We thank Ueli Grossniklaus (University of Z&#252;rich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Z&#252;rich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).

La procedura è descritta nel flusso di lavoro in Figura 1, e la configurazione per la dissezione e l&#39;incorporamento di tessuti sono rappresentati nella Figura 2. 1. Tissue fissaggio <ol><li> Raccogliere 20-30 carpelli in una provetta per microcentrifuga contenente appena fatto tampone fissativo BVO sul ghiaccio. </li><li> Fissare il tessuto 30 min con una leggera agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Gira le provette contenenti i carpelli in fissativo in un banco microcentrifuga 1 min a 400 x g. </li><li> Rimuovere con cautela il buffer fissativo e aggiungere 1 ml di PBT, posizionare i tubi sul ghiaccio. </li></ol> 2. Dissection and Embedding <ol><li> Preparare cinque provette Eppendorf con ogni 200 ml di un appena fatto, 5% miscela di acrilamide. </li><li> Preparare cinque vetrini Superfrost pre-puliti con il 70% di etanolo e marcate con una matita. </li><li> Scongelare una aliquota del 20% di APS e il 20% PAN ciascuno, sul ghiaccio. </li><li> Prendere 4-5 carpelli con una punta cut-end, postoli su un vetrino pulito, rimuovere l&#39;eccesso di liquido. </li><li> Effettuare tagli longitudinali con un ago sottile e staccare le pareti carpello a rilasciare file di ovuli, come mostrato figura 2, evitare la disidratazione coprendo con PBS (non superiore a 10 ml). </li><li> Aggiungere rapidamente e mescolare 12 PAN microlitri, 12 APS microlitri con una aliquota di 200 microlitri mix acrilamide. </li><li> Aggiungere 30 ml di acrilammide attivato sui ovuli sezionati. </li><li> Coprire con un coprioggetto mm 20 x 20, lasciate polimerizzare a temperatura ambiente, 45-60 min. </li><li> Rimuovere il vetrino con una lama di rasoio. In questa fase, i campioni possono essere conservati a 4 ° C in una vaschetta Coplin contenente PBS. </li></ol> 3. Processazione dei tessuti NOTA: Tutte le fasi tranne 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 sono svolte in vaschette Coplin con 80 ml di soluzione sotto la cappa chimica a temperatura ambiente. I vetrini vengono trasferiti con un piatto-punta pinze. <ol><li> Tissue chiarimenti efissazione: <ol><li> Incubare 5 min in metanolo. </li><li> Incubare 5 min in etanolo. </li><li> Incubare 30 min in etanolo: xilene (1:1). </li><li> Incubare 5 min in etanolo. </li><li> Incubare 5 min in metanolo. </li><li> Incubare 15 min in metanolo e PBT (1:1), integrato con 2,5% di formaldeide. </li><li> Sciacquare 2 x 10 min in PBT. In questa fase, i vetrini possono essere conservati per una notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> Digestione della parete cellulare: <ol><li> Scongelare una aliquota della miscela di digestione parete cellulare su ghiaccio. </li><li> Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare l&#39;eccesso di liquido ponendolo verticalmente su un tovagliolo di carta. </li><li> Aggiungere 100 ml di parete cellulare mix digestione sopra il pad acrilamide e coprire con un coprioggetto mm 23 x 46. Ripetere l&#39;operazione per le altre diapositive. Incubare per 2 ore a 37 ° C in una camera umida (descritto in Materiali). </li><li> Lavare il slides 2 x 5 minuti in PBT. </li></ol></li><li> RNase A Trattamento: <ol><li> Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare the l&#39;eccesso di liquido come prima. </li><li> Incubare il vetrino con 100 ml di RNAseA a 100 pg / ml in PBS con 1% Tween-20 per 1 ora a 37 ° C in una camera umida. </li><li> Lavare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT. </li></ol></li><li> Post-fissazione e permeabilizzazione: <ol><li> Post-fix per 20 minuti in appena fatto PBT-F. </li><li> Sciacquare i vetrini per 10 minuti in PBT. </li><li> Permeabilize per 2 h in PBS con 2% di Tween-20 a 4 ° C. </li><li> Sciacquare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT. </li></ol></li></ol> 4. Immunostaining NOTA: Per questo passaggio, la concentrazione ottimale dell&#39;anticorpo primario deve essere testato utilizzando diverse diluizioni (1:200, 1:500, 1:1000) degli anticorpi. <ol><li> Incubare il vetrino con 100 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS con 0,2% di Tween-20 per 12-24 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini in PBT per 2-4 ore a temperatura ambiente sotto leggera agitazione. </li><li> Applicare il1:200 anticorpo secondario in PBS + 0,2% Tween-20 per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini in PBT per 1 ora a temperatura ambiente sotto leggera agitazione. </li><li> Controcolorare con 10 ug / ml di ioduro di propidio in PBS per 15 minuti, quindi risciacquare 15 min in PBS sotto leggera agitazione, a temperatura ambiente. </li><li> Mount anti-fading liquido di montaggio integrato con 10 mg / ml ioduro di propidio. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire per 1 ora prima di acquisire le immagini da CLSM. </li></ol> 5. Imaging quantitativa <ol><li> Acquisizione delle immagini: <ol><li> Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando CLSM, preferibilmente utilizzando una modalità di scansione di risonanza, che permette una migliore conservazione dei segnali fluorescenti su immagini prolungata 23, e un obiettivo ad immersione 63X glicerolo. </li><li> Testare i parametri di acquisizione come l&#39;intensità del laser, guadagno, pinhole, dimensione voxel e fattore di zoom all&#39;inizio dell&#39;esperimento definire una procedura di acquisizione standard da seguire rigorosamente tuttatutte le diapositive per le misure quantitative coerenti. </li><li> Verificare l&#39;assenza di cross-talk tra fluorocromi. Se presente, impostare una scansione sequenziale. Acquisire le immagini della trasmissione separatamente e non contemporaneamente. </li><li> Eseguire seriale, l&#39;acquisizione di immagini tridimensionali con la massima risoluzione possibile nelle dimensioni X e Y e con 2x oversampling nella dimensione z (regola di Nyquist). </li></ol></li><li> Elaborazione delle immagini: <ol><li> Ricostruire le immagini in serie in tre dimensioni utilizzando il software fonte commerciale o aperto. </li><li> Definire superfici di contorno attorno a ciascun nucleo (o cella) di interesse in 3D. </li><li> Quantificare fluorescenza in ciascun canale come la somma di intensità dei pixel in ciascun oggetto. </li><li> Esportare i dati in Excel per le analisi statistiche. Normalizzare i segnali di anticorpi contro i segnali di colorazione ad esempio DNA. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li><li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana.">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li><li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis.">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li><li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana.">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li><li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen.">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare.">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li><li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin.">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li><li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development:+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II.">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li><li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy.">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li><li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana.">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li><li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants.">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li><li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum.">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li><li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+(Zea+mays).">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li><li>Niedojad&#322;o, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization.">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li><li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+(Illiciaceae;+Austrobaileyales):+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots,+eumagnoliids,+and+eudicots.">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li><li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis:+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase.">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li><li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells.">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li><li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants.">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li><li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis.">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li><li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li><li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling.">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li><li>Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).</li><li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feulgen+reaction+75+years+on.">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy.">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana.">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In piante da fiore, il lignaggio riproduttivo femminile è circondato da diversi strati di cellule, tra cui il nucellus e tegumenti ovuli, rendendo la colorazione citologica in tutto il montaggio tecnicamente impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo efficace che consente la preparazione e l&#39;elaborazione di un gran numero di ovuli adatti per la colorazione citologica come immunostaining, colorazione DNA e ibridazione in situ fluorescente in tutto il montaggio. Abbiamo utilizzato con successo per l&#39;a...

