We thank Ueli Grossniklaus (University of Z&#252;rich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Z&#252;rich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).

يوصف الإجراء في سير العمل في الشكل 1، ويتم عرض الإعداد للتشريح والتضمين من الأنسجة في الشكل 2. 1. تثبيت الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 20-30 الكرابل في أنبوب microfuge تحتوي تقدم طازجة BVO تثبيتي عازلة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة دقيقة 30 مع طيف تهتز في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنابيب التي تحتوي على الكرابل في تثبيتي في الفوق ميكروسنتريفوج 1 دقيقة في ز × 400. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية عازلة تثبيتي، وإضافة 1 مل من PBT، ووضع أنابيب على الجليد. </li></ol> 2. تشريح وتضمينها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خمسة أنابيب إيبندورف مع كل 200 ميكرولتر من تقدم طازجة، 5٪ مزيج الأكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خمس شرائح Superfrost تنظيفها قبل مع الايثانول 70٪ والمسمى مع قلم رصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة واحدة من 20٪ و 20٪ وكالة الأنباء الجزائرية قيلولة كل منهما، على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 4-5 الكرابل مع طرف قطع نهاية، ومكانمنهم على شريحة نظيفة، وإزالة الزائدة من السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تخفيضات طولية مع إبرة رفيعة وفصل الجدران خباء للافراج عن صفوف من البويضات كما هو موضح الشكل 2، وتجنب التجفيف من خلال تغطية مع برنامج تلفزيوني (لا يزيد عن 10 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بسرعة ومزيج 12 ميكرولتر القيلولة، 12 APS ميكرولتر مع قسامة من 200 ميكرولتر مزيج الأكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من الأكريلاميد تفعيلها على البويضات تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية مع 20 × 20 مم ساترة، والسماح تتبلمر في درجة حرارة الغرفة، 45-60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة باستخدام شفرة حلاقة. في هذه المرحلة، ويمكن أن تظل عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في جرة Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني. </li></ol> 3. معالجة الأنسجة ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستثناء 3.2.1، 3.2.3، 3.3.2 و3.4.3 في الجرار Coplin مع 80 مل من محلول تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية في درجة حرارة الغرفة. يتم نقل الشرائح مع ملقط غيض مسطحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح الأنسجة والتثبيت: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 30 دقيقة في الإيثانول: الزيلين (1:1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة في الميثانول وPBT (1:1)، وتستكمل مع 2.5٪ الفورمالديهايد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف 2 × 10 دقيقة في PBT. في هذه المرحلة، والشرائح يمكن أن تبقى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جدار الخلية الهضم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من مزيج الهضم جدار الخلية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ شريحة من جرة Coplin، واستنزاف الفائض من السوائل عن طريق وضعه عموديا على منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من جدار الخلية مزيج الهضم أكثر من لوحة الأكريلاميد، وتغطي مع 23 × 46 مم ساترة. تكرار للشرائح الأخرى. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في غرفة رطبة (الموصوفة في المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح 2 × 5 دقائق في PBT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريبونوكلياز والعلاج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ شريحة من جرة Coplin، واستنزاف اله الزائدة من السوائل كما كان من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل شريحة مع 100 ميكرولتر من RNAseA في 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني مع 1٪ توين 20 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في PBT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تثبيت وpermeabilization: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح لمدة 20 دقيقة في تقدم طازجة PBT-F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح لمدة 10 دقيقة في PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize لمدة 2 ساعة في برنامج تلفزيوني مع 2٪ توين 20 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في PBT. </li></ol></li></ol> 4. المناعية ملاحظة: للحصول على هذه الخطوة، والتركيز الأمثل من الأجسام المضادة الأولية لابد من اختبارها باستخدام التخفيفات مختلفة (1:200، 1:500، 1:1000) من الأجسام المضادة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل شريحة مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ توين 20 لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في PBT لمدة 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق1:200 الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني + 0.2٪ توين 20 لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين مع 10 ميكروغرام / مل يوديد propidium في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، ثم يشطف 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني تحت الهز لطيف، في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل في مكافحة يتلاشى مرس السائل تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل يوديد propidium. السماح للتصاعد التشدد المتوسطة لمدة 1 ساعة قبل الحصول على الصور من قبل CLSM. </li></ol> 5. التصوير الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور عالية الدقة باستخدام CLSM، من الناحية المثالية باستخدام وضع المسح بالرنين، والذي يسمح الحفاظ بشكل أفضل على إشارات الفلورسنت على التصوير لفترة طويلة 23، وعدسة الغمر 63X الجلسرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار المعلمات اقتناء مثل كثافة الليزر، وزيادة، ذات الثقب، وحجم فوكسل وعامل التكبير في بداية التجربة لتحديد الإجراء اقتناء القياسية لتتبع بدقة في جميع أنحاءكافة الشرائح لقياس الكمي متسقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من عدم وجود عبر الحديث بين fluorochromes. إذا كان موجودا، إعداد المسح المتتابع. الحصول على صور نقل بشكل منفصل وليس في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المسلسل الحصول على الصور، ثلاثي الأبعاد مع أعلى دقة ممكنة في x و y و الأبعاد مع الإفراط في 2X البعد ض (القاعدة في نيكويست). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الصور: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة بناء الصور المسلسل في ثلاثة أبعاد باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو التجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد السطوح كفاف حول كل نواة (أو خلايا) من الفائدة في 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان في كل قناة كمجموع شدة بكسل في كل كائن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات إلى Excel للتحليل الإحصائي. تطبيع إشارات الأجسام المضادة ضد إشارات تلطيخ مثل الحمض النووي. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li><li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana.">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li><li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis.">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li><li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana.">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li><li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen.">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare.">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li><li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin.">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li><li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development:+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II.">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li><li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy.">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li><li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana.">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li><li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants.">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li><li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum.">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li><li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+(Zea+mays).">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li><li>Niedojad&#322;o, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization.">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li><li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+(Illiciaceae;+Austrobaileyales):+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots,+eumagnoliids,+and+eudicots.">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li><li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis:+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase.">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li><li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells.">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li><li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants.">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li><li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis.">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li><li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling.">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li><li>Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).</li><li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feulgen+reaction+75+years+on.">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy.">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana.">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

