شكر خاص لنجاي وجايسون كريس ديل ريو لما قدموه من دعم ومساعدة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل من قبل RO1 منحة GM070676 إلى الإشتراكي.

ويمكن شراء سلالات الذباب وتضخيمها في المختبر. اعتمادا على كمية من قوارير ثقافة ذبابة الفاكهة وردت، لا يحتاج المرء إلى كثير من الأحيان &#39;الوجه&#39; في قارورة والثقافة، ومرة واحدة في قارورة وصلت الطاقة الإنتاجية القصوى. والتضخيم يستمر حتى يتم شغل ما يقرب من 50 قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة. واحد يجعل من ثم &quot;يطير الكؤوس&quot; مع 100 الأكواب البطين الثلاثي القرون مل (تطير صنع كوب وتناقش في القسم التالي). بعد 24 ساعة، واستخدام الأجنة من هذه الكؤوس على البذور الجديدة قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة مع الطعام ذبابة اضافته في القاع. في درجة حرارة الغرفة، في الوقت النمو للأجنة ذبابة الفاكهة من أجنة بين عشية وضحاها إلى كامل الذباب نمت هي حوالي 8.5 أيام. الأجنة المصنف تفقس بعد 12-15 ساعة في مرحلة اليرقات الأولى. اليرقات تنمو لمدة 4 أيام طرح الريش مرتين في مرحلة اليرقات الثانية والثالثة، في 24 و 48 ساعة بعد الفقس. اليرقات ثم تغلف في pupariums وتقديمها إلى مسخ 4 ايام حتى تخرج من تيقضايا وريث العذراء 1. السماح لمزيد من النمو لحوالي يومين أو ثلاثة أيام في قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة لزيادة كمية من الذباب في كل منهما. عندما تمتلئ 400 قارورة، وسيكون هناك كمية كافية من الذباب لكؤوس البيض 50 وضع (حوالي 1،000 الذباب الإناث في الكأس). الذباب تحتاج الى وقت للتكيف مع البيئة الجديدة. وعادة ما يستغرق حوالي يومين بالنسبة لهم ليكون جاهزا للجمع، بعد نقله الى الكؤوس. وسوف تحل محل لوحات أجار يومي الحفاظ على كؤوس ذبابة نظيفة، والتي تسمح الذباب على العيش لفترة أطول. (للحصول على مزيد من الفهم رعاية ذبابة الفاكهة والتضخيم، يرجى الرجوع إلى ذبابة الفاكهة DB روبرتس: نهج عملي 2). مصدر جيد للحصول على كميات كبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة هي أقفاص سكان 3، والتي هي متاحة تجاريا. ويمكن رؤية الجمعية وصيانة أقفاص السكان في الفصل 5 و 7 في الكتاب ذبابة الفاكهة السوداء البطن: Practical الأغراض في الخلية والبيولوجيا الجزيئية 4 علم الأحياء. ومع ذلك، أقفاص سكان مكلفة ويصعب الحفاظ عليها. منذ أقفاص السكان يمكن عقد كمية وفيرة من الذباب، واستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون هو ضروري لنقل وتغذية الذباب. كما ذكر من قبل، وغاز ثاني أكسيد الكربون يقلل من الصحة من الذباب، وتسبب لهم عدم وضع كذلك. على نطاق صغير، ويمكن استخدام 100 مل الأكواب البطين الثلاثي القرون. مع الأكواب 50 مل 100، قد يتحقق 9 غرامات من أجنة dechorionated. من أجل إزالة الذباب الميت، غير مستخدمة معجون الخميرة وغيرها من الشوائب التي أنشأناها مزدوج الصيد غربال الطبقات ذات أحجام شبكة مختلفة. واحد الفخاخ غربال المواد غير المرغوب فيها مثل الذباب الميت في الوقت الذي تسمح الأجنة لتمرير من خلال (350 حجم المسام ميكرون). الجزء الثاني يحتوي على شبكة (120 ميكرون حجم المسام)، والذي يهدف الى جذب أجنة ذبابة الفاكهة وغيرها من الشوائب سوف تمر عبر الشبكة. 