نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.

1. إعداد الخليوي وسائل الإعلام (اليوم 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة وتوسيع الخلايا الليفية الإنسان مع وسائل الاعلام DMEM تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا الليفية الإنسان (الشكل 1) على طبق من ذهب 24 أيضا في الكثافة المناسبة لكل بئر في اليوم قبل تنبيغ. ملاحظة: ويوصى التخفيفات المسلسل التالية (200K، 100K، 50K، 25K، 12.5K و6.25K) لأن أنواع مختلفة من الخلايا لديها القدرة المرفق مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة يوم واحد أكثر في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة، وضمان الخلايا انضمت بالكامل والموسعة. </li></ol> 2. تنفيذ تنبيغ (اليوم 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم تنبيغ، والتحقق من كثافة الخلايا واختار الآبار الكثافة الأكثر كفاءة (الشكل 2). فمن الأفضل لاختيار ثلاثة كثافات مختلفة: عالية (80 ~ 90٪) والمتوسطة (50 ~ 70٪) ومنخفضة (20 ~ 40٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ساعة على الأقل قبل تنبيغ، نضح fibroblوسائل الإعلام AST من الخلايا وتغيير 300 ميكرولتر جديدة من الخلايا الليفية المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مجموعة واحدة من 4 مختلفة أنابيب فيروس سينداي من -80 درجة مئوية التخزين. ذوبان الجليد كل أنبوب في نفس الوقت في 37 ° C حمام الماء لبضع ثوان، ثم تأخذ أنابيب الخروج من حمام الماء. بعد ذلك، ذوبان الجليد منهم إلى درجة حرارة الغرفة؛ أنابيب الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 ثانية ووضعها على الجليد حتى الاستخدام. لا إعادة تجميد والذوبان الفيروس منذ سوف التتر لا الحفاظ عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كميات أشار كل من الأربعة أنابيب فيروس سينداي (أكتوبر 4، KLF-4، ج MYC وسوكس-2) لأنبوب الطرد المركزي الصغيرة. تأكد من أن الحل يتم خلط جيد من قبل pipetting بلطف. على سبيل المثال، إذا 50K الخلايا / واحد بشكل جيد من 24 لوحة جيدا lookwell لتنبيغ: (عيار استنادا إلى شهادة تحليل من تقنيات الحياة، يمكن أن تكون مختلفة من دفعة لدفعة) أنبوب hOct-4 = 6.0 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 5 ميكرولتر أنبوب hSox-2 = 6.5 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.6 μ، ل أنبوب hKlf-4 = 6.3 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.8 ميكرولتر أنبوب HC-MYC = 7.8 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 3.8 ميكرولتر المجموع = 18.2 ميكرولتر من أربعة عوامل فيروس خليط / واحد كذلك (50K الخلايا) من 24 لوحة جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على كثافة الخلية؛ إضافة 2X، 1X، 0.5X وحجم من الخليط الفيروس في البئر. يهز بلطف لوحة الأمام إلى الخلف واليمين واليسار (2X: 36.4 ميكرولتر من خليط الفيروس، 1X: 18.2 ميكرولتر و0.5X: 9.1 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها. </li></ol> 3. استبدال الثقافة المتوسطة (يوم 3 ويوم 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد تنبيغ، استبدل المتوسطة مع الخلايا الليفية المتوسطة 500 الطازجة ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 5، تغيير متوسطة مع وسائل الاعلام الخلايا الليفية الطازجة. </li></ol> 4. إعداد أطباق MEF لالمشارك الثقافة (اليوم 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا MEF في 60 الأطباق الثقافة ملم مع 10٪ FBS الواردة DMEM المتوسطة دا واحدذ قبل الركض الخلايا الليفية transduced على الخلايا المغذية MEF. ملاحظة: نحن نستخدم 5 × 10 5 من MEF في كل طبق 60 ملم. </li></ol> 5. البدء المشارك الثقافة Transduced الخلايا مع الخلايا المغذية MEF (يوم 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الطلاء الخلايا transduced، الواردة نضح 10٪ FBS DMEM وسائل الاعلام من الأطباق المغذية MEF وإضافة جديدة 10٪ الواردة FBS DMEM المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة من الخلايا الليفية transduced التي هي في 24 لوحة جيدا وغسل خلايا مرة واحدة مع مد برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA إلى خلايا الليفية تي إتش 24 لوحة جيدا. بعد أقل من 5 دقائق الحضانة مع التربسين / EDTA، عندما تبدأ الخلايا لفصل من لوحة، وجمع الخلايا مع النمو المتوسط ​​في أنبوب 15 مل المخروطية. ثم الطرد المركزي لهم في 6،000 x ج لمدة 4 دقائق. ملاحظة: تجميع 2X، 1X، 0.5X الفيروس وينصح الليفية transduced. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة طاف ويغسل لاعادة تعليقبيليه الخلية مع 4-5 مل من المتوسط ​​الخلايا الليفية جديدة لتحييد التربسين من. ثم الطرد المركزي في 135 x ج منهم لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا كما المسلسل الكثافة التخفيف والبدء في المشاركة في الثقافة مع وسائل الاعلام على الخلايا الليفية MEF: مثل 1/2، 1/4، 1/8، 1/16، 1/32، 1/64، و 1/128 في 60 مم الطبق. اعتمادا على معدل موت الخلايا خلال الأسبوع الأول من تنبيغ، واحدة قد لا تحتاج إلى تمييع إلى 1/2 أو 1/128 الكثافة. وضعت جانبا الخلايا المتبقية لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع كعنصر تحكم إيجابية لالتحوير RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 60 ملم أطباق في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها. </li></ol> 6. تغذية الجنينية البشرية الخلايا الجذعية متوسطة ورصد خلايا (اليوم 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وتغيير وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. بعد ذلك، قم بتغيير متوسطة يوميا مع البشرية المتوسطة ES: 800 مل + 200 مل DMEM/F12 خروج المغلوب المصل استبدال + 10 مل من L-الجلوتامين + 10 مل من 10 ملي MEM الحد الأدنى الأحماض الأمينية غير الأساسية+ 1 مل من 2 المركابتويثانول + 10 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قيام وسائل الإعلام التغيير اليومي مع وسائل الاعلام ES الإنسان الطازجة. بعد أسبوع، والتحقق من الأطباق مرة واحدة في 2 ~ 3 أيام تحت المجهر لتشكيل ES مثل مستعمرة كتل الخلية. اعتمادا على نوع من الخلايا، فإن الثقافة تأخذ أكثر أو أقل وقت قبل أن يتم العثور على المستعمرات. </li></ol> 7. نكأ المستحثة افرة القوة الجذعية المستعمرات الخليوي وتوسيع خلايا (يوم 20 ~) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أسابيع تنبيغ، يجب أن تظهر المستعمرات نمت بشكل صحيح لالتقاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من اختيار المستعمرات، وإعداد MEF المغذية في 24 لوحة جيدا. ملاحظة: نحن نستخدم 12.5 × 10 5 من MEF في واحد 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وتغيير المتوسطة من الأطباق MEF من وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. اختيار يدويا مستعمرة واحدة في كل مرة تحت المجهر في قطف هود وجعل كتل أصغر من قبل pipetting ونقلهاعلى إعدادها حديثا MEF dishes.Try لاختيار العديد من الحيوانات المستنسخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور وتوسيع كل بئر من 24 لوحة جيدا إلى 6 لوحة جيدا في البداية. ثم من لوحة 6 جيدا إلى 60 ملم الأطباق قبل مزيد من الانتشار. </li></ol> 8. توصيف iPSCs البشرية (بعد 10 مقاطع) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة iPSCs الإنسان في 24 لوحة جيدا والثقافة خلال 4-5 أيام مع تغير وسائل الإعلام يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء الفحص المناعي، وغسل لوحة مع D-PBS مرة واحدة. ثم إصلاح الخلايا مباشرة في بارافورمالدهيد 0.4٪ لمدة 30 دقيقة. بعد أن يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا الثابتة بنسبة 0.1٪ تريتون X-100 الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل permeablization (0.1٪ تريتون X-100 الحل)، ثم يضاف 0.5٪ BSA حل حجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء كشف NANOG، أكتوبر 4، SSEA (مرحلة محددة antig الجنينيةأون) وTRA-1-81 (الورم رفض مستضد) باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة الإنسان في 0.5٪ BSA الحل (راجع الجدول المواد لمعدل الأجسام المضادة التخفيف). احتضان الضد الابتدائية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق باستخدام المجهر مضان بعد 1 ساعة من الحضانة مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد ك 2 الثانية الأجسام المضادة، التي المخفف 1:2،000 في 0.5٪ BSA الحل في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار كل نوى كل الخلايا المغذية MEF وhiPSCs مع دابي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RT-PCR لتأكيد التحوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج مجموع مرنا من بيليه الخلية باستخدام الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيام على عكس النسخ مأخوذة (1 ميكروغرام) من الحمض النووي الريبي مجموع وكدنا] الناتجة عن PCR التضخيم من قبل الناسخ العكسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مخاليط PCR لاحتواء 2 ميكرولتر من قالب [كدنا]، 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي 2X PCR، 2 ميكرولتر من 2 بمول الاشعال(إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 ميكرولتر من DW. للكشف عن التعبير الجيني، تفعل RT-PCR مع الاشعال المدرجة في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء RT-تقارير إنجاز المشروعات مع GAPDH الجين كعنصر تحكم لكفاءة ردود الفعل التضخيم. تصور وتحليل PCR المنتج بنسبة 1٪ الاغاروز هلام الكهربائي. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation,+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures.">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .</li><li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية لhiPSCs يحمل وعودا لم يسبق لها مثيل في البيولوجيا الأساسية، والطب الشخصي، وزرع 12. في السابق، وأجيال التوجيهية البشرية اللازمة فيروس الحمض النووي الذي يحتوي على مخاطر الاندماج في الجينوم المضيف، والتي يمكن أن تخلق طفرات جينية ?...

