We thank Ueli Grossniklaus (University of Z&#252;rich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Z&#252;rich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).

ההליך מתואר בזרימת העבודה באיור 1, וההתקנה לנתיחה והטבעה של רקמות מוצגות באיור 2. 1. קיבוע רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20-30 carpels בצינור microfuge המכיל חיץ מקבע BVO טרי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את דקות הרקמות 30 עם עדין רועד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הצינורות המכילים carpels במקבע בדקות microcentrifuge המעבדתיים 1 ב400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בזהירות את החיץ מקבע ולהוסיף 1 מיליליטר של PBT, למקם את הצינורות על קרח. </li></ol> 2. Dissection והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חמישה צינורות Eppendorf עם כל 200 μl של טרי, תערובת acrylamide 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חמש שקופיות Superfrost מראש לנקות עם 70% אתנול ושכותרתו עם עיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו aliquot אחד APS 20% ותנומות 20% כל אחת, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 4-5 carpels עם קצה חיתוך קצה, מקוםשלהם בשקופית נקייה, להסיר את עודפי נוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתכים אורך עם מחט דקה ולנתק את קירות carpel לשחרר שורות של ביציות כאיור מוצג 2, להימנע מייבוש על ידי כיסוי עם PBS (לא יותר מ 10 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להוסיף ולערבב 12 תנומות μl, 12 APS μl עם aliquot של 200 תמהיל acrylamide μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של acrylamide מופעל על הביציות גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה עם coverslip מ&quot;מ 20 x 20, בואו פלמר בטמפרטורת חדר, 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip באמצעות סכין גילוח. בשלב זה, יכולה להישמר דגימות לילה ב 4 ° C בצנצנת Coplin המכילה PBS. </li></ol> 3. עיבוד רקמות הערה: כל הצעדים מלבד 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ו 3.4.3 מתבצעים בצנצנות Coplin עם 80 מיליליטר פתרון מתחת למכסת המנוע הכימי בטמפרטורת חדר. שקופיות מועברות עם מלקחיים שטוח קצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבהרה ורקמותקיבעון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות במתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות באתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30 דקות באתנול: קסילן (1:1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות באתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות במתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות במתנול וPBT (1:1), השלימה עם פורמלדהיד 2.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף 2 x 10 דקות בPBT. בשלב זה, יכולה להישמר שקופיות לילה בשעה 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופן תא עיכול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו aliquot של תמהיל עיכול דופן תא על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את שקופית מצנצנת Coplin, לנקז את עודף הנוזלים על ידי הצבתו בצורה אנכית על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של תערובת עיכול דופן תא 100 μl מעל משטח acrylamide ולכסות עם coverslip מ&quot;מ 23 x 46. חזור לשקופיות האחרות. דגירה עבור שעה 2 על 37 מעלות צלזיוס בתא לח (שמתוארת בחומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דקות 2 x 5 שקופיות בPBT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNase טיפול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את שקופית מצנצנת Coplin, ניקוז העודף דואר של נוזל כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל שקופית עם של RNAseA 100 μl ב100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS עם Tween-20 1% עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע וpermeabilization: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן עבור 20 דקות בטריות PBT-F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 10 דקות בPBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize עבור שעה 2 ב-PBS עם Tween-20 2% ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT. </li></ol></li></ol> 4. Immunostaining הערה: לצעד זה, הריכוז האופטימלי של הנוגדן הראשוני יש להיבדק על ידי שימוש בדילולים שונים (1:200, 1:500, 1:1000) של הנוגדנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל שקופית עם של נוגדן ראשוני 100 μl המדולל PBS עם 20-Tween 0.2% לשעה 12-24 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות בPBT במשך 2-4 שעות בטמפרטורת חדר בטלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל1:200 נוגדן המשני ב-PBS + 0.2% Tween-20 ל24 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBT במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר מתחת לטלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם יודיד 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium ב-PBS במשך 15 דקות, ואז לשטוף 15 דקות ב-PBS בטלטול עדין, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר בmountant נוזל אנטי דהייה בתוספת 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium יודיד. בואו ההרכבה בינונית להקשיח עבור שעה 1 לפני רכישת תמונות על ידי CLSM. </li></ol> 5. הדמיה כמותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות באמצעות CLSM, באופן אידיאלי באמצעות מצב סריקת תהודה, המאפשר שימור טוב יותר של אותות ניאון מעל ההדמיה ממושכת 23, ועדשת 63x טבילת גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפרמטרים הרכישה כגון עוצמת לייזר, רווח, חריר, גודל voxel וגורם הזום בתחילת הניסוי להגדיר הליך רכישה סטנדרטי להקפיד לעקוב לאורךכל השקופיות למדידות כמותיות עקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא העדר הדיבור צולב בין fluorochromes. אם קיימים, להגדיר סריקה רציפה. לרכוש תמונות שידור בנפרד ולא בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע רכישת סדרתי, תלת ממדי תמונה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר אפשרית ובממדי x y ועם דגימת יתר 2x בממד z (שלטונו של נייקוויסט). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד תמונה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר תמונות סידוריים בשלושת ממדים באמצעות תוכנת קוד מסחרית או פתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת משטחי גובה סביב כל גרעין (או סלולרי) של עניין ב-3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת הקרינה בכל ערוץ כסכום של עוצמות פיקסל בכל אובייקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים ל-Excel עבור ניתוחים סטטיסטיים. לנרמל את אותות נוגדנים נגד אותות מכתים למשל ה-DNA. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li><li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana.">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li><li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis.">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li><li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana.">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li><li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen.">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare.">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li><li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin.">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li><li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development:+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II.">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li><li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy.">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li><li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana.">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li><li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants.">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li><li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum.">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li><li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+(Zea+mays).">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li><li>Niedojad&#322;o, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization.">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li><li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+(Illiciaceae;+Austrobaileyales):+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots,+eumagnoliids,+and+eudicots.">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li><li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis:+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase.">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li><li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells.">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li><li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants.">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li><li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis.">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li><li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling.">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li><li>Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).</li><li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feulgen+reaction+75+years+on.">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy.">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana.">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בצמחים פורחים, שושלת הרבייה הנשית מוקפת בכמה שכבות תאים הכוללים nucellus וteguments הביצית, ובכך הופכת את צביעת ציטולוגית בכל הר מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול יעיל המאפשר העריכה ולעיבוד של מספר רב של ביציות מתאימות לצביעת ציטולוגית כגון immunostaining, מכתים DNA וקרינת...

