ونود أن نشيد بالدعم المالي من برنامج فإصابة موناش وكذلك من NHMRC CDF ومنحة مشروع NHMRC. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر سو مي ليم لها اقتراحات بناءة، إدوينا McGlinn لدعمها وفريق موناش Flowcore (ولا سيما آدم Dinsdale) لمساعدتهم في إنتاج الفيديو.

<ol>
	<li>Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotential+embryonic+stem+cells+from+murine+primordial+germ+cells+in+culture.">Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.</a> Cell. 70, 841-847 (1992).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+model+of+Hutchinson+Gilford+Progeria+reveals+vascular+smooth+muscle+and+mesenchymal+stem+cell+defects.">A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects.</a> Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).</li><li>Samavarchi-Tehrani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+a+BMP-driven+mesenchymal-to-epithelial+transition+in+the+initiation+of+somatic+cell+reprogramming.">Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).</li><li>Celi&#224;-Terrassa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+can+suppress+major+attributes+of+human+epithelial+tumor-initiating+cells.">Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).</li><li>Liao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cluster+302&#8211;367+enhances+somatic+cell+reprogramming+by+accelerating+a+mesenchymal-to-epithelial+transition.">MicroRNA cluster 302&#8211;367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).</li><li>Cie&#347;lik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+coordination+of+signaling+pathways+during+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition.</a> Epigenetic., &amp; Chromatin. 6, 1-22 (2013).</li><li>Golipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+transition+in+somatic+cell+reprogramming+requires+regulators+distinct+from+the+pluripotency+network.">A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network.</a> Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+mouse+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+roadmap+of+reprogramming+somatic+cells+into+iPS+cells.">A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells.</a> Cell. 151, 1617-1632 (2012).</li><li>Wright, A. J., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+marker+antigens+in+the+characterization+of+human+embryonic+stem+cells.">Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+coordinated+proteome+dynamics+during+reprogramming+of+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency.</a> Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2009).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, 1145-1148 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells.">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

من أجل إعادة برمجة بنجاح MEFs إلى خلايا الجذع لتنقية وسيطة في إعادة برمجة كمية عالية من الضروري أن يكون على بينة من العوامل التي لها تأثير على الكفاءة بوجه عام. ولا سيما دفعة من FBS تستخدم لتكملة الإعلام الجذع يمكن أن يكون لها تأثير ضار. في التجارب الإيجابية العامة قدمت مع الجذعية الجنينية FBS المؤهلة (ES) الخلية ولكن الاختبار دفعة من الأمصال من مجموعة متنوعة من البائعين قد تحدد بديلا أرخص. وثمة عامل آخر يؤثر على كفاءة إعادة برمجة هي من النمط الجيني MEFs 15،20. على الرغم من MEFs المستمدة من الفئران متخالف (هيت) لكل من OKSM وموضع m2rtTA لا إعادة برمجة، homozygousity في واحد أو كلا مواضع النتائج في إعادة برمجة الكفاءة العالية. في الواقع، MEFs المشتقة من نسل OKSM وm2rtTA الصلبان تظهر زيادة في كفاءة إعادة برمجة بالترتيب التالي (OKSM / m2rtTA): هيت / هيت &lt;وطي / هيت &lt;هيت / وطي &lt;وطي /وطي (يرجى ملاحظة أن الأرقام الواردة في الجدول 1 هي للحيوانات هيت / هيت). بمناسبة نادرة يتم التعرف على الذكور وطي / وطي الحيوان، يمكن تعيين الحريم التزاوج مع الإناث متعددة m2rtTA المباراة. سيتم هيت جميع النسل من هذه الصلبان / وطي لOKSM / m2rtTA مواضع، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، أوصى التنميط الجيني السريع من الفضلات ويتم الحصول على الفضلات أكبر عند استخدام الفئران الأصغر سنا للتربية (6-15 أسابيع من العمر). علاوة على ذلك، أكد استخدام MEFs مرور منخفضة لإعادة برمجة 23. إذا تم اشتقاق MEFs وتوسعت في normoxic حاضنة زراعة الأنسجة نحن نوصي بشدة لاستخدام هذه الخلايا فقط حتى مرور 2. ومع ذلك، إذا المجرب ديه حق الوصول إلى حاضنة انخفاض الأكسجين (5٪ أكسجين) لاشتقاق وتوسيع MEFs، أرقام مرور تصل إلى 3 لا تزال تسفر عن نتائج جيدة 23. في حالة المجرب اجه المشاكل المرتبطة برمجة،<html> كما هو مبين، والتفسيرات الأكثر احتمالا أرقام مرور عالية في وقت بالإضافة دوكس، راثى غير صحيح من الفئران أو استخدام FBS التي لا تساعد في توليد خلايا الجذع. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة لاحظنا أن MEFs لم تكن قادرة على إعادة برمجة حتى في ظل ظروف مثالية. في هذه الحالات تم تحديد عفوية دي نوفو حذف ضمن إطار القراءة المفتوح في m2rtTA باعتبارها السبب الكامن. وقد تم تكييف هذه المنهجية بنجاح لاستخراج SSEA-1 + سيطة عبر عزل الخلايا المغناطيسية (MACS). هناك ميزة زمنية واضحة في استخدام أجهزة ماكينتوش، ومع ذلك، يتم تقليل نقاء SSEA-1 + السكان الخلية إلى 80-90٪، وليس أكثر من 95٪، والتي تبعا لنوع التجربة تتجه الخلايا لمدة قد تشكل مشكلة. وهكذا، وهو خيار هو استخدام MACS لإثراء لSSEA-1 + خلايا تليها FACS لزيادة نقاء و / أو جزء منها الى SSEA-1 + / + Epcam وSSEA-1 + / خلايا Epcam-. &quot;&gt; في حين أن خلايا الجذع التي تنتجها بروتوكول المبين ونموذج الفأر وقد ثبت أن تكون المحفزة والمساهمة بشكل فعال إلى جميع أنسجة حيوانات خيالية 15،20، كان خفض القدرة على إنتاج أجنة مؤلفة بكاملها من هذه الخلايا المحفزة عبر تكامل رباعي الصيغة الصبغية تظاهر 24. وقد تم تحديد أنماط مثيلة الشاذة في الكتلة الجين دلك-Dio3 والسبب الكامن وراء 24. ومع ذلك، فإن إضافة حمض الاسكوربيك في تركيز 50 ميكروغرام / مل إلى وسائل الإعلام خلال إعادة برمجة تكامل رباعي الصيغة الصبغية تنتج خلايا الجذع المختصة 24. يرجى العلم أن الفأر نموذج قابل للبرمجة بديل هندسيا للتعبير عن عوامل إعادة البرمجة في رياضيات الكيمياء مختلفة يمكن أن تنتج خلايا الجذع المختصة رباعي الصيغة الصبغية حتى في غياب العلاج حمض الاسكوربيك 25، ولكن في خلايا أيدينا من هذه السلالة في إعادة برمجة حد كبير انخفاض وتيرة مقارنة إلى هنا استخدام وضع الماوسلتر. المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة تسمح للفصل سيطة الجزء الأكبر من إعادة برمجة الحرارية من السكان، وينبغي أن ينظر إليها على أنها أداة قيمة لتشريح وفهم عملية إعادة البرمجة، وإزالة القيود السابقة من الحاجة إلى استخدام السكان unfractioned عن التنميط (على سبيل المثال، الضوضاء إشارة عالية من الخلايا الحرارية). مزيج الأجسام المضادة الموصوفة هنا يسمح العزلة وسيطة من خلايا فأر في نقاء عالية، ومع ذلك فمن الممكن أن علامات إضافية سطح الخلية سيتم كشف في المستقبل من شأنها أن تسمح للحصول سيطة في أعلى نقاء. يرجى ملاحظة أن SSEA-1 التعبير ليس السمة المميزة للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان وعلى هذا النحو هذا البروتوكول لا يمكن أن تستخدم في إعادة برمجة خلايا المنشأ البشرية. في الختام، وسيطة إعادة برمجة معزولة مرة واحدة مع الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لالتحليلات الجزيئية بما في ذلك التعبير profilinز، لونين مناعي، methylome التحليل، والبروتين المقايسات.

وتستمد الجذعية الجنينية (ES) خلايا من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة مرحلة الأجنة 1. تحت ظروف التربية المناسبة التي تجديد الذات والبقاء المحفزة. في عام 2006 أظهرت ياماناكا وزملاؤه أن الخلايا الناضجة يمكن برمجتها إلى ما يسمى الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا عن طريق التعبير القسري للعوامل النسخ أكتوبر 4، KLF-4، سوكس-2، C-MYC (OKSM) 2. خلايا الجذع، مثل خلايا ES، يمكن أن تؤدي إلى كل أنواع الخلايا في الجسم، ومع ذلك، لأنها خالية من القيود الأخلاقية المحيطة توليد خلايا ES 3. وعلاوة على ذلك، خلايا الجذع تحمل الوعد شخصية الطب التجديدي وعقد إمكانات هائلة لتطبيقات مثل النمذجة المرض والمخدرات في المختبر فحص 4،5. من أجل إعادة برمجة التكنولوجيا لتحقيق هذه الإمكانات، والآلية الأساسية لإعادة برمجة النووية يحتاج إلى أن يفهم بشكل كامل. ومع ذلك، فإن الجهود لتشريح بات برمجةوقد أعاق hway من حقيقة أنه ليس هناك سوى عدد قليل جدا من الخلايا إعادة برمجة (0.1-1٪). وقد تم الإبلاغ عن إعادة برمجة الخلايا الليفية بنجاح للخضوع لسلسلة متميزة من الأحداث بما في ذلك الوسيطة إلى انتقال الظهارية 6-10، وفي المراحل النهائية من إعادة برمجة، وتفعيل الشبكة الأساسية تعدد القدرات الذاتية 11-14. نحن وغيرنا 12،13،15-17 قد حددت مؤخرا مجموعة من علامات سطح الخلية التي تسمح للفصل بين سيطة نادرة من السكان بالجملة الحرارية. إعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) يحدث لها تغيرات في التعبير عن خاصتك-1.2، Ssea1 وEpcam (وغيرهم) خلال عملية إعادة برمجة 2 أسابيع طويلة 15. في وقت مبكر خلال إعادة برمجة مجموعة فرعية من MEFs أسفل تنظيم التعبير عن علامة هوية الخلايا الليفية (خاصتك 1.2) ثم قم بتشغيل التعبير عن تعدد القدرات المرتبطة علامة SSEA-1 12. خلال المراحل النهائية من إعادة برمجة خلايا Ssea1 إيجابية reactivأكل الجينات تعدد القدرات الذاتية مثل أكتوبر 4 10-13،15. ويتميز هذا التحول الأخير على سطح الخلية التعبير كشفها من Epcam (انظر الشكل 1) أو في مرحلة لاحقة PECAM 15. مؤخرا، ذكرت أومالي آخرون استخدام CD44 وiCAM1 كبدائل أو مكملة لدنك 1.2 وSSEA-1 لتحديد سيطة إعادة برمجة. لقد سبق FACS استخراج سيطة إعادة برمجة من يوم 0، 3 يوم، يوم 6 والثقافات ويوم 9 يوم 12 إعادة برمجة، وكذلك من خطوط الخلايا المحفزة أنشئت على أساس هذه العلامات سطح الخلية 15،18. لإعادة برمجة النظام والشروط الموضحة أدناه أظهرنا على مستوى خلية واحدة على الرغم من أن السكان هادئة متجانسة، هناك درجة معينة من عدم التجانس في السكان وسيط تحديدها. تجدر الإشارة إلى أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا داخل هؤلاء السكان هي قادرة على التقدم إلى ستا المقبل منهاجنرال الكتريك لعملية إعادة برمجة وتؤدي إلى مستعمرات الخلايا المحفزة على الكفاءات المختلفة، التي تميزت على نطاق واسع في وقت سابق 15،19. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة إعادة برمجة هؤلاء السكان يعتمدون كذلك على إعادة الطلاء وثقافة الظروف. لزيادة استنساخ التجريبي نستخدم سلالة الماوس قابل للبرمجة التي تم تصميمها للتعبير عن transactivator النسخي (m2rtTA) تحت سيطرة موضع Rosa26 وكاسيت OKSM متعدد المقارين تحت سيطرة الدوكسيسيكلين المروج استجابة 20،21. باستخدام هذا نموذج الفأر تلتف الآثار الجانبية غير المرغوب فيها من أساليب الفيروسية التقليدية من جيل خلية الجذع، أي السكان غير متجانسة مع انطلاق الخلية إلى خلية التغير في عدد وموقع من المواقع دمج إدراج الفيروسية. وأن عبرت سلالتين الماوس المعدلة وراثيا (OKSM، m2rtTA)، المتاحة كحيوانات مؤسس متماثلة اللواقح في مختبر جاكسون، من أجل إنشاء reprograنموذج الفأر mmable (انظر الشكل 2). في هذا المخطوط ونحن تصف بالتفصيل كيفية اشتقاق MEFs، وتوليد خلايا الجذع، وعزل سيطة إعادة برمجة في مراحل مختلفة من عملية التحويل من نظام مراقبة الأصول الميدانية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-0902-82&#160;</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">13-8813&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Streptavidin PE-Cy 7&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25-4317-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-5791-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11360-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11140-050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td dir="LTR" height="25" style="height:25px;width:212px;">Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25200-056&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">GlutaMAX</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">35050-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">21985-023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMSO (Dimethyl Sulfoxide)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">D8418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Propidium Iodide solution (PI)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">P4864-10ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Gelatine from porcine skin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">G1890&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Doxycyclin hyclate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">33429-100MG-R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Leukemia Inhibitory Factor (LIF)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Millipore&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">ESG1107&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11960-044&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Irradiated MEFs&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">S1520-100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">75-cm2 Tissue culture flasks&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">15-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">50-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic vials&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">70 &#181;m Cell strainer&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10342-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface marker mediated purification of ips cell intermediates from a reprogrammable mouse model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

بعد التشريح، تفصيل والطلاء للجنين E13.5 الماوس، ومن المتوقع أن يصل confluency في حوالي 1-2 أيام في صحن 10 سم. في هذه المرحلة، فمن الطبيعي للثقافة لاحتواء بعض القطع الملتصقة من الأنسجة التي لم يتم cellularized صحيح. هذه سوف تختفي بعد الركض. الدوكسيسيكلين على الاستقراء، MEFs إعادة برمجة تغيرات شكلية متميزة. حول يوم 6، يجب بقع تشبه مستعمرة المبكرة تبدأ في الظهور (الشكل 4C). وهذه تستمر في النمو من حيث الحجم على المزيد من ثقافة (انظر الشكل 4D، E). تجربة إعادة برمجة جيدة ينبغي أن يؤدي إلى&gt; 500 المستعمرات في T75 التي كانت المصنفة في البداية مع 5 × 10 5 الخلايا (الشكل 4E). الثقافات الجذع أنشئت تمتلك المميزة قبة على شكل مستعمرات ويجب أن تكون في معظمها خالية من الخلايا المتمايزة (4F الشكل). في بعض الأحيان، الركض إضافية من الجذع cultuقد تكون هناك حاجة الدقة لإزالة خلايا غير متمايزة / برمجتها جزئيا. يمكن تقسيم قارورة متموجة من الخلايا في نسبة 1:10 على طبقة المغذية من MEFs المشع. كما ذكر أعلاه، تنعكس التغييرات المورفولوجية والجزيئية خلال إعادة برمجة بالتغيرات التي تطرأ على ملامح نظام مراقبة الأصول الميدانية لدنك-1.2، SSEA-1، وفي نهاية المطاف Epcam (انظر الشكل 7A-F). كما ذكرت سابقا 12،15، في حين MEFs هم في الغالب إيجابي لدنك 1.2 والسلبية للعلامات أخرى، يوم 3 الثقافات بالفعل تبدو مختلفة بشكل ملحوظ. وقد بدأت نسبة كبيرة من الخلايا لأسفل تنظيم التعبير عن خاصتك 1.2 ومجموعة فرعية صغيرة جدا من هذه الخلايا السلبية خاصتك 1.2 أصبحت إيجابية لSSEA-1، وإعادة برمجة الفعلية المتوسطة لهذه النقطة مرة. عدد سيطة إعادة برمجة التي يمكن استخلاصها من يوم 3 ثقافات لا يمكن التنبؤ بها جدا ونسبة SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- عادة ما تقع في نطاق بين 1-10٪ من viablخلايا البريد. في يوم 6 و 9 نسبة مئوية زيادة الخلايا SSEA-1 +، عادة أعلى بكثير من 10٪، ويمكن الكشف عنها. حول يوم 12 مجموعة فرعية من SSEA-1 خلايا إيجابية يمكن أن يتم الكشف عن تسمية أيضا إيجابية لEpcam. يوم 12 الثقافات، مثل يوم 3 الثقافات، يمثل عنق الزجاجة في تنقية وسيطة، كما أن نسبة SSEA 1.2 + / + Epcam خلايا غير متغير ويقع في حدود 2-4٪ فقط من جميع الخلايا الحية عادة. العدد المتوقع وسيطة إعادة برمجة الواردة في الجدول 1 يخدم فقط كما تقريبي. سوف الحسنة مزارع الخلايا المحفزة النية أنشئت تكون إيجابية بقوة لSSEA-1 وEpcam. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig1highres.jpg" width="500" /> ويتبع أسفل التنظيم الهوية الليفية علامة خاصتك 1.2 بنسبة تصل التنظيم من: الرقم 1. التغييرات السطحية علامة خلال مسار إعادة برمجةيشار SSEA-1. إن الانتقال من مجموعة فرعية من SSEA-1 خلايا إيجابية نحو دولة المحفزة بواسطة اكتساب Epcam حوالي 12 يوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. تمثيل تخطيطي للنموذج الفأر قابل للبرمجة: m2rtTA التعبير تحت السيطرة من موضع Rosa26 نشط بتواجد مطلق في وجود الدوكسيسيكلين (دوكس) البروتين m2rtTA يربط إلى التتراسيكلين المروج التابع (tetOP) في الكولاجين 1A1 (Col1a1) موضع مما أدى إلى التعبير عن أربعة عامل الكاسيت. ترتبط اثنين من أشرطة bicistronic بواسطة موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES). إطارات القراءة المفتوحة لل4 أكتوبر / KLF-4 و سوكس 2 / ج MYC هي فو<html> الحوار الاقتصادي الاستراتيجي من قبل F2A وE2A تسلسل الشق الذاتي، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. الأجنة تشريح: (A) نقل الرحم قرن في صحن 10 سم مليئة 10 مل PBS و (B) مقطعة إلى قطع تحتوي على جنين واحد. (C) باستخدام الملقط الحرة الأجنة من الأنسجة الجنينية إضافية وإزالة الرأس والأطراف، وذيل والأعضاء الداخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ليه / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; تصبح بقع الشكل 4. التغيرات المورفولوجية خلال إعادة برمجة. تشبه مستعمرة اضحة في الثقافات من يوم 6 فصاعدا. وتتميز iPSCs حسن النية من قبل التشكل على شكل القبة. (A) يوم 0 / MEFs، (B) يوم 3، (C) يوم 6، (D) يوم 9، (E) يوم 12، (F) IPS ثقافة الخلية. شريط مقياس: 200 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. FACS الإعداد الأساسي. (A) مع استبعاد الحطام الجانبية مبعثر الأمام مقابل مبعثر منطقة صمة عار. (B)استبعاد المجاميع من غير الحطام التي تبوب على السكان خلية واحدة إلى الأمام مع منطقة مبعثر الأمام مقابل مبعثر عالية وصمة عار. (C) استبعاد الخلايا الميتة من السكان خلية واحدة بواسطة النابضة PI على الأحداث منخفضة مع قناة PI مقابل الأمام مبعثر منطقة صمة عار. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. المحاصرة. (A، B) عن طريق الخلايا السيطرة غير المسماة إنشاء بوابات لدنك 1.2 + /-SSEA 1- الخلايا، وخاصتك-1.2- / SSEA-1- الخلايا وخاصتك-1.2- / SSEA-1 + الخلايا. (C) استخدام الخلايا السيطرة غير المسماة وضع بوابات للEpcam خلايا الإيجابية والسلبية Epcam. (D) SSEA-1 + /-خاصتك 1.2- خلايا يمكن فصلهاإلى Epcam إيجابي وسلبي إلى السكان Epcam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. خاصتك 1.2 مقابل SSEA-1 FACS البقع في مراحل مختلفة من عملية إعادة البرمجة. (A) يوم 0 / MEFs، (B) يوم 3، (C) يوم 6، (D) يوم 9، (E) اليوم 12، زراعة الخلايا (F) الجذع. الجدول المقترح 1. كثافة البذر، وعدد قارورة والنتائج المتوقعة للP1 MEFs من متخالف الجنين لOKSM وm2rtTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر ساعة</a>يحرث لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اليوم </td><td> عدد من قوارير T75 المصنف في اليوم 0 </td><td> إجمالي عدد الخلايا Ssea1 + بعد FACS </td><td> إجمالي عدد Ssea1 + / + Epcam الخلايا بعد FACS </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2000000 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 2000000 </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 2000000 </td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 10 </td><td> 10 ملايين </td><td> 2000000 </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model at JoVE.com

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

ماركر الخلايا السطحية تنقية بوساطة من الجذع الوسطيات خلية من نموذج قابل للبرمجة ماوس

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

cell-surface-marker-mediated-purification-ips-cell-intermediates-from

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Monash University. Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam. 

Video: Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

والتصور والتقدير الكمي للخلايا الوسيطة أديبوجينيك التمايز المحتملة مع علامة نسب المحددة

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

نموذج الفأر من انسداد الأمعاء الجزئي

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...