MT נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי [נ&quot;צ. וCR 092839/Z/10/Z] על ידי ניו פרס החוקר [נ&quot;צ. 095623/Z/11/Z] מאמון Wellcome.

1. אופציונאלי: הכן הפרין חרוזים Affi-ג&#39;ל (חרוזים ג&#39;ל) עבור assay המשיכה FBM הערה: הכן את חרוזים ג&#39;ל לפחות יום 1 לפני שתתחיל בהליך explant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 100 השעיה חרוז μl ג&#39;ל הפרין עם PBS סטרילי עבור 20 דקות על רולר בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים גלולה בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 5 דקות ב 13,000 X גרם. הוסף PBS סטרילי ולחזור על תהליך הכביסה 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, להסיר PBS ולהשרות את חרוזים בנפח קטן של תמיסה סטרילית המכילה את חלבון רקומביננטי של בחירה, מקפיד לכסות את החרוזים עם הפתרון. פרוטוקול זה משתמש 100 VEGF165 אנושיים רקומביננטי ng / μl ב-PBS לשחזר ניסוי שפורסם בעבר 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים הפרין ג&#39;ל עם פתרון רקומביננטי החלבון למינימום של שעות 12 ועד למקסימום של 1 שבוע על רולר ב 4 ° C. </li></ol> 2. ציפוי של התרבות הכנסשל explants המוח האחורי בתרבית על תרבות קורנינג מוסיף בגודל 8 מיקרומטר נקבובית, או מוסיף מקביל. ניתן לעשות שימוש חוזר תרבות מוסיף לאחר השלמת הפרוטוקול, בתנאי שהם נשטפים עם מים מזוקקים, מעוקרים עם אתנול, ומאוחסנים ב70% אתנול עד צורך. הערה: יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימת מכסה המנוע בתנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבות explant המורכב של מדיום Neurobasal בתוספת B27 (20 μl / מיליליטר), גלוקוז (6 מ&quot;ג / מיליליטר) ופניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לשטוף מוסיפה עם PBS סטרילי למשך 5 דקות ויבשות ל5-10 דק מתחת למכסה המנוע לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להכניס את התרבות אחת לכל אחד גם בודד של צלחת 12well. הערה: ייתכן שיהיה צורך מוסיף דחיפה קטנה כדי להתאים בחוזקה לתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה מוסיף התרבות עם 10-20 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר במדיום Neurobasal ולמקם אותם בתרבית רקמת חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO <sub&gt; 2) במשך שעה 1. הערה: יש לבצע ציפוי ביום explanting. </li></ol> 3. Dissection של Hindbrains מE11.5 עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור נקבת עכבר בהריון מתוזמן עם נוהל שאושר מבחינה אתית ביום עוברי (E) 11.5 ולמקם את הרחם המכיל את העוברים בצלחת פלסטיק 100 מ&quot;מ עם מדיום L15 קר כקרח. הערה: כל שלבי הנתיחה חייבים להתבצע בL15 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח ושען דומון מלקחי מספר 5, לקרוע את קיר שריר רחם כדי לחשוף את העוברים, לשחרר את כל עובר, לנתק את חבל הטבור, ולהסיר בזהירות את שק החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק עם פתח רחב נשא, להעביר כל עובר לתוך צלחת פלסטיק נקייה עם L15 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המלקחיים דומון, לערוף את העובר בדיוק מעל forelimbs. אם הניסוי דורש גנוטיפ של העוברים, לאסוף דגימות רקמה לבידוד הדנ&quot;א הגנומי (למשל piec קטןדואר של שק חלמון או קצה זנב 16,20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צד גב הראש למעלה ולזהות את חדר 4 th, אשר מכוסה על ידי שכבת רקמה דקה (איור 2 ב). לנקב בזהירות roofplate ומתחיל לקלף אותו משם caudally לאורך קו האמצע מעל למוח האחורי האחורי וחוט השדרה, וrostrally מעל המוח התיכון. המוח האחורי צריך עכשיו להיות חשוף (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקניט הזהירות mesenchyme הראש שנותר וכל קרומי המוח