בצמחים פורחים, הקמת שושלות רבייה מתחילה בבידול של SMCs, MMC הנשי ותא האם נבגון גברי. MMC מתפתח מתא nucellar תת אפידרמיס בקצה הדיסטלי של primordium הביצית, והתא האם נבגון מתפתח מרקמת sporogenous במאבק locule, אשר ממוקמים עמוק בתוך האיברים פרחוניים 1. SMCs לעבור מיוזה לייצר נבגים הפלואידים, אשר לאחר מכן להצמיח gametophytes על מיטוזה. נקבת gametophyte, או שק עובר, מורכב מתא אחד ביצה, תא מרכזי אחד, שתיים ושלוש synergids antipodals. Gametophyte הגברי, או האבקה, מורכבת מתא אחד של צמח ושני תאי זרע. בעוד gametophyte הזכר נשאר מחקר אובייקט-of-יחסית נגיש, הנשי gametophyte מוטבע בתוך הביצית, את עצמו מוקף בcarpel הפרח, ובכך מציב אתגרים ספציפיים לניתוחים מולקולריים וציטולוגיה. לאחרונה, עם זאת, בסיוע לייזרmicrodissection הציע פתרון אלגנטי המאפשר transcriptomic מנתח בMMC ותאי gametophytic הנשיים 2-4. בנוסף לביטוי גני מועמד מנתח, תוך שימוש למשל RNA הכלאה באתר או מבחני גן כתב, ניתוחי ציטולוגית מאפשר חוקרים את הדינמיקה של מרכיבים תאיים אנדוגני באמצעות מכתים ספציפי ישיר הסלולר או immunostaining העקיף. במיוחד, מכתים ציטוגנטית באמצעות דגים ומכתימים-DNA, יחד עם immunostaining של שינויי הכרומטין או רכיבי הכרומטין גישות מרכזיות על מנת להבהיר דינמיקת הכרומטין וארגון גרעיני בארבידופסיס 5. בדרך כלל, מיוזה כרוכה דינמיקה של כרומוזום מסוימת שנחקרה היטב בזכר מפעל meiocytes 6,7; בקנה מידה גדול עוד יותר, ארגון מחדש הכרומטין תא ספציפי, סביר המשקף את תכנות מחדש אפיגנטיים דינמי תוארה במהלך התפתחות אבקת 8-10. לעומת זאת, בשללנגישות היחסית של נקבת meiocyte וgametophyte, החקירות אלה נשארים קשות מבחינה טכנית ליישם, ולעתים קרובות דורשות נתיחת חתך או הוראות ועיכול אנזימטי (ראה להלן). בנוסף, חוסר הרווח של בהירות אופטית בכל ההר הוא מכשול להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי רבייה בביציות ללא פגע. שיטה קלאסית לניתוח ציטולוגית של ארגון כרומוזום בביציות כל הר משתמשת בהכתמה של Feulgen 11-13. זה כרוך הידרוליזה חומצה (באמצעות חומצת hypochlorous) של ה-DNA שתוצאת denaturation חלבון ובכך גורם להרס של מבנה הכרומטין. לחלופין, ארגון כרומוזום בmeiocytes הנשי ותאי gametophytic ניתן לצפות באמצעות מכתים DAPI וimmunostaining על סעיפי חצי דקים או שקי עובר גזורים וMMC (למשל לראות 14-18). עם זאת, ברור נתיחה וחתך במדריך יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ופוגע בניתוח האיכותי וכמותי של מספר גדול של אפיטופים הכרומטין. כאן אנו מספקים פרוטוקול יעיל להכין מספר גדול של ביציות ארבידופסיס מתאימות למגוון של מכתים ציטולוגית במורד הזרם בכל ההר. בקיצור, ניצני פרחים מודגרת בפתרון מקבע, שורות של ביציות הם גזורים מcarpel והמשובצת בacrylamide בשקופית כפי שנעשו לmeiocytes האבקה 19,20. הביציות מוטבעות נמחקות נוספת וקבוע במתנול, אתנול, וקסילן לפני דופן תא עיכול וpermeabilization. וריאציות אפשריות של צעדים אלה הם דנו. הדגימות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים DNA, immunostaining, ודגים. מצב ההכנה הוא יעיל ומאפשר לניסוי הגדרה מקבילה (אפשר להכין עד 16 שקופיות ביום לניתוח במורד הזרם שונה). הטיפולים שתוארו יאפשר אותות הומוגנית בכל ההר והשתמרו היסטולוגית, סלולארי טוב,וארגון גרעיני בתאי רבייה ותאים המקיפים nucellar אשר נהנים השוואות איכותיות וכמותית בין סוגי תאים. מכויל, הדמיה ברזולוציה גבוהה המבוססת על CLSM ואחריו שחזור 3 ממדים מאפשרת מדידת כמותית משמעותית של אותות ניאון. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לנתח את דינמיקת הכרומטין בMMC ההבחנה 21 ופיתוח נשי gametophyte 22; אנו מציגים כאן תוצאות נציג של ניתוח heterochromatin, immunostaining הכרומטין, immunostaining GFP ודגים בביציות כל הר. בנוסף, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו יהיה מתאים לרקמות צמח אחרות ומינים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="993">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"><a name="RANGE!A1:D39">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:481px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Solutions</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BVO Fixation Buffer (based on32)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT-F</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">30% acrylamide:bisacrylamide&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1&#215; PBS (prepare 10ml, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">200mL&#160; 5% acrylamide mix in PBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1&#215; PBS (make fresh from 30% stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% ammoniumpersulfte&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% sodium sulfite&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell wall enzyme mix</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents and Materials</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Amaresco</td>
			<td>0497</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4436.1</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1794</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Driselase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8037</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pectolyase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5936</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3553</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bisacrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2022</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammoniumpersulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9164</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium sulfite</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71988</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-473</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-448</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11008</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProlongGold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coplin jar</td>
			<td>Huber &#38; CO</td>
			<td>10.055</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00-0</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Moist chamber</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td style="width:481px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FISH Tag DNA KIt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F32947</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFP booster</td>
			<td style="width:135px;">Chromotek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for quantitative, single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount ovules in arabidopsis