في النباتات المزهرة، وتحيط النسب التناسلي للأنثى من خلال عدة طبقات الخلية بما في ذلك nucellus وteguments بويضة، مما يجعل تلطيخ الخلوي في كامل جبل تحديا تقنيا. هنا نقدم بروتوكول كفاءة تمكين إعداد وتجهيز عدد كبير من البويضات مناسبة لتلطيخ الخلوي مثل المناعية، وتلطيخ DNA ومضان ا...

في النباتات المزهرة، وإنشاء الأنساب الإنجابية تبدأ مع تمايز SMCS، MMC الإناث والخلية الأم للأبواغ الصغيرة الذكور. في MMC يتطور من خلية nucellar البشرة الفرعي في الطرف البعيد من منشم بويضة، والخلية الأم للأبواغ الصغيرة يطور من الأنسجة تبوغية في locule العضو الذكري، والتي تقع في عمق الأجهزة الأزهار 1. SMCS الخضوع الانقسام الاختزالي لإنتاج أبواغ فرداني، ثم التي تؤدي إلى منشئات الأمشاج على الانقسام. الأمشاج الأنثوية، أو كيس الجنين، ويتكون من خلية واحدة بيضة، خلية مركزية واحدة، واثنين وثلاثة synergids antipodals. تتكون الأمشاج من الذكور، أو غبار الطلع، من الخلايا الخضرية واحد واثنين خلايا الحيوانات المنوية. بينما يبقى النبات العروسي الذكور دراسة الكائن من الوصول إليها نسبيا، وجزءا لا يتجزأ من الأمشاج الأنثوية داخل بويضة، في حد ذاته المغلقة في خباء زهرة، وبالتالي يطرح تحديات محددة لالتحليلات الجزيئية والخلوية. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، بمساعدة الليزرعرضت تسليخ مجهري حل أنيق يسمح يحلل transcriptomic في MMC والخلايا gametophytic الإناث 2-4. بالإضافة إلى مرشح التعبير الجيني التحليلات، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي مثل الموقع التهجين أو فحوصات الجينات مراسل في، تحليلات الخلوي يسمح التحقيق في ديناميات المكونات الخلوية الذاتية باستخدام تلطيخ الخلوية المباشر معينة أو المناعية غير المباشرة. وخاصة، وتلطيخ الوراثية الخلوية باستخدام FISH وتلطيخ DNA، جنبا إلى جنب مع المناعية من التعديلات لونين أو مكونات لونين من النهج المركزي لتوضيح ديناميات وتنظيم الكروماتين النووي في نبات الأرابيدوبسيس 5. عادة، الانقسام الاختزالي يستتبع ديناميات كروموسوم معين والتي تم التحقيق فيها بشكل جيد في مصنع الذكور meiocytes 6،7؛ وقد وصفت كذلك على نطاق واسع، خلية محددة لونين إعادة التنظيم، إعادة برمجة جينية المرجح يعكس ديناميكية أثناء تطوير لقاح 8-10. على النقيض من ذلك، ويرجع ذلكلصعوبة الوصول النسبي للإناث meiocyte ومنشئات الأمشاج، لا تزال هذه التحقيقات صعبة تقنيا أن تطبق، وغالبا ما تتطلب تشريح باجتزاء أو دليل والهضم الأنزيمي (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، عدم وضوح بصري انتشارا في جبل لالجامع هو عقبة أمام التصوير ذات الدقة العالية من الخلايا التناسلية في البويضات سليمة. وهناك طريقة الكلاسيكية للتحليل الخلوي الصبغي التنظيم في البويضات كله يشن يستخدم تلطيخ فولغين 11-13. أنها تنطوي على التحلل حمض (حمض تحت الكلور باستخدام) من الحمض النووي الذي ينتج البروتين تمسخ وبالتالي يسبب تدمير بنية الكروماتين. بدلا من ذلك، تنظيم كروموسوم في meiocytes الإناث والخلايا gametophytic يمكن ملاحظتها باستخدام تلطيخ دابي والمناعية على المقاطع شبه رقيقة أو الحويصلات الجنين تشريح وMMC (على سبيل المثال نرى 14-18). بوضوح، ومع ذلك، وتشريح دليل باجتزاء يمكن أن تكون كثيفة العمالة ويعوق على التحليل النوعي والكمي لعدد كبير من الحواتم لونين. هنا نقدم بروتوكول فعالة لإعداد عدد كبير من البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لمجموعة متنوعة من المصب تلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. باختصار، يتم تحضين براعم الزهور في محلول تثبيتي، يتم تشريح صفوف من البويضات من خباء وجزءا لا يتجزأ من مادة الأكريلاميد على الشريحة كما فعلت لmeiocytes حبوب اللقاح 19،20. وكذلك مسح البويضات جزءا لا يتجزأ من وثابت في الميثانول والإيثانول والزيلين وقبل الهضم جدار الخلية وpermeabilization. وتناقش الاختلافات المحتملة لهذه الخطوات. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم عينات الحمض النووي لتلطيخ، المناعية، والأسماك. وضع إعداد غير فعالة، ويتيح موازية التجريبية مجموعة المتابعة (ما يصل إلى 16 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد في يوم واحد لمختلف تحليل المصب). العلاجات الموصوفة تمكين إشارات متجانسة كليا جبل والحفاظ عليها جيدا النسيجية الخلوية،وتنظيم النووي في الخلايا التناسلية والخلايا المحيطة nucellar التي تستفيد المقارنات الكمية والنوعية بين أنواع الخلايا. معايرة، استنادا CLSM عالية الدقة التصوير تليها إعادة الإعمار 3 الأبعاد تمكن القياسات الكمية مغزى الإشارات الفلورسنت. استخدمنا بنجاح هذا الإجراء لتحليل ديناميات ونين في MMC التفريق 21 وتطوير منشئات الأمشاج الإناث 22؛ نقدم هنا نتائج ممثل التحليل المغاير، المناعية لونين، GFP المناعية وFISH في كامل جبل البويضات. ونحن نعتقد أيضا أن بروتوكول لدينا سوف تكون مناسبة للأنسجة النباتية الأخرى والأنواع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="993">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"><a name="RANGE!A1:D39">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:481px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Solutions</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BVO Fixation Buffer (based on32)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT-F</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">30% acrylamide:bisacrylamide&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1&#215; PBS (prepare 10ml, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">200mL&#160; 5% acrylamide mix in PBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1&#215; PBS (make fresh from 30% stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% ammoniumpersulfte&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% sodium sulfite&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell wall enzyme mix</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents and Materials</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Amaresco</td>
			<td>0497</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4436.1</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1794</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Driselase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8037</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pectolyase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5936</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3553</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bisacrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2022</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammoniumpersulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9164</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium sulfite</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71988</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-473</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-448</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11008</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProlongGold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coplin jar</td>
			<td>Huber &#38; CO</td>
			<td>10.055</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00-0</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Moist chamber</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td style="width:481px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FISH Tag DNA KIt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F32947</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFP booster</td>
			<td style="width:135px;">Chromotek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for quantitative, single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount ovules in arabidopsis

