Os autores gostariam de agradecer a senhora Meike Schaffrinski para ela sempre excelente assistência técnica durante os últimos anos. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Alemanha (DFG), dentro do grupo de investigação conjunto 942 (FOR942) e pelo Programa de Pesquisa da Faculdade de Medicina, Georg-August-Universidade de Göttingen.

1 Preparação de estéril AB Soro Humano <ol><li> Colete 4-5 sacos de plasma fresco congelado (PFC). Armazenar os sacos a -20 ° C até sacos suficientes foram recolhidos. </li><li> Descongelar sacos e incubar durante 30 min a 56 ° C em um banho de água para inactivar o complemento e remover fibrina. </li><li> Desinfectar completamente a parte externa dos sacos e transferir o plasma para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 3000 xg por 15 minutos à temperatura ambiente para se livrar de precipitados e plaquetas residuais. </li><li> Piscina durante todo o sobrenadante e descartar os pellets. </li><li> As amostras de soro da alíquota em tubos de 15 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de soro AB humano normal inactivado pelo calor pode ser usado. </li></ol> 2 Isolamento de monócitos Para facilitar o balanceamento da centrífuga, é recomendado para processar duas crostas inflamatórias em paralelo. No entanto, tome care a utilização de materiais diferentes para cada dador e para não misturar as células. No caso de cremes leucocitários não pode ser facilmente obtido, de 400 ml de sangue periférico heparinizado podem ser utilizados em vez disso. <ol><li> Desinfectar cuidadosamente os sacos de plástico contendo os casacos de Buffy e transferir o conteúdo de cada creme leucocitário para dois tubos de 50 ml. </li><li> Para cada buffy coat encher três tubos de 50 ml com 15 ml de solução de Ficoll (1,077 g / ml). O Ficoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Camada de 30-35 ml de sangue de creme leucocitário no topo da solução de Ficoll para o primeiro gradiente de densidade. Tenha o cuidado de fazer isso devagar e com cuidado, a fim de evitar a mistura de ambas as camadas. </li><li> Centrifugar a 400 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 40 ml no total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Sobrenadante aspirado e lave o peletizado de novo com 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada conjunto de dadores, as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 sem vermelho de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar a solução de Percoll iso-osmótico do segundo gradiente de densidade: Para misturar dois doadores de 23,13 ml de solução de Percoll (densidade: 1,131 g / ml) num tubo de 50 ml com 1,87 ml de PBS 10 vezes. Em seguida, transferir 23 mL desta solução para um novo tubo de 50 ml e adicionar 27 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS para obter uma solução iso-osmótica de Percoll 46%. O Percoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Para cada transferência de dador 25 ml de solução de Percoll preparada em um tubo de 50 ml e a camada de solução de PBMC preparado em 2.9) na parte superior da solução de Percoll. Tenha o cuidado de fazer isso muito lentamente umd cuidadosamente, ambas as camadas tendem a misture facilmente. Se isso for feito correctamente as duas fases podem distinguir-se, devido à sua diferença de cor. </li><li> Centrifuga-se a 550 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de monócitos, que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 50 ml no total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. Diferenciação de monócitos para macrófagos <ol><li> Determinar o número de monócitos isolados em uma diluição de 1:10 em azul tripano. Só contam os grandes células, de forma irregular, muitas vezes, que são os monócitos. Não conte as células menores, de formato circular, que são linfócitos. NOTA: números de monócitos não tem que ser determinado com precisão muito porque eles só dão uma dica sobre quantos e quais FEP teflon sacos (pequenos ou grandes) devem ser utilizados para a diferenciação das células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monócitos de um doador, semear as células em um grande saco de cultura de células FEP teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 174 