هذه المواد إلى ماوس الحوامل. أخيرا، يسمح للنموذج الجسم الحي السابقين أيضا اختبار المواد التي لا عبور حاجز المشيمة، مثل الأجسام المضادة حجب وظيفة. نظرا لهذه المزايا، يقدم فيفو السابقين الدماغ المؤخر الثقافة بديل وطريقة مكملة لاستخدام الأجنة الزرد، والتي يمكن علاجها مع الماء جزيئات صغيرة قابلة للذوبان في الماء الحوض، أو في الرحم التثقيب الكهربائي من العقول الجنينية، الأمر الذي يتطلب استخدام المتخصصة معدات وأكثر صعوبة لإتقان هذه التقنية من الثقافة الموصوفة هنا. ميزة أخرى لبروتوكول الموصوفة هنا هو قابليته لزرع حبات غارقة في المؤتلف البروتين أو الكواشف الأخرى، وبالتالي السماح للتطبيق طريقة الجنينية القياسية وضعت لمعالجة الأجنة فرخ لنموذج الفأر من هجرة الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، فيفو السابقين نموذج الثقافة يمكن تطبيقها على hindbrains من الفئران المعدلة وراثيا defecTIVE في جزيئات محددة متورطة في هجرة الخلايا العصبية، مثل النمو أو عامل التوجيه المستقبلات، وجنبا إلى جنب مع يزرع حبة لاختبار إذا فقدت القدرة على الاستجابة للبروابط. بالإضافة إلى التلاعب الدوائية، ويمكن أيضا أن تتكيف على فيفو السابقين الثقافة بروتوكول ل electroporate ناقلات التعبير التي يمكن التلاعب التعبير عن الجينات في المصالح؛ الأساليب المناسبة ل electroporation سبق وصفها 22،23. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لتصور هجرة الخلايا العصبية بواسطة الوقت الفاصل بين المجهري في إإكسبلنتس الدماغ المؤخر من الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على الخلايا العصبية FBM fluorescently المسمى، على سبيل المثال، لجنة المساواة العرقية Isl1؛ Rosa26Yfp 21. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة أنواع أخرى من الخلايا العصبية المهاجرة في الدماغ المؤخر، مثل تلك التي تشكل الزيتون السفلي، على الرغم من أن هذا من شأنه أن يتطلب استخدام hindbrains في المراحل الجنينية وكبار السن قد تتطلب الثقافة لمدة تصل إلى 48 ساعة، اعتمادا على الجدوى العصبية <em&gt; فيفو السابقين. الخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لنجاح هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان أن يتم جمع الأجنة في وقت مبكر يوم E11.5 اليوم، أقرب إلى E11.25، عندما FBM الخلايا العصبية الهجرة قد بدأت للتو. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن دائما للقبض على الأجنة في هذه المرحلة التنموية بسبب تقلب التزاوج الطبيعي من الفئران، وفقا لذلك، قد يكون هناك بعض التباين في توسيع نطاق الهجرة FBM بين تجارب مختلفة. ويمكن أيضا أن يلاحظ التباين في الهجرة FBM إذا لم يتم الانتهاء من التجربة ضمن الإطار الزمني المعين، حوالي 3 ساعة، كما يمكن أن يرى في الشكل 3E. نسيج الدماغ المؤخر من E11.25 أجنة الفئران حساسة. عند تشريح وطوال الإجراء يزدرع، فمن المهم أن لا تمزق الأنسجة الدماغ المؤخر في مجالات من R4-R6 حيث توجد الخلايا العصبية FBM. نظرا لطبيعة حساسة من ديسعملية ection، ولأن السرعة التي يتم وضعها hindbrains في الثقافة تؤثر النتيجة، قد يستغرق هذا الإجراء بضع الممارسة يعمل لسيده، ولا سيما قبل أن يتم استخدام العينات الثمينة أو الكواشف. أخيرا، من المهم أن يتم وضع الأنسجة في الدماغ المؤخر تكوين كتاب مفتوح على إدراج الثقافة، للطي من الأنسجة الدماغ المؤخر خلال الثقافة ومنع الهجرة FBM العادي (انظر الشكل 3F).

يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين من الدماغ، ولكن في وقت لاحق الهجرة إلى وجهات جديدة للوصول إلى المناطق المستهدفة المناسبة التي تقع على مسافة كبيرة. في الموضع الصحيح من أجسام الخلايا العصبية في الأماكن المناسبة على طول محاور ظهراني بطني والأمامي الخلفي من الدماغ النامية أمر ضروري لالأسلاك الصحيح والبقاء، وظيفة هذه الخلايا العصبية بعد المرحلة المهاجرة 1-4. على غرار الآليات الجزيئية التي تتحكم في محوار 5-7 التوجيه، ويعتقد أن مجموعات اندماجي من العظة جذابة ومثيرة للاشمئزاز لتوجيه الخلايا العصبية المهاجرة 1،8. ولكن نظرا لتفاعلات أنواع خلايا متعددة، وإشارات التحكم هجرة الخلايا العصبية وقد تم دراسة على نطاق واسع أقل من تلك التي تشارك في التوجيه محور عصبي، والتي يمكن دراستها خلية مستقلة. وقد استخدم الدماغ المؤخر النامية من الفقاريات في العديد من الدراسات الحديثة لفهم الآليات الجزيئية والخلويةالهجرة العصبية، على سبيل المثال في الفرخ، والماوس، والزرد 1-4،9. هذا الجهاز يحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك عدة أنواع فرعية من الخلايا العصبية الحركية وprecerebellar 5،7،10،11. يولدون motorneuron الدماغ المؤخر في منطقة البطين بالقرب من floorplate، وأنها تفرق في مجموعات فرعية محددة وفقا لقسيم معيني منشئهم 1،12. يتم إنشاء branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية في قسيم معيني (ص) 4 في الدماغ المؤخر وتوسيع محاور بهم ظهريا من خلال نقطة خروج R4 في القوس الخيشومي الثاني ليعصب عضلات الوجه 2،9،13. الخلايا العصبية FBM من الزرد والفئران توفير نماذج ممتازة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للهجرة الخلايا العصبية في العملية التي تصور بسهولة، لأن هذه الخلايا العصبية نقل من بتكاثر somata في عملية spatiotemporally محددة جيدا. في الفئران، والخلايا العصبية FBM ترحيل كاو الأولىتوانى عن طريق R5 ثم كلا نحو caudally والبطني للوصول إلى موقفهم النهائي على الجانب حنوني من الدماغ المؤخر في إقليم R6، حيث أنها تشكل نواة الاقتران من العصب القحفي VIIth (VIIn) 10،11،14. في الزرد، الخلايا العصبية FBM تهاجر البداية البطني ومن ثم تغيير الاتجاه في حدود R4-R5 لمواصلة ترحيل نحو السطح حنوني في laminin بطريقة تعتمد على 4،12،15،16. هذه الهجرة العائدات على مدى فترة من عدة أيام في التنمية ويمكن تقسيمها إلى مراحل الهجرة عرضية والشعاعية، مما يتيح تحديد الجزيئات التي تتوسط هذه العمليات مميزة اثنين. في المقابل، تبقى الخلايا العصبية FBM من فرخ الدماغ المؤخر الجنينية في R4 3،13،17-19. أثناء هجرتها، ويمكن تحديد الخلايا العصبية FBM، مثل أنواع أخرى أو الخلايا العصبية الحركية، من خلال التعبير عنها من homoeodomain النسخ عامل جزيرة 1 (ISL1) 14. وبالتالي، مصنعونemount المناعي تلطيخ أو التهجين في الموقع لهذه العلامة في مراحل تنموية مختلفة يكشف عن تيار المهاجرة متميزة من FBM somata تمتد من R4 لR6 في الزرد أو الماوس 4،15،16. علاوة على ذلك، للصحفيين الفلورسنت المعدلة وراثيا مثل ISL1-GFP استخدمت كأدوات مناسبة لتصور هجرة الخلايا العصبية FBM في الزرد 3،17-19. بالإضافة إلى ملاءمتها للتصوير، درسوا العديد من المحققين هجرة الخلايا العصبية FBM في تطوير الزرد، لأن الأجنة فراغهم المعيشة يمكن التلاعب بها بسهولة مع تقنيات زرع الخلايا والمركبات الدوائية تطبيقها مباشرة على مياه الحوض. في المقابل، يطور المغلقة الجنين الماوس في الرحم، مما يحول دون غرس الخرز تحمل العظة توجيه أو إدارة الأجسام المضادة عرقلة وظيفة التي لا عبور حاجز المشيمة. وعلاوة على ذلك، قد المركبات الدوائية تدار على الأم الحامل لها الامم المتحدةالآثار الجانبية المطلوب الذي يمكن أن يضعف بشكل غير مباشر مرحلة التطور الجنيني. التحايل على هذا التحديد، قمنا بتطوير طريقة فيفو السابقين الثقافة لكامل الدماغ المؤخر الماوس متوافق مع الهجرة FBM الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة بعد explanting 7،16. هذا الأسلوب يسمح التلاعب الدوائية سهلة، زرع من الخرز تحمل العظة توجيه أو إدارة الأجسام المضادة عرقلة وظيفة ويمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة هجرة فرعية الخلايا العصبية الأخرى في الدماغ المؤخر في مراحل تنموية مختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين من الدماغ، ولكن في وقت لاحق الهجرة إلى وجهات جديدة للوصول إلى الأهداف المناسبة. وبالتالي فك رموز الاشارات الجزيئية التي توجه تعاوني هجرة الخلايا العصبية في المخ الجنينية من المهم أن نفهم كيف تشكل الشبكات العصبية المعقدة التي تدعم الحياة في وقت لاحق بعد الولادة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر جنين فأر ترحيل من قسيم معيني (ص) 4 نحو caudally لتشكيل نواة الوجه تقرن في المنطقة R6-مشتقة من الدماغ المؤخر. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصلة لwholemount فيفو السابقين ثقافة الماوس hindbrains الجنين مناسبة للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنظم الهجرة FBM. في هذه الطريقة، يتم تشريح hindbrains الأجنة E11.5 الماوس ومثقف في إعداد كتاب مفتوح على إدراج ثقافة خلية لمدة 24 ساعة. خلال هذا الوقت، الخلايا العصبية FBM تهاجر نحو caudally نحو R6 ويمكن أن يتعرض لعرقلة وظيفة الأجسام المضادة وmolecul الصغيرةوفاق في وسائل الإعلام أو الثقافة أو الخرز الهيبارين محملة البروتينات المؤتلف لدراسة الأدوار لمسارات الإشارات المتورطين في توجيه هجرة الخلايا العصبية.