המחוברים לצד pial של המוח האחורי (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת חוט השדרה ומוח תיכונה, כך שהמוח האחורי נפרש והוא יכול לשכב בהכנת ספר פתוח (איור 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר את כל המוח האחורי גזור ל12 גם צלחת המכילה L15 קר כקרח ולאחסן אותם על קרח עד שכל hindbrains כבר גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר חטאהמוח האחורי GLE לצלחת ריקה, להשאיר אותו פתוחה הכנת ספר, בצד של חדר למעלה, בטיפה של L15 100 μl המשוער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כמה מיקרוליטר של חרוזים הפרין ג&#39;ל הודגרו לאותה הטיפה. הערה: מאחר והגדלים של חרוזים משתנים, מומלץ להעביר סביב 10 חרוזים ולאחר מכן בחר גודל אופטימלי להשתלה למוח האחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דמעה קטנה ברקמת המוח האחורי ולהכניס בזהירות 1-3 חרוזים הג&#39;ל לתוך רקמת המוח האחורי ברמה של R5 / 6, בערך בחץ דרך בין קו האמצע ואת הקצה לרוחב של המוח האחורי, הוריד אותם לרקמה, כך חרוז ממוקם ממש מתחת לפני השטח המוח האחורי. הערה: ההליך לנתיחה עשוי להימשך בין 5-20 דקות / המוח האחורי, בהתאם לניסיון, ועלול למתוח על פני תקופה ממושכת אם המלטות גדולות, ובכל מקרה, hindbrains צריך להיות בתרבות של לא יותר מ 3 שעות שלאחר המוות לטוב תוצאות. </li></ol> 4. המוח האחוריExplant תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת המכילה את התרבות מוסיף מן החממה, לשאוב את פתרון ציפוי laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להכניס את התרבות אחת לתוך צלחת תרבות נפרדת מלאה קר כקרח L15 ו, באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק רחב נשא, להעביר כל צד הגחון המוח האחורי לעלות על להכניס את התרבות (איור 2G). המוח האחורי יהיה שטוח לחלוטין על הקרום להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות להכניס את התרבות מהצלחת ומורח אותו כמה פעמים בנייר טישו נקי כדי להסיר את הנוזל עודף. תהליך זה מבטיח שהמוח האחורי שומרת על להכניס את התרבות בהכנת ספר שטוחה, פתוחה. אם המוח האחורי מתכרבל, הרקמה שלה עשויה לגדול ביחד באופן בלתי הפיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צלחת 12 גם המקורית עם 500 μl תקשורת תרבות prewarmed ובמקום להכניס בחזרה לזה היטב. להתאים בזהירות את עוצמת הקול עם 400-600 μl אחר של מדיה רק ​​כדי לכסות את המוח האחורי, להבטיח כי המוח האחורי אינו מרחףאת הממברנה. אם זה צף, חזור לשלב 4.4 וחזור עד למוח האחורי נשאר צמוד לממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, ניתן להוסיף מעכבים ביולוגיים של עניין לתקשורת ללמוד את השפיעו על ההגירה של תאי עצב FBM. הערה: אם השתלת חרוזים או מתן טיפולים אחרים, מומלץ לשמור על לפחות 2 explants שליטה בתנאי גידול נורמלים בכל ניסוי כדי לוודא שהניסוי הוגדר בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants ל24-30 שעות בתרבית רקמת חממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%). </li></ol> 5. Immunofluorescent מכתים Wholemount של המוח האחורי Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מכל טוב, יש לשטוף ב-PBS ולתקן במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה בפורמלין 4% קרים כקרח (מוכן טרי או מופשר טרי paraformaldehyde 4% מומסים בPBS). הערה: אל תנסה להסיר את המוח האחורי מלהכניס את התרבות לפני הקיבועהושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף 3x עם PBS. לקלף את hindbrains זהירות מהתרבות מוסיף באמצעות מלקחיים דומון. explants חלקם קשים להתקלף, אבל בדרך כלל יכול להיות הרים על ידי הפעלת לחץ עדין דרך לגרש שוב ושוב PBS מטפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר hindbrains ל2.0 מיליליטר צינורות עגול עם תחתית לתיוג