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monócitos de um doador, semear as células em um pequeno saco de cultura de células revestidas de Teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 28,5 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 30 ml). NOTA: Se, por exemplo, 8,0 x 10 7 monócitos são obtidos, recomendamos para semeá-los em twO menor volume de sacos com 4,0 x 10 7 células cada. Em vez de M-CSF, monócitos, alternativamente, podem ser diferenciados com o factor estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) com a mesma concentração (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Adicionar a suspensão de células (20 ml) para a forma preparada e misturar cuidadosamente. Se dois sacos são preparados a partir de um dador, adicionar 20 mL de meio RPMI-1640 à suspensão de células e em seguida, adicionar metade da suspensão para cada preparação de meio. </li><li> Opcional: Para determinar se a preparação dos monócitos se manteve estéril, rasgar uma gota da suspensão de células numa placa de agar de sangue e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Aperte a bainha de um 50 ml PERFUSOR seringa no plugue do saco de cultura de células FEP teflon e preenchê-lo com a suspensão de células preparado. </li><li> Desligue a seringa e empurrar o ar restante para fora do saco. Feche o saco com um cone de fecho. </li><li> Incubar as bolsas durante 6-7 dias a 3776; C com 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Colheita <ol><li> Coloque as Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células com os macrófagos diferenciados em gelo durante pelo menos 1 hora para facilitar a separação das células (uma incubação de até 3 horas é possível). Assegure-se que toda a superfície do saco é coberto com gelo. </li><li> Puxe o saco com pressão mínima de 10x sobre a borda de uma mesa / tabuleiro. </li><li> Desinfectar cuidadosamente a parte exterior do saco e remover o cone de fecho. </li><li> Apertar uma seringa de 50 ml com o tampão do saco, remover a suspensão de células, e transferi-lo para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente para girar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e reunir os peletes a partir de um saco, em 10 ml de RPMI-1640 + FCS a 10% no total. </li><li> Determinar o número de células num hemocitómetro (1: 4-1: 10 diluição em azul tripano). Só contam os grandes células redondas. Nota: Após a diferenciação dos macrófagos nos sacos de Teflon FEP-revestidas, pode haver células residuais, por exemplo, linfócitos, dependendo do dador e sobre a qualidade do isolamento de monócitos. </li><li> Para reutilizar os sacos de Teflon FEP-revestidos, lave-se duas vezes com etanol a 70% para remover células residuais. Encha-os com etanol 50 ml 70% e incubar durante a noite. Lavam-se as bolsas 3x com PBS estéril, embrulhá-los em papel de esterilização, e esterilizar em autoclave, utilizando procedimentos padrão. NOTA: Os sacos de cultura de células pode ser reutilizado várias vezes sem perda de rendimentos de macrófagos. No entanto, decidimos descartar os sacos após 10 usa antes de começar a vazar. </li><li> Para subseqüentes macrófagos experimentos de cultura em RPMI-1640 + 10% FCS. Se forem necessárias concentrações mais baixas de soro, a cultura em meio RPMI-1640 com 1% de FCS, também é possível. Semente e células incubar por 3-4 horas. Após este período, notar que os macrófagos aderem à superfície do prato de cultura de células, enquantoquaisquer células contaminantes (isto é, eritrócitos, linfócitos e células dendríticas) ficar em suspensão. Lavar as células, pelo menos, duas vezes com PBS para remover as células não aderentes. </li><li> Para retirar macrófagos cultivados a partir da placa de cultura de células para novas experiências, raspe-os cuidadosamente para fora da superfície. Alternativamente, incubar os pratos durante 20 minutos em gelo, aspirar o meio de cultura, e adicionar tampão de dissociação de células livres de enzima de 1 ml. Após 5 minutos de incubação a 37 ° C, adicionar 4 ml de PBS, e separar as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 3 minutos. </li></ol>

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	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar, como não existe qualquer conflito de interesses.