בצמחים פורחים, המעבר גורל תא סומטי לרבייה מתאפיין במפרט של תאי אם נבג (SMCs) באיברים פרחוניים של הצמח הבוגר. נקבת SMC (תא האם megaspore, MMC) מבדיל בprimordium הביצית ועובר מיוזה. Megaspore הפלואידים שנבחר לאחר מכן עובר מיטוזה ליצירת הנשית gametophyte רב תאי, שיהיה להצמיח תאי הרבייה, תא הביצית ותא מרכזי, יחד עם תאי אבזר. הנגישות המוגבלת של MMC, meiocyte וgametophyte הנשי בתוך הביצית היא מאתגרת מבחינה טכנית לציטולוגיה וציטוגנטית מנתח ברמת תא בודדת. במיוחד, immunodetection ישיר או העקיף של אפיטופים סלולריים או גרעיניים נפגעים על ידי חדירה ירודה של חומרים כימיים בתוך ההדמיה תא צמח ותא בודד demised ידי חוסר הבהירות אופטית ברקמות כל הר. לכן, פיתחנו שיטה יעילה לנתח nuclארגון אוזן ושינוי הכרומטין ברזולוציה גבוהה של תא בודד בכל הר ביציות ארבידופסיס משובצים. היא מבוססת על נתיחה והטבעה של ביציות קבועות בשכבה דקה של ג&#39;ל acrylamide בשקופית מיקרוסקופית. הביציות מוטבעות חשופים לטיפולים כימיים והאנזימטית שמטרתן שיפור בהירות וחדירות רקמה לחומרים הכימיים immunostaining. טיפולים אלה לשמר אפיטופים ארגון, דנ&quot;א וחלבון תאיים והכרומטין. הדגימות יכולות לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם ציטולוגית, כוללים immunostaining הכרומטין, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), ומכתים DNA לניתוח heterochromatin. הדמיה מיקרוסקופית סריקת לייזר confocal (CLSM), עם רזולוציה גבוהה, ואחריו שחזור 3D מאפשרת למדידות כמותיות ברזולוציה תא בודד.