In piante da fiore, l&#39;istituzione di linee riproduttive inizia con la differenziazione di SMC, MMC femminile e cellula madre microspora maschile. Il MMC sviluppa da una cellula nucellare sub-epidermica sulla punta distale del primordio ovulo, e la cellula madre microspore sviluppa dal tessuto sporigeni nel locule antera, che si trovano in profondità all&#39;interno degli organi floreali 1. SMCs subiscono meiosi per produrre spore aploidi, che poi danno origine ai gametofiti su mitosi. Il gametofito femminile, o embrione sac, costituito da una cellula uovo, una cella centrale, due synergids e tre antipodals. Il gametofito maschile, o il polline, è composto da una cellula vegetativa e due cellule spermatiche. Mentre il gametofito maschile rimane uno studio oggetto d&#39;relativamente accessibile, il gametofito femminile è incorporato all&#39;interno dell&#39;ovulo, si racchiuso nel carpello fiore, e pone quindi sfide specifiche per analisi molecolari e citologici. Recentemente, tuttavia, laser assistitamicrodissezione ha offerto una soluzione elegante che permette trascrittomica analizza in MMC e cellule gametofitici femminili 2-4. In aggiunta l&#39;espressione del gene candidato analisi, ad esempio utilizzando RNA ibridazione in situ o giornalista test genetici, analisi citologiche consente indagare le dinamiche di componenti cellulari endogeni mediante specifica colorazione cellulare diretto o indiretto immunoistochimica. In particolare, la colorazione citogenetica utilizzando FISH e la colorazione del DNA, insieme con immunocolorazione delle modificazioni della cromatina o componenti della cromatina sono approcci centrali di chiarire la dinamica della cromatina e l&#39;organizzazione nucleare in Arabidopsis 5. In genere, la meiosi comporta dinamiche cromosomiche specifiche, che è stato ben studiato in pianta maschio meiocytes 6,7; ulteriormente su larga scala, specifica delle cellule cromatina riorganizzazione, probabilmente riflettendo riprogrammazione epigenetica dinamico è stato descritto durante lo sviluppo del polline 8-10. Per contro, a causaalla relativa inaccessibilità della meiocyte femmina e gametofito, queste indagini rimangono tecnicamente difficile da applicare, e spesso richiedono dissezione sezionamento o manuale e digestione enzimatica (vedi sotto). Inoltre, la prevalente mancanza di chiarezza ottica in tutto il monte è un ostacolo alla imaging ad alta risoluzione delle cellule riproduttive in ovuli intatti. Un metodo classico per l&#39;analisi citologica di organizzazione cromosoma in ovuli interi montaggio utilizza la colorazione del Feulgen 11-13. Si tratta di idrolisi acida (con acido ipocloroso) del DNA che provoca la denaturazione delle proteine ​​e provoca la distruzione della struttura della cromatina così. In alternativa, l&#39;organizzazione dei cromosomi in meiocytes femminili e cellule gametofitici può essere osservata con colorazione DAPI e immunoistochimica su sezioni semi-sottili o sacche di embrioni sezionati e MMC (per esempio vedi 14-18). Chiaramente, però, la dissezione manuale e sezionamento possono essere laborioso eostacola l&#39;analisi qualitativa e quantitativa di un gran numero di epitopi cromatina. Qui forniamo un protocollo efficiente per preparare un gran numero di ovuli Arabidopsis adatti per una varietà di valle colorazione citologica in tutto il montaggio. In breve, boccioli di fiori sono incubati in una soluzione di fissativo, filari di ovuli sono sezionati dal carpello e incorporate in acrilammide sulla trasparenza come fatto per il polline meiocytes 19,20. Gli ovuli incorporati sono ulteriormente cancellate e fissate in metanolo, etanolo, e xilene prima digestione parete cellulare e permeabilizzazione. Eventuali variazioni di questi passaggi sono discussi. I campioni possono quindi essere utilizzate per la colorazione del DNA, immunoistochimica e FISH. La modalità di preparazione è efficiente e consente parallelo sperimentale set-up (fino a 16 vetrini possono essere preparati in un giorno per l&#39;analisi a valle differente). I trattamenti descritti permettono di segnali omogenei in tutto-mount e istologici, cellulari ben conservati,e l&#39;organizzazione nucleare in cellule riproduttive e cellule nucellare circostanti che beneficiano confronti qualitativi e quantitativi tra i tipi di cellule. Calibrato, a base di CLSM imaging ad alta risoluzione seguita da ricostruzione 3-dimensionale consente misurazioni quantitative significative di segnali fluorescenti. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per analizzare le dinamiche della cromatina in MMC differenziare 21 e in via di sviluppo gametofito femminile 22; Vi presentiamo qui i risultati rappresentativi di analisi heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP immunostaining e FISH in tutto il montaggio ovuli. Siamo inoltre convinti che il nostro protocollo sarà adatto per altri tessuti vegetali e specie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="993">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"><a name="RANGE!A1:D39">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:481px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Solutions</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BVO Fixation Buffer (based on32)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBS, 0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBT-F</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">1&#215; PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">30% acrylamide:bisacrylamide&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1&#215; PBS (prepare 10ml, store at 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">200mL&#160; 5% acrylamide mix in PBS&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1&#215; PBS (make fresh from 30% stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% ammoniumpersulfte&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% sodium sulfite&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell wall enzyme mix</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents and Materials</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5879</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Amaresco</td>
			<td>0497</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Schaurlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4436.1</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1794</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Driselase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8037</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pectolyase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5936</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4378</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3553</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bisacrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2022</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammoniumpersulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9164</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium sulfite</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71988</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-473</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-448</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11008</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProlongGold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td style="width:481px;">toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109169001</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coplin jar</td>
			<td>Huber &#38; CO</td>
			<td>10.055</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00-0</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Moist chamber</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;">A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slide</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td style="width:481px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FISH Tag DNA KIt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F32947</td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFP booster</td>
			<td style="width:135px;">Chromotek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for quantitative, single-cell analysis of chromatin modification and nuclear architecture in whole-mount ovules in arabidopsis