Os macrófagos são células efetoras importantes do sistema imune inato e exibir funções importantes na imunomodulação, apresentação de antígenos e homeostase do tecido. Devido à sua notável plasticidade, eles são capazes de responder a estímulos de diferentes com que as alterações de fenótipo. No entanto, até agora um monte de dados sobre macrófagos polarização são obtidas no sistema murino, embora existam relatos que mostram que apenas cerca de 50% dos marcadores de macrófagos de polarização pode ser diretamente traduzido do mouse para humano 16. Por conseguinte, apresenta-se aqui um método para se obter os macrófagos humanos primários, em número e pureza suficiente sem a necessidade de materiais dispendiosos, como por exemplo, contas magnéticas MACS e um dispositivo de elutriação por centrifugação contrafluxo. O nosso método baseia-se no isolamento de monócitos a partir de PBMC e sua subsequente diferenciação em macrófagos em FEP Teflon sacos de cultura de células na presença de baixo concentrations de M-CSF 11-13. Enquanto monócitos representam menos de 5 a 10% dos leucócitos do sangue periférico em seres humanos, com a estimulação são recrutados para locais periféricos onde se diferenciam em macrófagos teciduais residentes ou células dendríticas 17. A citocina de M-CSF é importante para a sobrevivência dos monócitos e dirige a sua diferenciação para macrófagos 18,19. Até agora, as concentrações de FEC-M, que foram escolhidos para a diferenciação de monócitos variaram até 100 ng / ml, contudo, no nosso protocolo que é capaz de obter um número suficiente de macrófagos maduros com uma concentração de M-CSF de apenas 2,5 ng / ml 12 , 20. Além disso, as células são cultivadas em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células que facilitam o desprendimento dos macrófagos e a sua sementeira subsequente em números de células definidas. Uma vez que os sacos podem ser reutilizados várias vezes, o que diminui ainda mais os custos para o processo de isolamento. Os macrófagos obtidos por este procedimentosão altamente positivo para CD45, CD14, CD11b, CD11c e mostrar a expressão do CD206 receptor de manose que defende uma população de puros, macrófagos maduros 21,22. Especialmente alta expressão de CD14 é típico para macrófagos diferenciados na presença de M-CSF 23. Após sementeira das células, eles exibem uma adesão rápida a superfícies de plástico, com algumas células mostrando uma morfologia fusiforme típico, enquanto que outros apresentam um fenótipo de ovo frito. Isto está de acordo com as observações de outros autores 18,22,24. Foi relatado que a diferenciação de monócitos na presença de M-CSF conduz a macrófagos M2-polarizados 16,25. No entanto, os macrófagos isolados pelo nosso protocolo ainda são capazes de responder a uma grande variedade de estímulos, incluindo a exposição de microvesículas derivadas de células tumorais e de co-cultura com células tumorais 26,27 ou exposição ao LPS aos quais eles reagem com a indução de pró genes inflamatórios tais como IL-1 &amp;# 946 ;, TNFa, Wnt5a, ou várias metaloproteinases da matriz, que são consideradas típicas de macrófagos M1-polarizados 3,5,28. Em conclusão, o isolamento de monócitos por centrifugação em gradiente de densidade dupla e subsequente diferenciação em direcção macrófagos em Teflon FEP-revestidas de cultura de células resulta em sacos de um elevado número de macrófagos, sem a necessidade de procedimentos tecnicamente difíceis ou caros. Os macrófagos obtidos podem ser utilizados para posterior análise que vão desde a ativação clássica através de LPS para a co-cultura com células tumorais.