immunofluorescence. Permeabilize hindbrains ל30 דקות בטמפרטורת חדר (RT) בPBS המכיל 0.1% TritonX-100 (PBT) עם גלגול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 ב RT בPBT מכילה 10% נסיוב עזים נורמלים חום מומת בגלגול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants עם גלגול עדין על 4 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים עם נוגדן ראשוני ספציפי לISL1, מדולל 1:100 בPBT המכיל 1% נסיוב עזים נורמלים חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את explants ב RT 4x עם PBT ל15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants עם גלגול עדין על RT במשך 3 שעות עם עז fluorophore מצומדות נוגדן אנטי עכבר (אנטי 488 עיזים למשל אלקסה פלואורידעכבר, בדילול 1:200) בPBT המכיל 1% נסיוב עזים נורמלים חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את explants 4x ב RT עם PBT במשך 15 דקות כל אחד עם גלגול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Postfix explants בפורמלין 4% ל30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה שקופיות זכוכית עם 3 שכבות של סרט בידוד שחור ובלו עם אזמל ריבוע קטן של הקלטת שכבתית ליצירת כיס עבור explants; לחלופין, השתמש בשקופית זכוכית דיכאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל המוח האחורי במגיב SlowFade לכיס אחד ולכסות עם coverslip זכוכית, הימנעות בקפידה לבועות אוויר מלכודת ואת תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר. הערה: כחלופה לimmunostaining, הכלאה באתר עם ​​riboprobes שתכיר FBMS (כלומר Isl1 או Phox2b) ניתן להשתמש כדי להמחיש נוירונים FBM 16,21. </li></ol> סיכום של צעדים ותזמון בעיתוי הזדווגות להשיג הריונות E11.25: ~ 14 ימים אופציונאלי: חרוז הכנה (Protocol 1): ~ 2 שעות, ביום שלפני בידוד עובר הכן מוסיף תרבות ותקשורת (פרוטוקול 2): ~ 30 דקות, לפני בידוד עובר בידוד עובר ונתיחת המוח האחורי (שלבים 3.1-3.4): ~ 10 דקות / עובר נתיחת המוח האחורי (שלבים 3.5-3.7): ~ 5-10 דק / המוח האחורי הליך explant (שלבים 3.8-3.9): ~ 5-10 דק / המוח האחורי אופציונאלי: השתלת חרוז (שלבים 3.10-3.11): ~ 5-10 דק / המוח האחורי תרבות explant (שלב 4.7): 24 שעות קיבוע עבור מכתים נוגדן (שלב 5.1): 2 שעות הליך מכתים והדמיה (פרוטוקול 5): 5 ימים

<ol>
	<li>Lumsden, A., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterns+of+neuronal+development+in+the+chick+hindbrain.">Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain.</a> Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).</li><li>Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+heads:+development+of+vertebrate+branchiomotor+neurons.">Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons.</a> Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).</li><li>Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1b+mediates+interpretation+of+migratory+cues+during+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration.">Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration.</a> Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).</li><li>Glasco, D. M., Sittaramane, V., Biol, D. e. v. .., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. 369 (2), 211-222 (2012).</li><li>Marillat, V., Sabatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Slit+Receptor+Rig-1/Robo3+Controls+Midline+Crossing+by+Hindbrain+Precerebellar+Neurons+and+Axons.">The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons.</a> Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Vivancos, V., Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+guides+facial+branchiomotor+neuron+migration+and+involves+the+PCP+pathway+and+JNK+and+ROCK+kinases.">Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases.</a> Neural Dev. 4, 7 (2009).</li><li>Guan, K. -. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues.">Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).</li><li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons.">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).</li><li>Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+migratory+pathway+of+facial+branchiomotor+neurones.">Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones.</a> Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).</li><li>Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+defects+in+the+hindbrain+of+Hoxa1,+Hoxb1+and+Hoxb2+mutants+reflect+regulatory+interactions+among+these+Hox+genes.">Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes.</a> Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).</li><li>Grant, P. K., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroepithelial+basement+membrane+serves+as+a+boundary+and+a+substrate+for+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain.">The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Neural Dev. 5, 9 (2010).</li><li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+compartition+in+the+early+avian+hindbrain.">Segmentation and compartition in the early avian hindbrain.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).</li><li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li><li>Qu, Y., Glasco, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherins+Celsr1-3+differentially+regulate+migration+of+facial+branchiomotor+neurons+in+mice.">Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice.</a> J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).</li><li>Schwarz, Q., Gu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+controls+neuronal+migration+and+cooperates+with+Sema3A+to+pattern+distinct+compartments+of+the+facial+nerve.">Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve.</a> Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).</li><li>Stockinger, P., Ma&#238;tre, J. -. L., Heisenberg, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+neuroepithelial+cell+cohesion+affects+tangential+branchiomotor+neuron+migration+in+the+zebrafish+neural+tube.">Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube.</a> Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).</li><li>Wanner, S. J., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+tracts+guide+zebrafish+facial+branchiomotor+neuron+migration+through+the+hindbrain.">Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain.</a> Development. , (2013).</li><li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter/enhancer.">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li><li>Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+mammalian+DNA+isolation+procedure.">Simplified mammalian DNA isolation procedure.</a> Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J. Vis. Exp. (74), (2013).</li><li>Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+of+the+lower+rhombic+lip+of+midgestation+mouse+embryos.">In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (66), (2012).</li></ol>

אף אחד מהמחברים שמתחרה אינטרסים או אינטרסים מנוגדים.