1. يطير التحضير لكرة القدم ومجموعة جنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قلبالذباب تضخيمها من قوارير متعددة الى قنينة بلاستيكية فارغة، حتى وصلت كمية من الذباب شبر واحد من ارتفاع القارورة ل. ثم، ونقل هؤلاء الذباب الى 100 مل بيضة جمع كوب (تريكون الكأس مع شبكة من النايلون ويندوز). الحفاظ على الاستفادة من كأس على سطح صلب لمنع هروب من الذباب عند نقل الذباب. تغطية كأس مع معجون أجار لوحة تحتوي على خميرة، والسماح 24-48 ساعة من الوقت لتحقيق الاستقرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لوحات أجار بين عشية وضحاها من كؤوس الطاير 50، ويغسل محتويات لوحات لافت غربال باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. لحم الأجنة في غربال مع الكثير من الماء حتى يتم غسلها كل عجينة الخميرة بعيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة تنظيفها عن طريق غمر بها في التبييض 50٪ لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع الماء المقطر على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة مبيض. تجف ثم تتشابك مع الأجنة عن طريق وضعها في أوقات AC منشفة أضعاف عدة. نقل الأجنة إلى قارورة نظيفة وتسجيل الوزن. &lt;/ لى&gt; </ol> 2. التجانس الجنين وتوضيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة dechorionated في الخالط Dounce مع حجم × 1.5 من عازلة استخراج جليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعل 5 السكتات الدماغية مع مدقة فضفاض. قسامة وجناسة في أنابيب الطرد المركزي نظيفة. الطرد المركزي في 15000 جم لمدة 40 دقيقة. في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية جمع السائل واضح طاف دون طبقة الدهون البيضاء العلوي أو السفلي بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لتنظيف أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 50000 جم لمدة 30 دقيقة. في 4 درجات مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام الناتج عالية السرعة طاف جمعها على النحو المبين أعلاه مباشرة أو يمكن أن تكون مفاجئة المجمدة والمخزنة في -80 درجة مئوية لمدة شهور. </li></ol> 3. البلمرة أنيبيب وتجليد كينيسين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في المجمدة عالية السرعة طاف على درجة حرارة الغرفة. إلى تتبلمر ميكروتثبول، إضافة GTP (0.3 ملم) والتاكسول (20 ميكرون)، وتستنهض الهمم بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في1 شاكر الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لربط كينيسين، إضافة 2.5 ملم nonhydrolyzable ATP التناظرية 5&#39;-أدينيليل imidodiphosphate (AMPPNP)، تليها الإثارة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في شاكر الدورية. </li></ol> 4. الترسيب التفاضلية من ميكروتثبول وكينيسين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرواسب من خلال حجم وسادة السكروز المساواة (السكروز 20٪ و 10 ميكرومتر في التاكسول العازلة الاستخراج) عن طريق الطرد المركزي في 23000 ز (sw41ti الدوار، TLS-55) لمدة 30 دقيقة. في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه بواسطة إعادة تعليق في 10٪ من حجم جناسة الأصلي في استخراج العازلة التي تحتوي على 10 ميكرومتر التاكسول