As células da linhagem monocítica e seus terminalmente diferenciadas derivativos - macrófagos - exibem uma plasticidade impressionante no que diz respeito à sua função biológica, levando ao seu envolvimento em diversos processos tais como desenvolvimento, reparação tecidual e imunidade 1. O último é devido à sua capacidade fagocítica e apresentadora de antígeno que coloca macrófagos no cruzamento entre a resposta imune inata e adaptativa 2. No entanto, a sua capacidade para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, e outras moléculas de sinalização 1, não só aumenta a sua função de imunomoduladores, mas também serve como uma base para as suas funções adicionais. As tentativas para espelhar essas etapas de ativação diversas no contexto de condições mediadas não-microbianos resultaram nas categorias M1 e M2 3. Embora esta classificação não é completo, permite um conhecimento básico da biologia dos macrófagos. Devido a estas capacidades multifacetadas ele vem como nenhuma surpresa que os macrófagos são associados a muitas condições que de alguma forma envolvem remodelação do tecido ou inflamação. Ao lado de seu papel fundamental no reconhecimento e liberação de patógenos invasores 4-6, os macrófagos têm cada vez mais entram em foco na aterosclerose, fibrose, obesidade e câncer de 7-10. Um método reprodutível para a geração de macrófagos humanos é, portanto, crucial para a compreensão dessas patologias. Aqui é apresentado um método com base no isolamento de monócitos humanos a partir de sangue periférico de dadores saudáveis, por uma técnica de dupla centrifugação de gradiente de densidade, tal como descrito previamente 11. De forma a facilitar a diferenciação no sentido macrófagos, as células monocíticas isolados são incubados na presença de baixas concentrações de FEC-M e soro humano normal a 12. Para facilitar ainda mais o manuseamento e a colheita de células, a diferenciação é realizada no gás de FEP permeávelSacos de cultura de células revestidas com teflon com uma superfície hidrofóbica 12-15. Os macrófagos que descansam resultantes podem ser submetidas a uma vasta gama de ensaios uma vez que ainda são capazes de responder a qualquer uma forma M1 ou M2-like. Métodos alternativos de isolamento de monócitos e subsequente diferenciação, tais como células ativadas magnética triagem (MACS) ou em contra-decantação centrífuga (CCE) tem algumas limitações em relação ao rendimento, custo e tempo necessário. O protocolo aqui descrito oferece a vantagem de que pode ser realizada com equipamento de laboratório padrão, sem a necessidade de reagentes especiais (por exemplo, contas magnéticas MACS) ou dispositivos (por exemplo, aparelhos CCE) e permite que o processamento de grandes quantidades de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Macrófagos humanos estão envolvidos em uma infinidade de processos patológicos que vão desde doenças infecciosas ao câncer. Assim, eles representam uma ferramenta valiosa para compreender os mecanismos subjacentes a estas doenças. Por isso, apresentam um protocolo simples para o isolamento de monócitos humanos a partir de crostas inflamatórias, seguido por um processo de diferenciação, que resulta em rendimentos elevados de macrófagos. A técnica baseia-se principalmente em comumente disponíveis equipamentos de laboratório e, portanto, fornece uma alternativa de custo e tempo efetivo de obter grandes quantidades de macrófagos humanos. Resumidamente, crostas inflamatórias a partir de dadores de sangue saudáveis ​​são submetidas a uma centrifugação de gradiente de densidade dupla para a colheita a partir de monócitos do sangue periférico. Estes monócitos são então cultivadas em fluorados de etileno propileno (FEP) revestido com Teflon sacos de cultura de células na presença de factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF). Os macrófagos diferenciados podem ser facilmente colhidas e usadas para estudos posteriores e funcional quantodiz. Métodos importantes para o controle de qualidade e validação das etapas de isolamento e diferenciação será destacado dentro do protocolo. Em resumo, o protocolo aqui descrito permite aos cientistas rotina e de forma reprodutível isolar macrófagos humanos, sem a necessidade de ferramentas de custo intensivo. Além disso, os modelos de doença pode ser estudado num sistema humano singeneico contornar a utilização de macrófagos de murino.