פרוטוקול זה מתאר את תרבות wholemount של hindbrains עכבר E11.5 במערכת transwell ללמוד את ההגירה של תאי עצב FBM. פרוטוקול זה מאפשר למוח האחורי motorneurons עכבר כדי להיות כל הזמן בחיים ונודדים לתקופה של 24 שעות, מה שמאפשר vivo לשעבר מניפולציה. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים ניסיוניים המבקשים לזהות את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית. אילו מבחני הגירה מסורתיים explant חתיכות רקמה עצביות קטנות לתוך מטריצה ​​על מנות תרבות ולאפשר תצפית של נוירונים בודדים כפי שהם מגיבים לגירויים חיצוניים, יתרון עיקרי של assay transwell הוא התאמתה כדי לתפעל נוירונים נודדים בסביבת איבר המארח, ולכן יותר הקשר פיסיולוגי. חשוב מכך, חומרים יכולים להיות מיושמים בקלות למוח האחורי לשעבר explants vivo כדי לבדוק את השפיעו על נדידת נוירונים, עקיפת תופעות לוואי אפשרית הקשורים administeתצלצל חומרים אלה לעכבר בהריון. לבסוף, מודל vivo לשעבר גם מאפשר הבדיקה של חומרים שאינם עוברים את מחסום השליה, כגון נוגדנים לחסימת פונקציה. בשל יתרונות אלו, התרבות לשעבר vivo המוח האחורי מספקת אלטרנטיבה ושיטה משלים לשימוש בעוברי דג הזברה, אשר יכול להיות מטופלים עם מולקולות קטנות מסיסים במים במים באקווריום, או לב electroporation ברחם של מוח העוברי, המחייב את השימוש של מתמחים ציוד וקשה יותר להורים מאשר טכניקת התרבות שמתוארת כאן. יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן הוא רמת המוכנות שלה להשתלת חרוזים טבולים בחלבון רקומביננטי או חומרים כימיים אחרים, ובכך מאפשרת את היישום של שיטה עוברית סטנדרטית שפותחה על לתמרן עובר חומוס למודל של עכברים של נדידת נוירונים. בפרט, לשעבר vivo תרבות המודל ניתן להחיל hindbrains של עכברים מהונדסים גנטי defective במולקולות ספציפיות מעורבות בהעברה עצבית, כגון קולטנים צמיחה או גורם הדרכה, ושילוב עם שתלי חרוז כדי לבדוק אם היענות לליגנד הולכת לאיבוד. בנוסף למניפולציה תרופתית, לשעבר vivo פרוטוקול התרבות יכול גם להיות מותאם לelectroporate וקטורי ביטוי שיכול לתפעל ביטוי של גנים של עניין; השיטות מתאימות לelectroporation בעבר תיארו 22,23. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי להמחיש הגירת נוירון ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות בexplants המוח האחורי מעכברים מהונדסים המכילים נוירונים שכותרתו fluorescently FBM, למשל Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד סוגים אחרים של נוירונים נודדים במוח האחורי, כגון אלה היוצרים את הזית הנחות, אם כי זה ידרוש השימוש בhindbrains בשלבים עובריים מבוגרים ועשוי לדרוש תרבות עד 48 שעה, בהתאם לכדאיות עצבית <em&gt; Vivo לשעבר. צעדים ופתרון בעיות קריטיים להצלחתו של פרוטוקול זה, חשוב כי עוברים שנאספו בשלב מוקדם E11.5 היום, קרוב יותר לE11.25, כאשר הגירת נוירון FBM רק התחילה. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כדי לתפוס את העוברים בשלב התפתחותי זה בשל השתנות הזדווגות טבעיות של עכברים, ובהתאם לכך, ייתכן שיש כמה השתנות בהארכה של הגירת FBM בין ניסויים שונים. השתנות בהגירה FBM יכולות להיות גם ציינו אם הניסוי לא הושלם בתוך מסגרת הזמן שהוקצתה, שעות על 3, כפי שניתן לראות באיור 3E. רקמת המוח האחורי מעוברי עכברי E11.25 היא עדינה. כאשר לנתח ולאורך כל הליך explant, חשוב שלא לקרוע את רקמת המוח האחורי באזורים מן R4-R6 שבו נוירונים FBM נמצאים. בשל האופי העדין של הפרטים הקטניםתהליך ection, ובגלל המהירות שבה hindbrains ממוקמות לתוך התרבות משפיעה על תוצאה, ההליך עשוי להימשך כמה פעולות תרגול להורים, בפרט לפני דוגמאות או חומרים כימיים יקרות נמצאות בשימוש. לבסוף, חשוב שרקמת המוח האחורי ממוקמת לתוך תצורת ספר פתוחה על להכניס את התרבות, כי קיפול של רקמת המוח האחורי במהלך התרבות ימנע הגירת FBM רגילה (ראה איור 3F).

נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע לאזורי היעד מתאימים הנמצאים במרחק גדול. המיקום הנכון של גופי תא עצביים במקומות מתאימים לאורך צירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי של המוח המתפתח הוא חיוני לנכון חיווט, הישרדות, ותפקוד של הנוירונים האלה לאחר שלב נדידת 1-4. בדומה למנגנונים המולקולריים השולטים 5-7 האקסון הדרכה, ערכות קומבינטורית של רמזים אטרקטיביים ודוחה הם חשבו להדריך נוירונים נודדים 1,8. עם זאת, בשל האינטראקציות של סוגי תאים מרובים, אותות השליטה נדידת נוירונים נחקרו פחות נרחבים מאלה מעורבים בהדרכה האקסון, שניתן ללמוד בתא באופן אוטונומי. המוח האחורי הפיתוח של בעלי חוליות כבר בשימוש במספר המחקרים אחרונים כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ותאייםשל נדידת נוירונים, למשל בחומוס, עכבר ודג זברה 1-4,9. איבר זה מכיל מספר סוגים שונים של נוירונים, ובם כמה תתי סוגים של precerebellar והנוירונים מוטוריים 5,7,10,11. motorneuron המוח האחורי נולד באזור חדרית הקרוב לfloorplate, והם להתמיין תת ספציפיים לפי rhombomere מוצאם 1,12. נוירונים branchiomotor הפנים (FBM) נוצרים בrhombomere (r) 4 במוח האחורי ולהרחיב את האקסונים שלהם dorsally דרך נקודת יציאת R4 לקשת branchial השנייה למעצבבים את שרירי הפנים 2,9,13. נוירונים FBM של דג הזברה ועכברים לספק מודלים מצוינים ללמוד את המנגנונים המולקולריים ותאיים של העברה עצבית בתהליך שהיא דמיינו בקלות, משום שהנוירונים האלה reproducibly translocate somata בתהליך spatiotemporally מוגדר היטב. בעכברים, תאי עצב FBM להעביר CAU הראשוןלהתמזמז דרך R5 ואז שניהם caudally וventrally להגיע המיקום הסופי שלהם בצד pial של המוח האחורי בשטח של R6, שבו הם יוצרים את הגרעינים לזווג של העצב השביעי הגולגולת (VIIn) 10,11,14. בדג הזברה, הנוירונים FBM בתחילה להעביר ventrally ולאחר מכן לשנות כיוון בגבול R4-R5 להמשיך נודדים לכיוון שטח pial באופן laminin תלוי 4,12,15,16. הגירה זו ממשיכה על פני תקופה של מספר ימים בפיתוח ויכולה להיות מחולקת לשלבים של הגירה משיקה והרדיאלי, המאפשרת זיהוי של מולקולות אשר מתווכות שני תהליכים שונים אלה. לעומת זאת, תאי עצב FBM של המוח האחורי חומוס העוברי להישאר בR4 3,13,17-19. במהלך הנדידה שלהם, ניתן לזהות נוירונים FBM, כמו סוגים אחרים או נוירונים מוטוריים, דרך הביטוי שלהם של איון שעתוק homoeodomain גורם 1 (ISL1) 14. לפיכך, wholמכתים emount immunofluorescence או הכלאה באתר לסמן זה בשלבי התפתחותיים שונים חושף את זרם הנדידה הברור של somata FBM המשתרע מR4 לR6 בדג הזברה או עכבר 4,15,16. יתר על כן, כתבים מהונדסים ניאון כגון ISL1-GFP היו בשימוש ככלים מתאימים כדי להמחיש נודדים נוירונים FBM בדג הזברה 3,17-19. בנוסף להתאמתם להדמיה, חוקרים רבים חקרו את ההגירה של תאי עצב FBM בפיתוח דג הזברה, כי עוברי חיים הנטולים ניתן להשפיע בקלות עם טכניקות השתלת תאים ותרכובות תרופתיים ליישם ישירות את המים באקווריום. לעומת זאת, בעובר עכבר מפתחת סגור ברחם, לא ניתן ההשתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או המינהל של נוגדנים לחסימת פונקציה שאינו עוברים את מחסום השליה. יתר על כן, תרכובות תרופתי ניתנות לאם בהריון עלולות להיות בלתיתופעות לוואי רצויים שיכול לפגוע בעובר באופן עקיף. עקיפת מגבלה זו, פיתחנו שיטת