في النباتات المزهرة، ويتم وضع علامة على مصير الخلية الجسدية التي تمر بمرحلة انتقالية، لالإنجابية بحلول مواصفات الخلايا الأم بوغ (SMCS) في أجهزة الأزهار من نبات الكبار. وSMC الإناث (الخلية الأم للأبواغ الضخمة، MMC) يفرق في منشم بويضة ويخضع الانقسام الاختزالي. وأبواغ الضخمة فرداني اختيارها ثم يخضع الانقسام لتشكل الأمشاج الإناث متعددة الخلايا، والتي سوف تؤدي إلى الأمشاج، وخلية بويضة وخلية المركزية، جنبا إلى جنب مع الخلايا التبعي. إمكانية الوصول المحدودة للMMC، meiocyte ومنشئات الأمشاج الإناث داخل بويضة يمثل تحديا تقنيا للالخلوي والتحليلات الوراثية الخلوية على مستوى خلية واحدة. بشكل خاص، هو ضعف مناعي مباشر أو غير مباشر من الحواتم الخلوية أو النووية عن سوء تغلغل الكواشف داخل الخلية النباتية والتصوير وحيدة الخلية والمؤجرة من قبل عدم وضوح بصري في كامل جبل الأنسجة. وبالتالي، قمنا بتطوير وسيلة فعالة لتحليل nuclمنظمة الأذن وتعديل لونين بدقة عالية من خلية واحدة في كامل جبل البويضات نبات الأرابيدوبسيس المضمنة. لأنه يقوم على تشريح والتضمين من البويضات ثابتة في طبقة رقيقة من الجل مادة الأكريلاميد على شريحة مجهرية. التي يتعرض لها جزءا لا يتجزأ من البويضات للعلاجات الكيميائية والأنزيمية التي تهدف إلى تحسين وضوح الأنسجة والنفاذية إلى الكواشف المناعية. تلك العلاجات الحفاظ على التنظيم، والحمض النووي والبروتينات الخلوية والحواتم لونين. العينات يمكن استخدامها لمختلف التحليلات الخلوي المصب، بما في ذلك المناعية لونين، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، وتلطيخ DNA لتحليل المغاير. متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) التصوير، مع ارتفاع القرار، تليها إعادة الإعمار 3D يسمح لقياس الكمي في قرار وحيد الخلية.

نحن نقدم بروتوكول قوية لإعداد واسعة النطاق وتجهيز البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لتلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. بفضل التضمين، والبويضات الاحتفاظ بنية 3 الأبعاد (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، فإن معالجة الأنسجة بما في ذلك توضيح البصرية تمكن التصوير الهيا...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis at JoVE.com

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

13.1K Views.  University of Zürich.  نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين و?...

Video: An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve the three-dimensional chromatin arrangement of testicular germ cells found in mice; this method has been termed as the three-dimensional (3D) slide method. In this method, testicular tubules are directly treated with a permeabilization step that removes cytoplasmic material, followed by a fixation step that fixes nuclear materials. Tubules are then dissociated, the cell suspension is cytospun, and cells adhere to slides. This method improves sensitivity towards detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) and the combination of these detection methods. As an example of a possible application of the 3D slide method, a Cot-1 RNA FISH is shown to detect nascent RNAs. The 3D slide method will facilitate the detailed examination of spatial relationships between chromatin structure, DNA, and RNA during testicular germ cell differentiation.

The material here describes a method developed to preserve the three-dimensional chromatin structure of testicular germ cells. This has been termed the three-dimensional (3D) slide method. This method improves sensitivity for detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH).

طريقة إعداد الشرائح للحفاظ على هندسة الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

ككل جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em&gt; الراكدة المنقعية</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

طريقة تلقيح سهلة ومرنة لتقييم الأنماط الظاهرية لعدوى البياض الدقيقي للأرابيدوبسيس والنباتات الأخرى بدقة

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...