و 75 ملي مول كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الترسيب مع آخر وسادة حجم السكروز متساوية كما في الخطوة 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه من يغسل الملح في عازلة استخلاص 5٪ مع 20 ميكرون التاكسول، 75 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO 4، و 10 ملم للاعبي التنس المحترفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرواسب في 120000 ز (sw41ti الدوار: 31000 دورة في الدقيقة، TLS-55: 42،000 دورة في الدقيقة) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع طاف (كينيسين<html> جزء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ عملية الترشيح الطرد المركزي في 14000 جم لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. استعادة عينة المركزة وكرر الترشيح مع فلتر جديد على النحو الوارد أعلاه لمدة 30 دقيقة وجمع عينة المركزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص البروتين لتحديد تركيز. لفترة وجيزة، تركيزات مختلفة من البروتين المعروفة (مصل بقري، BSA) كانت مختلطة مع حجم معروفة من كاشف برادفورد وقياس الكثافة البصرية في طول موجة 595nm. ثم تأسست في كثافة ضوئية مقابل تركيز منحنى معيار لحساب تركيز غير معروف من تنقية كينيسين جزء باستخدام الكثافة البصرية من هذه العينة يقاس تحت ظروف مماثلة كما ان من عينات BSA القياسية. وقد أجريت أيضا الكهربائي للهلام، وكذلك غرب النشاف باستخدام مبلغ معروف من كينيسين المنقى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة جزء كينيسين إلى كميات صغيرة من التركيز المطلوب وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية. </li></ol>ق ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. ممثل النتائج تمت تنقية كامل طول كينيسين وظيفي من أجنة ذبابة الفاكهة. الشكل 1 يصور الجل الملون الفضة تظهر كسور مختلفة خلال تنقية. لين 1 هي عينة من طاف بسرعة عالية بعد توضيح (الخطوة 2.5)، 2 لين هو عينة من بيليه بعد توضيح، لين 3 هو عينة من طاف بعد الترسيب الأولى مع وسادة السكروز (الخطوة 4.1)، لين 4 وعينة من بيليه بعد الترسيب الأولى، لين 5 هو عينة من طاف بعد الترسيب الثاني (خطوة 4.3)، لين 6 هو عينة من بيليه بعد الترسيب الثاني، لين 7 هو عينة من بيليه من والترسيب النهائي (الخطوة 4.5)، لين 8 هو عينة كينيسين تنقيته، لين 9 هو عينة كينيسين تمت تصفيتها، وممر 10 هو علامة. الفرقة تتركز في حارة 8 و 9 في نحو 115 دينار كويتي هو كينيسين الثقيلة سلسلة 1، وهو ما يتسق مع الارقام ..الكشف عن E-1، لين 8 من ورقة ساكستون نشرت في عام 1988 5. الشكل رقم 2 يمثل لطخة غربية (ج) من الكسر كينيسين تنقية باستخدام الأجسام المضادة سلسلة كينيسين الثقيلة. الأجسام المضادة AKINO1-A لا بشكل ملحوظ مع غيرهم من أفراد الأسرة كينيسين 6 عبر رد فعل. لاحظ أنه على الرغم من هذه النتائج في بروتوكول مصدرا جيدا للكينيسين وظيفية، في حين يتم تخصيب الكسر لكينيسين-1، وهناك على الأرجح الملوثات، بما في ذلك kinesins أخرى يحتمل أن تكون والبروتينات السيارات الأخرى. أزلنا مجموعة متنوعة من أصغر الملوثات عن طريق الترشيح. بقدر إزالة المحركات الأخرى التي لا يمكن القيام به من حيث حجم وحده، وتنقية يشبه ما قامت به من قبل الآخرين لدراسة كينيسين 7، ونحن نعتقد أن الغالبية العظمى من السيارات النشط هو كينيسين-1، ولكن تنقية اكثر تطورا تسمح سوف وقد تم إزالة الملوثات محرك المحتملة، مثل كول وآخرون (8) وساكستون وآخرون. 