vivo לשעבר תרבות למוח האחורי של עכבר כולו, כי הוא תואם עם הגירת נוירון FBM והישרדות ל24 שעות לאחר explanting 7,16. שיטה זו מאפשרת מניפולציה תרופתית קלה, השתלה של חרוזים נושאים אותות הנחיה או מנהל של נוגדנים חוסם את הפונקציה ויכולה גם להיות מותאמת ללימודי ההגירה של תת עצביים אחרים במוח האחורי בשלבי התפתחות שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של המוח, אך לאחר מכן להגר ליעדים חדשים להגיע למטרות מתאימות. פענוח האותות המולקולריים ששיתוף פעולה להנחות את ההעברה עצבית במוח העוברי ולכן חשוב להבין כיצד הרשתות עצביות מורכבות בצורה שמאוחר יותר לתמוך בחיים לאחר לידה. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) במוח האחורי עובר העכבר לעבור מ rhombomere (r) 4 caudally כדי ליצור גרעיני פנים לזווג באזור נגזר-R6 של המוח האחורי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לwholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר העכבר המתאים לחקור את מסלולי איתות המווסתים את נדידת FBM. בשיטה זו, hindbrains של עוברי עכברי E11.5 הם גזורים ותרבותיים בהכנת ספר פתוחה על מוסיף תרבית תאים ל24 שעות. במהלך הזמן הזה, הנוירונים FBM להעביר caudally כלפי R6 והוא יכול להיות חשוף לנוגדנים לחסימת פונקציה וmolecul הקטןes בתקשורת התרבות או חרוזים הפרין עמוס בחלבונים רקומביננטיים לבחון תפקידים לאיתות מסלולים מעורבים בהכוונת נדידת נוירונים.

סעיף זה ממחיש דוגמאות לתוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד הגירת נוירון FBM במוח האחורי של העכבר באמצעות vivo התרבות לשעבר. אנחנו מראים שנוירונים FBM בhindbrains explanted מ11 עוברי עכבר היום, עוברים קודם הגירה משיקה (איור 3 א) ולאחר מכן להתחיל להרכיב את גרעיני הפנים מנוע (איור 3 ב), בדומה להתנהגות שלהם ברחם (ראה תרשים 1). בנוסף, אנו מראים כי ההשתלה של חרוז ספוג VEGF165 מושכת נוירונים FBM (3C דמויות ו3D), כפי שמוצג 16 בעבר. חשוב מכך, פרוטוקול זה מאפשר לימודי הגירת FBM בהיעדרם של כלי דם או גורמים המופק מכלי שעשויה להשפיע על הגירת FBM ברחם, משום שכלי הדם nonperfused מתנוון בתרבות 16. לפיכך, תיוג תא דם הנוקב שנצפה בעת השימוש בנוגדן עכבר ISL1 על טריhindbrains עכבר מבודד (איור 1) הוא כבר לא קיים ברקמת המוח האחורי לאחר 24 שעות בתרבות (איורים 3A-F). לבסוף, אנו מראים שתי דוגמאות של hindbrains שלא explanted בצורה נכונה, ולכן מכילים נוירונים FBM בהפצה נורמלית, או בגלל שהמוח האחורי לא explanted בקרוב לאחר בידוד העובר (איור 3E) או בגלל שרקמת המוח האחורי מקופלת בtranswell ( 3F איור). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> איור 1. הגירת נוירון FBM Z-מחסנית Confocal של hindbrains עכבר wildtype לאחר immunolabeling wholemount ISL1 וflatmounting;.. קו האמצע למוח האחורי מצויינים בכוכבית בכל הפנלים () פני השטח חדרית של המוח האחורי E11.5 ב<html> אזור המכיל נוירונים ISL1 החיובי FBM (חץ), הוכחת ההגירה המשיקה מR4 לR6;. את עמדתו של R4, R5 ו R6 היא מצויינים (&#39;) שטח pial של חצי אחד של אותו המוח האחורי בשטח שבו anlage פני השטח של אחד מהגרעינים לזווג FBM (מצויינים עם VIIn), כמו גם אוכלוסיות נוירון ISL1 חיובית אחרות (B) חדרית של המוח האחורי E12.5 המכיל נוירונים FBM שהם נודדים בנקודת השקה (חץ);. ראש החץ מצביעים על דוגמא