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال دراسة الخلايا العصبية FBM الهجرة في الدماغ المؤخر الماوس من خلال فيفو السابقين الثقافة. وتبين لنا أن الخلايا العصبية في FBM hindbrains explanted من يوم 11 أجنة الفئران الخضوع أول هجرة عرضية (الشكل 3A) ومن ثم البدء في تجميع النوى الحركية الوجه (الشكل 3B)، على غرار سلوكهم في الرحم (انظر الشكل 1). علينا أن نبرهن أيضا أن زرع حبة غارقة VEGF165 تجذب الخلايا العصبية FBM (أرقام 3C و 3D)، كما هو موضح سابقا 16. الأهم من ذلك، يسمح هذا البروتوكول دراسة الهجرة FBM في غياب الأوعية الدموية أو عوامل الأوعية الدموية المستمدة التي قد تؤثر على الهجرة FBM في الرحم، وذلك لأن الأوعية الدموية nonperfused ينحط في الثقافة 16. وهكذا، لاحظ وضع العلامات خلايا الدم غير محددة عند استخدام الأجسام المضادة ISL1 الماوس على طازجةhindbrains الماوس معزولة (الشكل 1) لم يعد موجودا في أنسجة الدماغ المؤخر بعد 24 ساعة في الثقافة (أرقام 3A-F). أخيرا، وتبين لنا مثالين من hindbrains التي لم explanted بشكل صحيح، وبالتالي تحتوي على الخلايا العصبية FBM في التوزيع غير طبيعية، إما لأن الدماغ المؤخر لم explanted قريبا بما فيه الكفاية بعد العزلة الجنين (الشكل 3E) أو لأن الأنسجة الدماغ المؤخر مطوية في transwell ( الرقم 3F). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> الشكل 1. FBM الخلايا العصبية الهجرة متحد البؤر Z-كومة من hindbrains wildtype الماوس بعد ISL1 immunolabeling wholemount وflatmounting؛. يشار خط الوسط الدماغ المؤخر مع نجمية في جميع لوحات (A) السطح البطيني من الدماغ المؤخر E11.5 في<html> المنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية ISL1 إيجابية FBM (السهم)، مما يدل على هجرتهم عرضية من R4 لR6؛ يشار موقف R4، R5 R6 و(A &#39;) حنوني سطح نصف من نفس الدماغ المؤخر في المنطقة التي تحتوي على بدأة . واحدة من نوى FBM تقرن (المشار إليها مع VIIn)، فضلا عن غيرهم من السكان الخلايا العصبية، ISL1 إيجابية (B) السطح البطيني من الدماغ المؤخر E12.5 تحتوي على الخلايا العصبية FBM التي تهاجر بشكل طفيف (السهم)، ورأس السهم يشير إلى المثال في أحد الاوعية الدموية التي تحتوي على تعميم الخلايا التي وصفت unspecifically عن طريق تفاعل المتبادل من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس المستخدمة للكشف عن الأجسام المضادة ISL1 الماوس مفتش (B &#39;). سطح حنوني من نصف واحد من نفس الدماغ المؤخر E12.5، والذي يحتوي على واحدة من نوى FBM المقترنة. يشار إلى خط الوسط مع النجمة في كل لوحة. شريط النطاق (كل اللوحات): 200 ميكرون. V، بطني، P، حنوني./ 51397fig1highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> الشكل 2. E11.5 الماوس الدماغ المؤخر تشريح الجسم الحي وخارج الثقافة. (AE) الخطوات الرئيسية في البروتوكول تشريح E11.5 الدماغ المؤخر؛ شريط النطاق: 1 مم (A) رئيس الجنين بعد أن تم قطع عليه بعيدا عن ما تبقى من الجنين في مستوى forelimb (B) الجزء منقاري من. تمت إزالة الرأس وبقية الأنسجة رئيس ضعه بحيث تم الموجهة البطين 4 ال (السهم) صعودا. (C) ومقشر سقف البطين 4 ال بعيدا، وتعرض الدماغ المؤخر بواسطة تقشير الأنسجة تحت الدماغ المؤخر بعيدا rostrally ونحو caudally. (D) تمت