A primeira centrifugação de gradiente de densidade usando Ficoll produz uma interfase branca contendo as PBMC (Figura 1A), ou seja, os linfócitos e monócitos. Isso pode ser confirmado através de uma coloração May-Gruenwald (Figuras 1B e C) das células coletadas, que mostra tanto um elevado rácio núcleo / citoplasma (típico de linfócitos) e bean- ou núcleos em forma de anel (típica de monócitos). Quando estas células são, então, carregados num gradiente de Percoll utilizando segunda densidade, os monócitos pode ser ainda separado dos linfócitos e novamente aparece como uma interfase branca (Figuras 1E-F). Para cada buffy coat em gradiente de densidade dupla centrifugação descrito rotineiramente produz 150 ± 40 x 10 6 de monócitos, que podem ser diferenciados para 70 ± 30 x 10 6 de macrófagos (Figura 2) por buffy coat. O rendimento médio de macrófagos20 preparações independentes foi de 47 ± 14% do total de monócitos isolados. Após a centrifugação de gradiente de Percoll, ainda pode haver algumas células não monociticas residuais presentes na preparação, que é dependente do dador de sangue, assim como na precisão do processo de isolamento. No entanto, após a fase de diferenciação de 6-7 dias, a preparação é constituído principalmente por macrófagos maduros (Figura 3), que pode ser ainda mais enriquecido, devido à sua aderência a superfícies de plástico, uma característica que não é partilhada por as células contaminantes aleatórios (Figuras 4A e B). Uma vez banhado, a maioria dos macrófagos mostram uma morfologia clássica &quot;ovo frito&quot;, enquanto também existem células com uma esticada fenótipo fusiforme (Figuras 4C e D). Isto reflecte-se a sua distribuição F-actina dentro dos clusters de citoplasma e de adesão. As células diferenciadassão caracterizados pela expressão de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manose), CD11b e CD11c, que são marcadores para macrófagos maduros normais (Figura 5). A presença de CD11b argumenta contra uma diferenciação predominantemente dendrítica, que é suportada pelo facto de que as células são negativas para CD209 o marcador de células dendríticas (DC-SIGN). Após o processo de diferenciação, as células permanecem funcionalmente e metabolicamente activa de cerca de 5-7 dias (Figura 6), uma vez que podem ser visualizadas através de calceina AM de coloração e a sua capacidade para assumir vesículas extracelulares derramado a partir de células tumorais. Além disso, as células podem ainda ser activado, como mostrado, por exemplo, para a estimulação com lipopolissacarídeo (LPS), que resulta na expressão de vários genes pró-inflamatórios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Aparência e composição do PBMC- e monócitos-camada após a centrifugação de gradiente de densidade dupla. Fotografia que ilustra (A) a banda de PBMC após o gradiente de Ficoll e (D) a-fase de monócitos após a centrifugação de Percoll iso-osmótico. Colorações Maio-Gruenwald de preparações de citospina do (B, C) ​​e a fracção de PBMC remanescentes (E, F), os monócitos. Barra de escala = 200 um em B e E, = 50 um em C e F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2 Rendimento de monócitos e macrófagos. Contagens celulares representativas dos monócitos e macrófagos isolados de 20 buffy coat preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Micrografias e medições do tamanho das células de monócitos e macrófagos. Microscopia de contraste de fase de suspensão de células monocíticas, antes (A) e após (B) a diferenciação de macrófagos. Correspondendo histogramas do tamanho das células de monócitos (C) e os macrófagos (D). Barra de escala = 100 pm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4 Morfologia e organização do citoesqueleto de macrófagos aderentes. Microscopia de contraste de fase de macrófagos aderentes antes (A) e após (B) A remoção de não-adherenAs células t. (C, D) faloidina-TRITC coloração de actina filamentosa em macrófagos aderentes, não-estimuladas. Barra de escala = 100 mm em AC, 20 um em D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Imunofenótipo de macrófagos diferenciados. Análise de citometria de fluxo de macrófagos após 6 dias de diferenciação em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células (indicado em vermelho). Os controles isotipo correspondentes são mostradas em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 6 Captação de microvesículas de células de tumor por macrófagos. Micrografias de macrófagos aderentes após exposição à microvesículas derivadas de células (vermelho fluorescente) PKH26-tumorais marcadas. As imagens são sobrepostas para o correspondente (A) de campo claro ou (B) coloração citosólica com o corante de viabilidade calceína AM. Barras de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 A sobre-regulação de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, e depois de MT1-MMP estimuladormento de macrófagos com LPS (100 ng / ml) durante 24 horas. expressão de genes foi medido por RT-PCR quantitativa a partir de amostras de ARN total (A) e normalizado em HPRT1 e GNB2L1 expressão. Os valores mostrados são as mudanças de dobragem em comparação com o controlo não tratado (média ± DP, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 de indução sob estimulação por LPS foram também confirmadas por meio de ELISA (B) (média ± DP, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K visualizações.  University Medical Center Göttingen.  Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores. 