של כלי דם המכילים תאים במחזור שמתויגים unspecifically מתגובה צולבת של הנוגדנים משני אנטי העכבר משמשים לאיתור נוגדני ISL1 עכבר IgG. (ב &#39;) שטח pial של חצי אחד של אותו המוח האחורי E12.5, המכיל אחד מגרעיני FBM לזווג. קו האמצע מסומן בכוכבית בפנל. סרגל קנה מידה (כל הלוחות): 200 מיקרומטר. V, הגחון, P, pial./ &quot;= היעד&quot; _blank 51397fig1highres.jpg &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> איור 2. נתיחת עכבר E11.5 המוח האחורי וvivo תרבות לשעבר. ראש 1 מ&quot;מ () של העובר לאחר שנחתך מן היתרה של העובר ברמת forelimb (ב &#39;) החלק מקורי של: סרגל קנה מידה; (AE) צעדי מפתח בפרוטוקול המוח האחורי E11.5 הנתיחה.. הראש הוסר ושארית רקמת הראש מוקם כך שחדר 4 th (חץ) היה מכוון כלפי מעלה. (C) הגג של חדר 4 th היה התקלף, והמוח האחורי נחשף על ידי קילוף רקמה מתחת למוח האחורי משם rostrally וcaudally. (ד &#39;) קרום pial הוסר (שים לב כי באקס זה, כמה חוט השדרה הצווארי מספיק רקמה (SC) נשארה מחוברת למוח האחורי). () המוח התיכון E עודפת (MB) וחוט השדרה (SC) רקמה הוסרה כדי לשמר רק את המוח האחורי. (מוסיף F) תרבות היו מצופה laminin והניח לתוך צלחת תרבות 12 רקמה היטב. (G) כל המוח האחורי הוצב על הוספה אחת ומכוסה בתקשורת. ייצוג סכמטי של המסלול, שנודד נוירונים FBM (כחול) ב24 שעות של התרבות (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> איור 3. המוח האחורי vivo לשעבר תרבות עכבר. (A, B) המוח האחורי E11.5 היה בתרבית למשך 24 שעות וimmunofluoresc<html> כותרת ently לISL1 כדי להמחיש הגירת נוירון FBM בexplant; שני חדרית () וpial (ב &#39;) צדדים של המוח האחורי מוצגות (C, D) hindbrains littermate E11.5 היו בתרבית בנוכחות חרוז הפרין המושתל ספוג. ב-PBS (C) או VEGF165 (ד); לציין כי נוירונים FBM הגרו לכיוון ועל חרוז VEGF165, וזרם הנודדות לכן להאריך עוד יותר caudally לעומת הצד שלא טופל מאותו המוח האחורי או המוח האחורי מכיל את חרוז השליטה (E. , דוגמאות F) של explants לא מספק למוח האחורי E11.5, שבי FBMS לא היגר מR4 (E), או שבו רקמת המוח האחורי המקופלת במהלך התרבות (F). קו האמצע מסומן בכוכבית בפנל. סרגל קנה מידה (לכל הלוחות): 200 מיקרומטר. V, הגחון, P, pial.&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration at JoVE.com

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של הצינור העצבי, אבל להעביר להגיע למטרות מתאימות. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) הם מודל שימושי ללמוד נדידת נוירונים. פרוטוקול זה מתאר את wholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר עכבר כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את נדידת FBM.

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K Views.  University College London.  נוירונים עובריים נולדים באזור חדרית של הצינור העצבי, אבל להעביר להגיע למטרות מתאימות. נוירונים branchiomotor פנים (FBM) הם מודל שימושי ללמוד נדידת נוירונים. פרוטוקול זה מתאר את wholemount אקס תרבות Vivo של hindbrains עובר עכבר כדי לחקור את המנגנונים המווס...

Video: Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

ניתוח עצבי הפנים במודל חולדה כדי ללמוד עיכוב Axonal והתחדשות

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...