In piante da fiore, la transizione destino delle cellule somatiche-to-riproduttiva è segnato dalla specificazione delle cellule madri spore (SMC) in organi floreali della pianta adulta. La femmina SMC (cellula madre megaspore, MMC) differenzia nel primordio ovulo e subisce meiosi. Il megaspore haploid selezionato poi subisce mitosi per formare il gametofito multicellulare femminile, che darà origine ai gameti, la cellula uovo e la cellula centrale, insieme a cellule accessorie. L&#39;accessibilità limitata della MMC, meiocyte e gametofito femminile all&#39;interno dell&#39;ovulo è tecnicamente impegnativo per citologica e citogenetica analisi a livello di singola cellula. In particolare, immunorivelazione diretta o indiretta di epitopi cellulari o nucleari è compromessa dalla scarsa penetrazione dei reagenti all&#39;interno della cellula vegetale e di imaging singola cellula è locato dalla mancanza di chiarezza ottica in tutto il montaggio tessuti. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace per analizzare i Nuclorganizzazione orecchio e la modifica della cromatina ad alta risoluzione della singola cella in tutto il montaggio ovuli di Arabidopsis embedded. Si basa sulla dissezione e l&#39;incorporamento di ovuli fissati in uno strato sottile di gel di acrilammide su un vetrino microscopico. Gli ovuli incorporati vengono sottoposti a trattamenti chimici ed enzimatici volti a migliorare la chiarezza tessuto e permeabilità ai reagenti di immunoistochimica. Tali trattamenti conservano organizzazione, DNA e proteine ​​epitopi cellulari e cromatina. I campioni possono essere utilizzati per diverse analisi citologiche a valle, cromatina immunostaining, ibridazione in situ fluorescente (FISH), e colorazione del DNA per l&#39;analisi eterocromatina. Microscopio confocale a scansione laser (CLSM) delle immagini, ad alta risoluzione, seguita dalla ricostruzione 3D permette misurazioni quantitative a risoluzione singola cellula.

Forniamo un protocollo robusto per la preparazione su larga scala e l&#39;elaborazione di ovuli di Arabidopsis adatti per la colorazione citologica in tutto-mount. Grazie alla incorporamento, gli ovuli conservano una struttura 3-dimensionale (Figura 3). Inoltre, il trattamento dei tessuti con precisazioni ottico consente strutture subcellulari di imaging ad alta risoluzione. Figura 4 mostra la colorazione del DNA in tutto il montaggio primordi dell&#39;ovulo dove heterochromati...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis at JoVE.com

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

13.1K Views.  University of Zürich.  Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare. 

Video: An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis