אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).

1. הכנת נייד ומדיה (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולהרחיב פיברובלסטים אנושיים עם תקשורת DMEM המכילה 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts צלחת אדם (איור 1) על גבי צלחת 24 גם בצפיפות המתאימה לכל גם ביום שלפני התמרה. הערה: דילולים סדרתי הבאים מומלצים (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ו6.25K) בגלל שיש לי תאים מסוגים שונים יכולת התקשרות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לעוד יום אחד במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור, על מנת להבטיח את התאים יש דבק באופן מלא ומורחבים. </li></ol> 2. בצע התמרה (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של התמרה, לבדוק את צפיפות התאים ובחר בארות צפיפות היעילה ביותר (איור 2). עדיף לבחור שלוש צפיפויות שונות: (80 ~ 90%) גבוהים, (20 ~ 40%) באמצע (50 ~ 70%) ונמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה לפחות 1 לפני התמרה, לשאוב fibroblתקשורת AST מהתאים ולשנות 300 μl החדש של מדיום פיברובלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סט אחד של 4 צינורות וירוס סנדאי שונים מ-80 ° C האחסון. להפשיר צינור אחד באותו הזמן באמבט מים C ° 37 לכמה שניות, ולאחר מכן לקחת את הצינורות החוצה מאמבט המים. אחרי זה, להפשיר אותם לטמפרטורת חדר; צינורות צנטריפוגות ב 6,000 XG במשך 10 שניות ומניחים אותם על קרח עד שימוש. אל מחדש הקפאה ולהפשיר את הווירוס מאז כותרות לא לשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכרכים מצויינים של כל אחד מארבעת צינורות וירוס סנדאי (אוקטובר -4, KLF-4, c-Myc וסוקס-2) לצינור מיקרו צנטריפוגות. ודא כי הפתרון הוא מעורב היטב על ידי pipetting בעדינות. לדוגמא, אם 50K תאים / גם אחד lookwell צלחת 24 גם לתמרה: (כייל מבוסס על תעודת ניתוח מחיים טכנולוגיים, יכול להיות שונה מיצווה כדי תצווה) צינור hOct-4 = 6.0 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 5 μl צינור hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.6 μ; L צינור hKlf-4 = 6.3 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 4.8 μl צינור HC-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 משרד הפנים = 3.8 μl סה&quot;כ = 18.2 μl של ארבעה גורמי וירוס תערובת / טוב אחד (50K תאים) של צלחת 24 גם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצפיפויות תא; להוסיף 2X, 1X, ו0.5x נפח של תערובת הווירוס לתוך הבאר. נער בעדינות את הצלחת קדמית לגב, משמאל ומימין (2X: 36.4 μl של תערובת וירוס, 1X: 18.2 μl ו0.5x: 9.1 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור ודגירת הלילה. </li></ol> 3. החלפה של תרבות בינונית (יום 3 והיום 5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר התמרה, להחליף את המדיום עם 500 בינוני פיברובלסטים μl טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשנות בינוני עם תקשורת פיברובלסטים טרי. </li></ol> 4. להכין מנות MEF לעמית התרבות (יום 8) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי MEF ב60 תרבות מנות מ&quot;מ עם 10% FBS הכיל מדיום DMEM דה אחדy לפני passaging פיברובלסטים transduced על מזין תאי MEF. הערה: אנו משתמשים 5 x 10 5 של MEF בכל מנה 60 מ&quot;מ. </li></ol> 5. התחל משותף תרבות transduced תאים עם תאי מזין MEF (יום 9) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ציפוי תאי transduced, לשאוב 10% FBS הכיל DMEM תקשורת ממנות מזין MEF ולהוסיף טריים 10% FBS הכיל מדיום DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מfibroblasts transduced שנמצאים בצלחת 24 היטב ולשטוף תאי פעם אחת עם D-PBS. הוסף 200 μl של 0.25% טריפסין / EDTA לתוך תאי פיברובלסטים ביישום לוח 24 גם צלחת. לאחר פחות מ -5 דקות דגירה עם טריפסין / EDTA, כאשר התאים מתחילים להתנתק מהצלחת, אוסף את התאים עם מדיום גידול ב15 מיליליטר צינור חרוטי. אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 4 דקות. הערה: איגום 2X, 1X, ווירוס 0.5x פיברובלסטים transduced מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום supernatant ולשטוף מחדש להשעותהתא גלולה עם 4-5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי לנטרול מטריפסין. אז צנטריפוגות ב135 XG במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כמו צפיפות דילול סדרתי ולהתחיל לתרבות משותפת עם תקשורת פיברובלסטים על MEF: כגון 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, ו1/128 ל60 מנה מ&quot;מ. בהתאם לשיעור המוות של תאים במהלך השבוע של התמרה הראשון, אחד עשוי שלא צריך לדלל עד 1/2 או 1/128 צפיפות. לשים בצד את התאים שנותרו כדי לחלץ רנ&quot;א הכל כביקורת חיובית לtransgene RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 60 מנות מ&quot;מ ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך לילה. </li></ol> 6. Feed תאי גזע עוברי האנושי בינוניים ולפקח על תאים (יום 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות את תקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. אחרי זה, לשנות בינוני יומי עם מדיום ES אנושי: 800 מיליליטר DMEM/F12 + 200 מיליליטר החלפת נוק סרום + 10 מיליליטר של L-גלוטמין + 10 מיליליטר של 10 חומצות אמינו מ&quot;מ MEM מינימום שאינו חיוניות+ 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol + 10 / מיליליטר ng הבסיסי פיברובלסטים Growth Factor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שינוי בתקשורת יומיומי עם תקשורת ES אדם טרי. אחרי שבוע, לבדוק