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة على تعدد القدرات في المختبر، ويكون تجديد الذات، والتي يمكن أن تكون مفيدة محتملة لنمذجة المرض، لفحص المخدرات، ووضع العلاجات المستندة إلى الخلايا لعلاج المرض وإصابات الأنسجة. ومع ذلك، hESCs وجود قيود لاستبدال العلاج الخلية بسبب الحواجز المناعية، الأورام والأخلاقية، ودراسة الجينات المرتبطة بالمرض، يمكن أن تكون معزولة hESCs بأمراض محددة من خلال ما قبل الزرع التشخيص الوراثي (PGD) النهج، لكنه لا يزال تحديا تقنيا والتبرعات الجنين نادرة جدا. وترتبط هذه القضايا إلى التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية، مما أدى إلى تطور الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs). يتم برمجتها iPSCs الإنسان وراثيا من الخلايا الجسمية الكبار الإنسان وتؤوي الجذعية تشبه الخلايا المحفزة ميزات مشابهة لhESCs، مما يجعلها مصدرا مفيدا للطب التجديدي مثل داكتشاف البساط، والنمذجة المرض والعلاج بالخلايا في المريض محددة بطريقة 1،2. حتى الآن، وهناك العديد من الطرق لتوليد iPSCs الإنسان، بما في ذلك بوساطة فيروس (اتش الارتجاعي و) 3، غير الفيروس بوساطة (نظام BAC وناقلات ترنسفكأيشن) 4 transductions الجينات، والبروتينات نظام التسليم 5-7. على الرغم من أن تسليم الجينات بوساطة الفيروس يمكن ضمان مستوى معين من الكفاءة، ويمكن أن يترك بصمة ناقلات فيروسية جينية، لأنهم الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة بطريقة غير المنضبط. حتى عندما التكامل الفيروسية من عوامل النسخ قد تفعيل أو تعطيل الجينات المضيف 8، فإنه يمكن أن يسبب انحراف الوراثية غير متوقعة وخطر تكون الأورام 5،9. من ناحية أخرى، تم الإبلاغ عن الأخذ المباشر من البروتينات أو الحمض النووي الريبي في الخلايا الجسمية، ولكن لديها بعض العيوب مثل كثيفة العمالة، TRANSF المتكررةection، وانخفاض مستوى إعادة برمجة 7،10. حتى episomal وعدم إدماج-اتش، فيروس الغدة المرتبطة، والبلازميد ناقلات لا تزال نسبيا أقل كفاءة 11. لهذه الأسباب، فمن المعقول في اختيار أساليب إعادة برمجة عدم اندماج مع فعالية عالية من الجيل التوجيهية والتشوهات الجينية أقل. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم برمجة سينداي الفيروسات القائمة. ويعرف هذا الأسلوب لتكون غير متكاملة في جينوم المضيف وتنتج باستمرار iPSCs الإنسان دون التكامل التحوير.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1378002</td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&#160;</td>
			<td>Global stem</td>
			<td>GSC-6105M&#160;</td>
			<td>5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Y-27632</td>
			<td style="width:195px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td>10 uM (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>10 ng (Stock : 100 ug)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Knock-out serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>21985023</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:195px;">DSHB</td>
			<td>MC-813-70</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tra-1-81</td>
			<td style="width:195px;">cell signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal Oct4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Nanog</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>948492</td>
			<td>1/2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td style="width:195px;">cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td>205313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">PCR Master Mix [2X]</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NU-301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">dissecting scope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

وقبل بضع سنوات، وإنشاء الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) إيذانا ببدء حقبة جديدة في مجال الطب الحيوي. الاستخدامات المحتملة لiPSCs الإنسان تشمل النمذجة التسبب في الأمراض الجينية البشرية، العلاج بالخلايا ذاتي بعد تصحيح الجين، وشخصية فحص المخدرات من خلال توفير مصدر للخلايا المريض أعراض محددة وذات الصلة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب عليها، مثل القضاء على ما تبقى من عامل إعادة برمجة التحوير التعبير بعد الإنتاج iPSCs الإنسان. الأهم من ذلك، يمكن التعبير التحوير المتبقية في iPSCs الإنسان غير متمايزة تعوق التفرقة السليم وتضليل تفسير مرض ذات الصلة في الظواهر المختبر. مع هذا السبب، تم تطوير خالية من التكامل و / أو iPSCs الإنسان خالية من التحوير باستخدام عدة طرق، مثل اتش، نظام piggyBac، ناقلات minicircle، ناقلات episomal، والتسليم المباشر وبروتين توليفها مرنا. ومع ذلك، وكفاءة reprogramming باستخدام أساليب خالية من التكامل منخفضة جدا في معظم الحالات. هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل iPSCs الإنسان باستخدام سينداي الفيروسات (فيروس RNA) إعادة برمجة النظام القائم. يظهر هذا الأسلوب إعادة برمجة نتائج متسقة وعالية الكفاءة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.

الخلايا الليفية عادة المصابين لا تظهر أي تغيرات شكلية في عدة أيام بعد تنبيغ فيروس سينداي، ولكن بعد خمسة أيام، أنها بداية لديهم أشكال مختلفة (الشكل 1). كما هو موضح في اللوحة اليمنى من الشكل 1، وخلايا لم يكن لديك مورفولوجيا الخلايا الليفية النموذجية أي...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus at JoVE.com

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة. 

Video: Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

To begin, take a flask of cultured fibroblast cells, coat a 10-centimeter cell culture plate suitable for hiPSC culture with four milliliters of cold coating solution per plate, and incubate the plate for one hour at 37 degrees Celsius. Afterward, remove the media from the fibroblasts and wash them with four milliliters of pre-warmed PBS per flask. Aspirate the PBS and associate the fibroblasts with four milliliters of Trypsin-EDTA per flask by incubating for five to seven minutes at 37 degrees Celsius.Monitor cell detachment using a phase contrast microscope, and if needed, tap against the side of the flask to detach the cells from the plastic surface. Transfer the detached cells to a 50-milliliter conical tube and wash the empty flasks with six milliliters of pre-warmed fibroblast medium. Collect and pool the remaining cells in the conical tube.Then centrifuge the cells at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in three milliliters of fresh, pre-warmed PBS. Count the cells, transfer 1.5 times 10 to the sixth fibroblasts into a new conical tube and fill up with PBS to the five millimeter mark.Centrifuge the tube at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, re-suspend the cell pellet in five milliliters of electroporation medium, and centrifuge again. In the meantime, aspirate the coating solution from the coated 10-centimeter cell culture plate and add seven milliliters of pre-warmed fibroblast medium.At the end of the centrifugation, discard the supernatant and re-suspend the cell pellet in electroporation medium with a concentration of 1.5 times 10 to the sixth cells in 250 microliters. Transfer the 250 microliter cell suspension to an electroporation cuvette with a four millimeter gap distance. Next, prepare a plasma transfection mix by adding four micrograms of each plasmid to a total volume of 50 microliters of electroporation medium.Transfer the transfection mix to the cuvette, mix gently by flicking, and electroporate with one pulse at 280 volts. Finally, transfer 150 microliters of the electroporated fibroblasts to the prepared 10-centimeter cell culture plate. Agitate the plate thrice in all directions to distribute the cells, and incubate overnight.Fibroblasts present in a long, spindle-like phenotype, the size of 150 to 300 nanometers. After reprogramming, colonies with 50 micrometer small hiPSCs occur displaying distinct borders. The hiPSCs are distinguished by a high nuclei to body ratio and increased proliferation rate.