إزالة غشاء حنوني (لاحظ أن في هذا السابقينظلت وافرة، وبعض النخاع الشوكي العنقي (SC) الأنسجة التي تعلق على الدماغ المؤخر). (E) الدماغ المتوسط ​​الزائدة (MB) والحبل الشوكي (SC) تمت إزالة الأنسجة للاحتفاظ فقط الدماغ المؤخر. (كانت مغلفة إدراج F) مع الثقافة laminin وضعها في لوحة الثقافة 12 الأنسجة أيضا. (G) وضعت كل الدماغ المؤخر على إدراج واحد وغطت مع وسائل الاعلام. (H) تمثيل تخطيطي لمسار هجرة الخلايا العصبية التي اتخذتها FBM (الأزرق) خلال 24 ساعة من الثقافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> الرقم 3. الماوس الدماغ المؤخر فيفو السابقين الثقافة. (A، B) وكان من الدماغ المؤخر E11.5 مثقف لمدة 24 ساعة وimmunofluoresc<html> وصفت مستديم لISL1 لتوضيح FBM الخلايا العصبية الهجرة في ازدراع، وتظهر كل من البطين (A) وحنوني (B) من جانبي الدماغ المؤخر (C، D) كانت hindbrains E11.5 littermate مثقف في وجود مزروع الهيبارين حبة غارقة. في برنامج تلفزيوني (C) أو VEGF165 (D)، علما أن الخلايا العصبية FBM هاجر نحو وعلى حبة VEGF165، وبالتالي فإن تيار المهاجرة تمديدها نحو caudally مقارنة إلى الجانب غير المعالجة من نفس الدماغ المؤخر أو الدماغ المؤخر تحتوي حبة التحكم (E. ، F) أمثلة على غير مرضية إإكسبلنتس E11.5 الدماغ المؤخر، الذي FBMs لم هاجروا من R4 (E)، أو في أنسجة الدماغ المؤخر الذي مطوية خلال ثقافة (F). يشار إلى خط الوسط مع النجمة في كل لوحة. شريط النطاق (لجميع لوحات): 200 ميكرون. V، بطني، P، حنوني.&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين في الأنبوب العصبي، ولكن الهجرة للوصول إلى الأهداف المناسبة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية هي نموذجا مفيدا لدراسة هجرة الخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول wholemount فيفو السابقين ثقافة الماوس hindbrains جنين للتحقيق في الآليات التي تنظم الهجرة FBM.

الماوس الدماغ المؤخر<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة الهجرة Branchiomotor الوجه العصبية

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K Views.  University College London.  يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين في الأنبوب العصبي، ولكن الهجرة للوصول إلى الأهداف المناسبة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية هي نموذجا مفيدا لدراسة هجرة الخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول wholemount فيفو السابقين ثقافة ?...

Video: Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em&gt; في المختبر</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

وثمة نهج بديل لدراسة الأحداث الرئيسية في نيوروديجينيريشن باستخدام شرائح المخ الفئران السابقين فيفو

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

جراحة الأعصاب الوجه في نموذج الفئران لدراسة تثبيط أكسونال وتجديد

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

السابق فيفو هيبوكامبال الضغط الشعرية-Pareniole الشرايين التحضير للدراسة الوظيفية

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس Geniculate استجابات الخلايا العصبية العقدية لتذوق المحفزات

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...