את הכלים פעם אחת לכל 2 ~ 3 ימים תחת מיקרוסקופ להיווצרות של גושי תאים כמו מושבה-ES. בהתאם לסוג התא, התרבות תיקח יותר או פחות זמן לפני שהמושבות נמצאות. </li></ol> 7. בחירת המושרה pluripotent גזע מושבות תאים ומרחיב את התאים (יום 20 ~) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לאחר התמרה, מושבות צריכה להיראות גדלו כראוי לקטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני לקטוף את המושבות, להכין מזין MEF בצלחת 24 גם. הערה: אנו משתמשים 12.5 x 10 5 של MEF בצלחת אחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשנות בינוני של מנות MEF מתקשורת פיברובלסטים לתקשורת ES אדם עם 10 מיקרומטר Y-27632. באופן ידני לבחור מושבה אחת בכל פעם מתחת למיקרוסקופ בקטיף מכסה המנוע ולהפוך את הגושים קטנים יותר על ידי pipetting ולהעביר אותםגבי הכין חדש MEF dishes.Try לאסוף כמה שיבוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ולהרחיב את כל טוב מצלחת 24 גם לצלחת גם 6 בתחילה. ואז מצלחת 6 היטב ל60 מ&quot;מ כלים לפני התפשטות נוספת. </li></ol> 8. אפיון iPSCs האדם (לאחר 10 מעברים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs צלחת אדם בצלחת 24 גם ותרבות במהלך 4-5 ימים עם שינוי תקשורת מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחלת assay Immunofluorescence, לשטוף את הצלחת עם D-PBS פעם אחת. ואז לתקן את התאים באופן מיידי בparaformaldehyde 0.4% למשך 30 דקות. אחרי זה לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים קבועים עם 0.1% טריטון ב PBS פתרון X-100 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון permeablization (0.1% פתרון X-100 טריטון), ולאחר מכן להוסיף 0.5% פתרון חסימת BSA במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זיהוי של Nanog, אוקטובר -4, SSEA (antig העוברי בשלב מסויםen) וTRA-1-81 (אנטיגן הסרטני דחייה) באמצעות נוגדן אנטי אנושי ב0.5% פתרון BSA (לבדוק את טבלת חומר לשיעור דילול נוגדנים). דגירה העיקרית נוגדן ל2 שעות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים בD-PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 1 שעות של דגירה עם 488 עיזים נוגדני IgG אנטי עכבר Alexa פלואוריד כנוגדן 2 nd, אשר בדילול 1:2,000 ב0.5% פתרון BSA בטמפרטורת חדר. להכתים את כל הגרעינים של כל תאי MEF מזין וhiPSCs עם DAPI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RT-PCR של אישור transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-mRNA הכולל מתא גלולה באמצעות ריאגנטים מיצוי RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שעתוק לאחור על aliquots (1 מיקרוגרם) של רנ&quot;א הכל וcDNA הנגזר לPCR הגברה על ידי הפוך transcriptase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובות PCR להכיל 2 μl של תבנית cDNA, 10 μl של תערובת אמן 2X PCR, 2 μl של 2 pmol של פריימרים(קדימה: μl 1 הפוך: μl 1) ו -6 μl של DW. כדי לזהות את ביטוי גנים, לעשות RT-PCR עם פריימרים המופיעים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RT-PCRs עם גן GAPDH כביקורת על יעילות של תגובות ההגברה. לחזות ולנתח מוצר ה-PCR ב -1% אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation,+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures.">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .</li><li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה 12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון ?...

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs). iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ב1,2 אופן ספציפי למטופל. עד עכשיו, יש כמה 3, מערכת אספקת חלבון 5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך 4 transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus). למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח 8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של 7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים 11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&amp;nbsp;</td><td>Global stem</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;/6 cm or 12.5 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;/24-well plate</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &amp;#956;M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stock : 100 ug)</td></tr><tr><td>Knock-out serum replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>11140050</td><td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>mouse monoclonal Oct4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;#039;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &amp;amp; magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>picking hood</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>dissecting scope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.

fibroblasts הנגוע בדרך כלל לא מראה שינויים מורפולוגיים במספר ימים לאחר התמרה וירוס סנדאי, אבל חמישה ימים לאחר מכן, הם מתחילים לקבל צורות שונות (איור 1). כפי שתואר בפנל ימני של איור 1, אין לי תאים פיברובלסטים מורפולוגיה טיפוסית יותר. יש להם צורה עגולה וגדול י...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus at JoVE.com

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת. 

Video: Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Bioengineering

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...