وتسبب الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية خللاً في المناعة حتى لدى الأفراد الذين يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات العكوسة دون وجود فيروس يمكن اكتشافه. هذه الطريقة تسمح لدراسة وظيفة أحادية التي هي المنظمين الرئيسية للاستجابة المناعية. لقد قمنا بتحسين هذه التقنية لعزلة وثقافة وtransfection من أحاديات الإنسان الأولية.
نحن نستخدم هذه الطريقة لفهم الآليات الجزيئية للخلل المناعي لدى الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن يمكن تطبيقها على أي دراسات مناعية أخرى تتضمن الخلايا الأحادية. إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي تعمل فيها مع الدم البشري، فتذكر أن تتبع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة وأن تعامل جميع العينات على أنها مواد معدية. بعد جمع 40 ملليلتر من الدم البشري الكامل الطازج في أربعة 10 ملليلتر EDTA أنابيب فراغ، واستخدام تقنية معقمة لنقل كل من الدم في أنبوب بروبيلين مخروطي 50 ملليلتر واحد في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
بعد تعليمات الشركة المصنعة من مجموعة العزل أحادية الإنسان المحدد، إضافة ملليلترين من كوكتيل العزل أحادية من عدة إلى أنبوب الدم ودوامة الخرز المغناطيسي من عدة لمدة 30 ثانية. إضافة ملليلترين من الخرز إلى الدم واستخدام ماصة المصلية 25 ملليلتر لخلط بعناية الخرز مع الدم. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتقسيم الدم بالتساوي بين أربعة أنابيب 50 ملليلتر وإضافة 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم تكملها EDTA ملليمولار واحد إلى كل أنبوب.
تخلط مرة أخرى مع ماصة بلاستيكية 25 ملليلتر المصلية ووضع الأنابيب في حاملات المغناطيسي. بعد 10 دقائق، واستخدام ماصة لرسم محتويات من وسط كل أنبوب مع الحرص على عدم التعرق أكثر من ملليلتر من خلايا الدم الحمراء والاستغناء عن محتويات الأنبوب في واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. أضف 500 ميكرولترات إضافية من الخرز المغناطيسي الدوامة إلى كل أنبوب وخلط بلطف حل الخلية.
ضع الأنابيب مرة أخرى في الاقحام المغناطيسي لمدة خمس دقائق قبل نقل المحتويات بعناية من وسط كل أنبوب إلى واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. عندما تم نقل جميع تعليق الخلية، ضع كل أنبوب 50 ملليلتر جديد في حاملات المغناطيس لمدة خمس دقائق قبل نقل محتويات الأنبوب بعناية إلى مجموعة ثالثة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق جميع الكريات الخلية الأربعة في ما مجموعه 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة للعد.
بعد عد, resuspend أحادية معزولة في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من 37 درجة مئوية الدم 1640 المتوسطة خالية من المصل تكملها المضادات الحيوية وطبقة ملليلتر واحد من الخلايا resuspended في 35 ملليمتر لوحات في مجلس الوزراء السلامة الحيوية. ثم ضع اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بالتمسك بأسفل البئر. إلى رئيس ل الضامة مع نمط ظاهري يشبه M1 ، إضافة 100 ميكرولتر من مصل البقر الجنينية التي تحتوي على 25 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى كل لوحة.
إلى رئيس للضامة مع نمط ظاهري يشبه M2 ، أضف 100 ميكرولتر من الأبقار الجنينية التي تحتوي على 50 نانوغرام لكل ملليلتر من M-CSF إلى كل لوحة. بالنسبة لtransfection أحادية مع ميكرورنا تقليد، مثبطات، أو الحمض النووي الريبي التدخلي الصغيرة، بعد بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة transfection، تمييع الحمض النووي الريبي المختار في المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي من 1.83 ميكرومولار في 10 ميكرولترات من تقليد المخفف أو لكل مثبطات من مرة واحدة 10 إلى حجم الخلايا الخامسة. لإعداد كاشف transfection ، إضافة ميكرولتر واحد من البوليمر المقدمة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، وعلى الفور إضافة 90 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقدمة عدة للحصول على ما مجموعه 91 ميكرولترات من كاشف لكل transfection.
دوامة ريجنت لمدة ثلاث إلى خمس ثوان والماصات 90 ميكرولترات من حل transfection في أنبوب يحتوي على 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المخفف. بعد خلط لطيف، احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 100 ميكرولترات من مجمع transfection إلى بئر واحد من الخلايا. بعد أربع ساعات في 37 درجة مئوية، استبدال المتوسطة مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل تحتوي على عامل النمو المناسب.
في اليوم السادس من الثقافة، استبدل المستفحلين في الثقافة من ثقافات M1 بثلاثة ملليلترات متوسطة مكمّلة بمصل الأبقار الجنينية، والمضادات الحيوية، وليبوبوليكساكريد، وترفيرفيرون غاما واستبدلوا المستفحلين من ثقافات M2 بمصل بوفين الجنيني، والمضادات الحيوية، و M-CSF، وinterleukin-4. بعد 24 ساعة من الثقافة، اغسل كل لوحة من الضامة المنشطة مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. بالنسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبروتين، فإن الخلايا المرفقة مباشرة في اللوحات تسمح بجمع محتويات الخلايا المفرج عنها لتحليلها.
لتحليل تدفق cytometric، فصل الخلايا مع اثنين من ملليمولار EDTA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية قبل كشط الخلايا بلطف من قيعان لوحة للسماح جمعها في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لتحليلها. هنا يتم عرض الرسوم البيانية التمثيلية لـ M1-تنشيط التحكم والخلايا المشتقة من المريض مع زيادة مستويات الخلايا CD80 و CD83-تنشيط M2 مع زيادة مستويات CD163 و CD209 بالمقارنة مع الخلايا T0 غير المنشط. ومن المثير للاهتمام أن CD80 و CD83 يبدو أن أكثر تعبيراً في الخلايا المشتقة من التحكم مقارنة بالخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية.
إن نقل الخلايا الأحادية التي تم جمعها حديثًا مع ميكرورنا المُعَدَّد من الأشعة تحت الحمراء المُشوشة التي تحمل اسم ميكرورنا يؤدي إلى زيادة كفاءة 90٪ من عمليات التنقّل على النحو الذي تحدده عملية استئصال الخلايا المتدفقة والمجهر المجهري. بالإضافة إلى ذلك، لا يقلل نقل الدم بشكل كبير من صلاحية الخلايا المشتقة من المريض أو السيطرة عليها بغض النظر عن مرحلة نضوج الخلايا أو ظروف النقل. ينتج عن عملية نقل الدرن تنظيمًا هابطًا فعالًا للجين المستهدف عند التهجين مع الحمض النووي الريبي الصغير المحدد في اليوم الأول واليوم الرابع بعد العزل.
وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا التي تُصاب بـ "ميكرورنا" زيادة في التعبير عن ميكرورنا بمقدار 48 إلى 72 ضعفاً على الخلايا غير المنقولة بينما لا تظهر جميع عناصر التحكم في العدوى تغييرات ملموسة. عدد الخلايا مطلية أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. نوصي بمليون خلية لكل طبق 35 ملليمتر.
سوف الطلاء في المتوسطة خالية من المصل أيضا إلى حد كبير تحسين مرفق الخلية. يمكن علاج الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة بالسيتوكينات أو عوامل النمو لدراسة الاستجابات التفاضلية في المرضى الذين ينهمون وضوابط صحية.