9 </p&gt; تم تقييم processivity من كينيسين من قبل واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب ملزمة، كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في كتاب من قبل Scholey بعنوان &quot;الفحص على الحركة لبروتينات موتور&quot; (10). لفترة وجيزة، تم جلب الخرز البوليسترين مع محرك نشط واحد على اتصال مع أنيبيب، في ظل وجود تشبع (1 ملم) للاعبي التنس المحترفين. المحرك تعلق على أنيبيب، وبدأ بالمشي بعيدا عن مركز في فخ الليزر. في تشريد محددة مسبقا من حبة من مركز فخ (100 نانومتر) وتحول تلقائيا قوة شعاع الليزر خارج، والسماح للسيارات بالسير على طول MT تحت أي حمولة. ويعرض الفيلم يبلغ قطرها 500 نانومتر حبة مع كينيسين واحد يمشي طن متري. طول شاشة الفيديو يناظر 20 ميكرون. الشكل (3) يمثل التوزيع المعياري للأطوال التي تديرها واحدة لكامل طول جزيئات كينيسين ذبابة الفاكهة، المنقى وفقا لبروتوكول المقدمة هنا. وexponentiآل صالح للتوزيع يوفر runlength متوسط ​​كينيسين واحد 1.55 ± 0.1 ميكرون و 1.28 ± 0.12 ميكرون للعينة التي تمت تصفيتها وفلتر على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 فضة هلام ملون من الكسور النقي: تم تشغيل عينات من كل جزء في مادة هلامية بنسبة 10٪. تم تحميل 10 ميكروغرام من البروتين في كل حارة. لين 1 هي عينة من طاف بسرعة عالية بعد توضيح (الخطوة 2.5)، 2 لين هو عينة من بيليه بعد توضيح، لين 3 هو عينة من طاف بعد الترسيب الأولى مع وسادة السكروز (الخطوة 4.1)، لين 4 وعينة من بيليه بعد الترسيب الأولى، لين 5 هو عينة من طاف بعد الترسيب الثاني (خطوة 4.3)، لين 6 هو عينة من بيليه بعد الترسيب الثاني، لين 7 هو عينة من بيليه من والترسيب النهائي (الخطوة 4.5)، لين 8 هو كينيسين المنقىعينة، لين 9 هو كينيسين تصفيته باستخدام 100 دينار قطع Amicon المتطرف مرشح مل 0،5 الطرد المركزي (ميليبور، الولايات المتحدة الأمريكية). الأسهم الزرقاء تدل على البروتينات التي كانت انخفضت كميات والسهم الأحمر يشير إلى تركيز كينيسين نظرا لخطوة الترشيح الطرد المركزي المستخدمة في هذا البروتوكول. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 نشف منقى شركة المملكة القابضة جزء ضد المضادة للكينيسين الأضداد: تعرض منقى كينيسين عينة لهلام إستشراد ونشف (في غشاء النيتروسليلوز) ضد الأجسام المضادة الأولية AKINO1-A (1:1،000 في TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة تليها حضانة في حمار المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1:10،000 في TBST) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام (chemiluminescent) ECL عدة للكشف عن إشارة كينيسين هو مبين أعلاه. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. </strong&gt; Runlength وسرعة واحدة ذبابة الفاكهة كينيسين طول كامل: (أ) و (ب) Runlength وسرعة عينة كينيسين التي تمت تصفيتها. (ج) و (D). Runlength وسرعة عينة كينيسين فلتر الشكل 4. فيديو من الحركة كينيسين. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو</a> .

<ol>
	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

الدماغ البقري هو المادة الأكثر استخداما على نطاق واسع بدءا من 11 إلى تنقية كاملة الطول كينيسين، على الرغم من واستخدمت في الدماغ الفئران وكذلك 12. والعيب الكبير في استخدام الدماغ البقري كمصدر كينيسين هو توافر المواد الطازجة بدءا: المسالخ وعادة ما تكون غير ق?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف أو المواد </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> أجار (حبيبات) </td><td> الصياد </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> سكر العنب (مد الجلوكوز) اللامائى </td><td> الصياد </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> أطباق بتري </td><td> بيكتون </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm ستايل (البوليستر) 20/bag </td></tr><tr><td> ذبابة الفاكهة الثقافة قوارير </td><td> الاتحاد الدولي للدراجات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البطين الثلاثي القرون الكأس </td><td> ECONO مختبر شركة </td><td> B700-100 </td><td> حجم: 100ML، الحجم: 58x72mm </td></tr><tr><td> خميرة </td><td> النجم الاحمر </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> شبكة النايلون </td><td> Genesse العلمية </td><td> 57-102 </td><td> 120 مicron حجم المسام </td></tr><tr><td> شبكة النايلون </td><td> أجزاء صغيرة </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب </td><td> سيغما </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب </td><td> سيغما </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> سيغما </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (اللامائى) </td><td> الصياد </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> سيغما </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotأونين </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> تامى </td><td> سيغما </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> سيغما </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> التاكسول </td><td> سيغما </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP التناظرية 5&#39;-أدينيليل imidodiphosphate </td><td> سيغما </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> مالينكرودت </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> سيغما </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon مرشحات الترا الطرد المركزي: 0.5 مل، 100kD قطع (8)، حزمة </td><td> ميليبور </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

البروتينات محرك نقل الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة، ونقلهم إلى مواقع فرعية الخلوية محددة. ولأن يقترح نقل تغييرها لتشكل أساس مجموعة متنوعة من أمراض الاعصاب، فهم نقل أنيبيب محرك أساس ولائحته من المرجح أن يؤدي في نهاية المطاف إلى تحسين الطرق العلاجية. كينيسين-1 هو بروتين محرك حقيقية النواة التي تتحرك في اتجاه تقدمي (زائد النهاية) على طول الأنابيب الدقيقة (MTS)، والمدعوم من التحلل المائي للاعبي التنس المحترفين. نحن هنا نورد بروتوكول تنقية مفصل لعزل نشط كينيسين طول كامل من أجنة ذبابة الفاكهة، مما يسمح للمزيج من الوراثة ذبابة الفاكهة مع دراسات البيوفيزيائية واحدة جزيء. بداية مع ما يقرب من 50 أكواب زرع، مع ما يقرب من 1000 من الإناث في الكأس، وأجرينا مجموعات بين عشية وضحاها. قدمت هذا ما يقرب من 10 مل من أجنة معبأة. وكانت الأجنة تبييض dechorionated (استسلام حوالي 9 غرامات من الأجنة)، وبعد ذلك المتجانس. AFثالثا انقطاع، وأوضح أن جناسة باستخدام تدور بسرعة منخفضة تليها الطرد المركزي عالية السرعة. تمت معالجة طاف مع توضيح GTP والتاكسول إلى تتبلمر MTS. وثبتوا على النظام التجاري المتعدد الأطراف كينيسين بلمرة بإضافة التناظرية للاعبي التنس المحترفين، 5&#39;-أدينيليل imidodiphosphate في درجة حرارة الغرفة. بعد ملزم كينيسين، وsedimented ميكروتثبول عن طريق الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال وسادة السكروز. وكان بيليه أنيبيب ثم إعادة وقف التنفيذ، وتكررت هذه العملية. أخيرا، تمت إضافة للاعبي التنس المحترفين للافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف. ارتفاع سرعة الطرد المركزي نسج ثم تراجع النظام التجاري المتعدد الأطراف، وترك كينيسين في طاف. وقد تعرض هذا كينيسين لترشيح الطرد المركزي باستخدام قطع 100 دينار كويتي من مرشح لمزيد من تنقية، aliquoted، المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تنفيذ SDS هلام الكهربائي والغربية النشاف باستخدام عينة تنقيته. والنشاط الحركي للعينات تنقيته قبل وبعد خطوة الترشيح الطرد المركزي النهائيتم تقييم استخدام واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب. وأظهرت الكسور كينيسين قبل وبعد الترشيح الطرد المركزي processivity كما ذكرت سابقا في الأدب. تجارب أخرى تجرى حاليا لتقييم التفاعل بين كينيسين وبروتينات النقل الأخرى ذات الصلة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos at JoVE.com

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل المجمعات كينيسين-طن متري، ومن ثم الافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق إضافة للاعبي التنس المحترفين.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K Views.  University of California, Irvine. هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من ذبابة الفاكهة الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل ا...

Video: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...