אנו מספקים פרוטוקול חזק להכנה בקנה מידה גדולה ועיבוד של ביציות ארבידופסיס מתאימות לצביעת ציטולוגית בכל ההר. הודות להטבעה, הביציות לשמר מבנה 3 ממדים (איור 3). יתר על כן, עיבוד הרקמות כולל הבהרה אופטית מאפשר מבני subcellular הדמיה ברזולוציה גבוהה. איור 4...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis at JoVE.com

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

13.1K Views.  University of Zürich.  אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית. 

Video: An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve the three-dimensional chromatin arrangement of testicular germ cells found in mice; this method has been termed as the three-dimensional (3D) slide method. In this method, testicular tubules are directly treated with a permeabilization step that removes cytoplasmic material, followed by a fixation step that fixes nuclear materials. Tubules are then dissociated, the cell suspension is cytospun, and cells adhere to slides. This method improves sensitivity towards detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) and the combination of these detection methods. As an example of a possible application of the 3D slide method, a Cot-1 RNA FISH is shown to detect nascent RNAs. The 3D slide method will facilitate the detailed examination of spatial relationships between chromatin structure, DNA, and RNA during testicular germ cell differentiation.

The material here describes a method developed to preserve the three-dimensional chromatin structure of testicular germ cells. This has been termed the three-dimensional (3D) slide method. This method improves sensitivity for detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH).

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

שיטת חיסון קלה וגמישה להערכה מדויקת של פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי של ערבידופסיס וצמחים אחרים

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...